Актуальность и востребованность темы диссертации. В последнее время в мире увеличивается количество исследований, в которых показано, что метаболиты клетки могут участвовать в аутокринной и паракринной межклеточной сигнализации в качестве первичных мессенджеров. Особая роль при этом была установлена для АТФ и глутаминовой кислоты. Известно, что все живые клетки используют АТФ в качестве источника энергии в различных биологических процессах. В ответ на физиологические стимулы, такие как нервная стимуляция, механический, осмотический и ишемический стресс, небольшие количества АТФ выбрасываются во внеклеточную среду. На поверхности практически всех типов клеток имеются пуринергические Р2 рецепторы, которые специфически связывают вышедший из клеток АТФ и передают сигнал внутрь клетки. Глутаминовая кислота также является не только внутриклеточным метаболитом, но и может выбрасываться во внеклеточную среду принимая участие в процессах передачи сигнала между клетками через глутаматергические ионотропные и метаботропные рецепторы. Пуринергическая и глутаматергическая сигнализация играют важную роль в различных физиологических и патофизиологических процессах, протекающих в почках, в сердце и в клетках мозга.
В настоящее время в мировых исследовательских центрах изучаются метаболиты в цитоплазме живой клетки и первичные мессенджеры. Один из них - это молекула глутатиона. Глутатион (GSH) - это трипептидный низкомолекулярный антиоксидант (гамма-глутамилцистеилглицин), который является основным свободным тиолом, присутствующим в цитоплазме всех живых клеток. Он участвует во многих биологических процессах: обеспечивает восстановление ксенобиотиков, инактивирует гидропероксидазу и участвует в поддержании восстановленного состояния сульфигидрильных групп цитозольных белков.
В настоящее время в нашей стране создание эффективных методы внедрения научных и инновационных достижений в практику. На основе программных мер, осуществлённых в данных направлениях, были разработаны методы определения размеров нанопор и ионных каналов. В Стратегии действии и развития Узбекистана подчеркивается стимулирование научно-исследовательской и инновационной деятельности, создание эффективных механизмов внедрения научных и инновационных достижений в практику. Поэтому изучение функции внеклеточного глутатиона и пути его выхода из лимфоидных клеток имеет важное научно-практическое значение.
Данное диссертационное исследование в определенной степени служит выполнению задач, предусмотренных в Постановлении Президента Республики Узбекистан от 28 ноября 2011г № ПП-1652 «О мерах по дальнейшему углублению реформирования системы здравоохранения», Указе Президента Республики Узбекистан от 7 февраля 2017 г № УП-4947 «О стратегии действий по дальнейшему развитию Республики Узбекистан», а также в других нормативно-правовых документах, принятых в данной сфере.
Целью исследования является характеристика процесса выхода глутатиона из клеток в норме и в условиях гипоосмотического стресса, а также выяснение роли ионных каналов и транспортеров в этом процессе.
Научная новизна диссертационного исследования состоит в следующем:
охарактеризован выход значительных количеств глутатиона из цитозоля тимоцитов в нормальной изотонической среде и в условиях гипоосмотического стресса, дано подробное описание этого процесса, определена энергия активации осмореактивного выхода глутатиона;
доказана ведущая роль объем-зависимого анионного канала в выходе глутатиона из тимоцитов, а также заметное участие транспортеров SLCO/OATP и SLC22A/OAT;
определена влияние внутриклеточного цАМФ на выход глутатиона из клеток при гипоосмотическом стрессе;
доказано наличие осмо-чувствительного транспорта глутатиона в других типах клеток (эритроциты, меланома), а также влияние внеклеточного глутатиона на физиологические функции клеток.
Выводы
1. В показан массовый выброс глутатиона из тимоцитов и дано детальное описание этого процесса. Установлено, что скорость выхода глутатиона в расчете на одну клетку составляет 0,34х10-15 г/мин в нормальной среде и 1,96х10"15 г/мин при гипоосмотическом стрессе. Полумаксимальный выход глутатиона наблюдается при осмотическом давлении среды, равном 125.1±4.3 мОсм/кг Н2О.
2. Энергия активации выхода глутатиона в температурном диапазоне 15-37°С составляет 11.14=1.8 ккал/моль в нормотонической среде и 5.4±0.6 ккал/моль в условиях гипоосмотического стресса. Две величины энергии активации и двухфазная кинетика выхода глутатиона свидетельствуют о наличии, по меньшей мере, двух механизмов выхода глутатиона.
3. При гипоосмотическом стрессе основная часть глутатиона выходит через объём-зависимый анионный канал, а остальная часть переносится с участием мембранных транспортеров SLCO/OATP и SLC22A/OAT, но не ABCC/MRP. Макси-анионный канал в этом процессе не участвует.
4. Активация аденилатциклазной системы приводит к подавлению процесса выхода глутатиона из тимоцитов.
5. Аналогично тимоцитам, механизм выброса глутатиона присутствует также и в эритроцитах человека и раковых клетках меланомы мыши. Установлено, что скорость выброса глутатиона из эритроцитов примерно в 4 раза медленнее, чем из тимоцитов в нормальной среде и в 10 раз медленнее в условиях гипоосмотического стресса.
6. Показано, что внеклеточный глутатион в микромолярных концентрациях существенно подавляет регуляцию объема тимоцитов, но не оказывает влияния на коллоидно-осмотический лизис эритроцитов.
7. Предложена новая гипотеза функции глутатиона в качестве сигнальной молекулы в процессах межклеточной сигнализации.
