Effect of nanoparticles lovastatin osteoregeneration for optimization in the bone defect in rats

Биология ва тиббиёт муаммолари, 2016, №3 (89) 149

УДК: 616.71-007-085.27]-092.9

ЭФФЕКТ ПРИМЕНЕНИЯ НАНОЧАСТИЦ

ЛОВАСТАТИНА ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ

ОСТЕОРЕГЕНЕРАЦИИ В УСЛОВИЯХ КОСТНОГО ДЕФЕКТА У КРЫС

Я.В. ПАНАСЮК, М.М. КОРДА

Тернопольский Государственный медицинский университет им. И.Я. Горбачевского,

Украина, г. Тернополь

КАЛАМУШЛАР СУЯК НУҚСОНИ ШАРОИТИДА ОСТЕОРЕГЕНЕРАЦИЯНИ

ТАКОМИЛЛАШТИРИШ УЧУН ЛОВАСТАТИН ЯНГИ ҚИСМЛАРИНИ ҚЎЛЛАШ

АФЗАЛЛИГИ

Я.В. ПАНАСЮК, М.М. КОРДА

И.Я. Горбачевский номидаги Тернополь Давлат медицина университети, Украина, Тернополь

EFFECT OF NANOPARTICLES LOVASTATIN OSTEOREGENERATION FOR OPTIMIZATION

IN THE BONE DEFECT IN RATS

Ya.V. PANASYUK, M.M. KORDA

Ternopil State Medical University named after I.Ya. Gorbachevsky, Ukraine, Ternopol

Тадқиқот ишида каламушлар травматик суяк нуқсонида ловасттин янги қисмларини

трансдермал киритилгандан сўнг остеорегенерациянинг биохимик кўрсаткичлар натижаси

келтирилган. Ишқорий ва кислотали фосфатаза активлиги, минерализация индекси, қон зардобининг

колагенолитик фаоллиги ва гликозамингликанлар бўлиши каби бириктирувчи тўқиманинг биохимик

маркерлари одатдаги шаклда ловастатинни қўллаш заминида суяк травмасида назорат гуруҳига

нисбатан етарли ўзгаришлар билан характерланди. Ловастатин янги қисмлари билан травматик

нуқсонни даволашда бириктирувчи тўқима алмашинув кўрсаткичлари натижалари кўринарли бўлди,

бу остеорегенерацияни такомиллаштириш учун бундай шаклдаги дори воситасини қўллаш

мумкинлигидан дарак берди.

Калит сўзлар:

янги қисмлар, ловастатин, остеорегенерация.

The results of biochemical parameters of osteoregeneration in rats with traumatic bone defect in the

lovastatin nanoparticles transdermal administration have been shown in this study. Biochemical markers of

connective tissue, such as alkaline and acid phosphatases activity, index of mineralization, collagenolytic

activity of plasma and the content of glycosaminoglycans, in rats with bone trauma treated with lovastatin in

regular form were not changed significantly compared to the control. Indicators of connective tissue metabo-

lism markedly improved in rats with traumatic defect treated with lovastatin incorporated into nanoparticles.

Our results predict the possibility of the using of lovastatin nanoparticles for the optimization of osteoregen-

eration.

Keywords:

nanoparticles, lovastatin, osteoregeneration.

Введение.

В современной медицинской

практике для регулирования остеорегенерации

преимущественно

применяют

ингибиторы

остеорезорбции [2, 4], стабилизирующие кост-

ную массу путем подавления активности осте-

областов. Наиболее изученными из них являют-

ся бисфосфонаты, кальцитонин, эстрогены, ви-

тамин Д с аналогами, иприфлавон [1, 2, 10]. Од-

нако, способность вышеперечисленных препара-

тов увеличивать костную массу является отно-

сительно небольшой, и не превышает 2% в год

[3, 4]. Поэтому, актуальным является поиск но-

вых препаратов, способных стимулировать

остеорегенерацию при помощи других механиз-

мов. Доказан факт важной роли молекулярных

факторов роста в процессе остеорегенерации, в

частности костных морфогенетических белков

(bone morphogenetic proteins) [6, 7, 8, 10]. Кост-

ные морфогенетические белки (КМБ) имеют вы-

раженное специфическое остеоиндуктивное дей-

ствие. Среди всех изоферментов наибольшую

активность в плане стимуляции остеогенеза име-

ет КМБ-2 [6, 7]. Поэтому, альтернативным путем

в стимуляции репаративного остеогенеза и уве-

личении костной массы является поиск фарма-

кологических стимуляторов КМБ-2. Такими

стимуляторами, вызывающими повышенную

экспрессию КМБ-2 in vivo и in vitro, являются

статины [6, 8, 15], хотя результаты отдельных

сообщений ставят под сомнение эффективность

последних относительно костного метаболизма

[6, 7, 8].

Материалы и методы исследования:

В

эксперименте использовали 168 белых половоз-

релых крыс-самцов, разделенных на 4 группы: I -

интактные животные, n=8; II - животные с кост-

ным дефектом без лечения (контрольная груп-

па), n=32; III - животные с костным дефектом,

получавшие ловастатин (ЛВ) в обычной форме в

разных дозах (0,1, 1,0 и 5, 0 мг/кг), n=96; IV -

Эффект применения наночастиц ловастатина для оптимизации остеорегенерации в условиях…

150 Проблемы биологии и медицины, 2016, №3 (89)

животные, леченные наночастицами ловастатина

(НЛВ) в дозе 100 нг/кг, n=32.

Группам животных, которым проводилось

лечение, ловастатин вводили ежедневно транс-

дермально в зоне созданного костного дефекта.

Модель посттравматического костного дефекта

создавали с помощью стоматологического бора

диаметром 2,0 мм в проксимальном отделе

большеберцовой кости. Всем животным со ске-

летной травмой в течение первых трех дней вво-

дили внутримышечно обезболивающие (аналь-

гин в дозе 5 мг/кг) и антибактериальные препа-

раты (цефтриаксон в дозе 10 мг/кг) для профи-

лактики гнойно-септических осложнений.

Полимерные хитозановые наночастицы с

ловастатином готовили путем ионного «сшива-

ния» хитозана с триполифосфатом натрия (TPP).

Раствор хитозана (0,2%) готовили на 1% раство-

ре уксусной кислоты и инкубировали с исследу-

емым препаратом в течение 30 мин при комнат-

ной температуре. До 25 мл инкубационной сме-

си по каплям добавляли 10 мл 0,1% водного рас-

твора TPP. Смесь постоянно перемешивали с

помощью магнитной мешалки (700 об./мин).

Полученные наночастицы осаждали центрифу-

гированием (28000 об./мин.) в течение 30 мин.

Забой животных проводили путем декапи-

тации под тиопенталовым наркозом на 3-й, 7-й,

14-й и 28-й день. В сыворотке крови определяли

уровень Са и Р с помощью стандартных наборов,

активность кислой (КФ) и щелочной (ЩФ) фос-

фатаз [11], индекс минерализации (ЛФ/КФ), ко-

лагенолитическую активность (КАП) и содержа-

ние гликозамингликанов (ГАГ) [14]. Статисти-

ческий анализ результатов проведен в отделе

системных статистических исследований Терно-

польского государственного медицинского уни-

верситета имени И. Я. Горбачевского с помощью

программы STATISTICA-10 (StatSoft) с исполь-

зованием критерия Манна-Уитни.

Результаты и обсуждение.

По характеру

протекания биологических процессов при пост-

травматической регенерации костной ткани

можно выделить три основные стадии: повре-

ждения, восстановления и ремоделирования ко-

сти [10]. На стадии повреждения течение каскада

биохимических процессов происходит по типу

асептического воспаления. Происходит некроз и

ишемия травмированных тканей, аутолиз по-

врежденных клеток костной ткани и формирует-

ся гематома. Пик активности катаболических

процессов наблюдается на 2-3-й день.

В нашем эксперименте через трое суток

после нанесенного повреждения полученные

данные биохимических показателей соответ-

ствовали первой стадии восстановления костной

ткани. В частности, у всех животных, которым

создавали травматический костный дефект, по

сравнению с интактными, отмечали статистиче-

ски достоверное повышение концентрации Са и

Р в сыворотке крови. Стоит отметить, что досто-

верной разницы между контрольной группой и

животными, которые получали ловастатин, не

было (рис. 1, 2). На 3-и сутки подобную динами-

ку изменения биохимических показателей

наблюдали для щелочной и кислой фосфатаз - по

сравнению с интактными животными отмеча-

лось достоверное повышение активности обоих

ферментов в сыворотке крови крыс контрольной

группы, а ловастатин не способствовал досто-

верному изменению показателей ЛФ и КФ по

сравнению с животными контрольной группы

(рис. 3, 4).

Рис. 1.

Динамика уровня Са у животных с посттравматической остеорегенерацией при введении ловастатина и

наночастиц ловастатина.

Примечание: здесь и на следующих рисунках:

◦ - изменения достоверны относительно показателей интактных крыс;

* - изменения достоверны относительно животных контрольной группы;

□ - изменения достоверны относительно животных, получавших ЛВ в дозе 0,1 мг / кг;

■ - изменения достоверны относительно животных, получавших ЛВ в дозе 1,0 мг / кг;

¨ - изменения достоверны относительно животных, получавших ЛВ в дозе 5,0 мг / кг.

Я.В. Панасюк, М.М. Корда

Биология ва тиббиёт муаммолари, 2016, №

3 (89) 151

Рис. 2.

Динамика уровня Р у животных с посттравматической остеорегенерацией при введении лова-

статина и наночастиц ловастатина.

Рис. 3.

Динамика активности ЛФ в сыворотке крови крыс с костным дефектом, которым вводили ло-

вастатин в различных дозах и наночастицы ловастатина.

Рис. 4.

Динамика активности КФ в сыворотке крови крыс с костным дефектом, которым вводили ло-

вастатин в различных дозах и наночастицы ловастатина.

Полученные нами данные показателей

уровня Са и Р и активности ЛФ и КФ на третий

день можно объяснить развитием деструктивных

изменений, протеолизом некротической ткани,

что в свою очередь сопутствует повышению по-

ступления микроэлементов и ферментов в кро-

вяное русло.

Изменение показателей активности

ЛФ и КФ отразилось на динамике индекса мине-

рализации. Если у интактных животных этот по-

казатель составил 6,63 ± 0,37, то в контрольной

группе

-

5,66 ± 0,52, что на 14,6% меньше. У жи-

вотных, получавших ловастатин трансдермально

в дозе 0,1, 1,0 и 5,0 мг/кг индекс минерализации

составил соответственно 5,55 ± 0,37 (

-16,3%),

5,52 ± 0,17 (

-16,

7%) и 5,67 ± 0,49 (

-

14,5%). В

группе животных, получавших наночастицы ло-

вастатина, индекс минерализации был на 19,9%

меньше по сравнению с интактными животными

(рис. 5). Динамику изменения показателей ин-

декса минерализации можно обосновать преоб-

ладанием катаболических процессов на данном

этапе восстановления костного дефекта.

Эффект применения наночастиц ловастатина для оптимизации остеорегенерации в условиях…

152

Проблемы биологии и медицины,

2016

, №

3 (89)

Рис. 5.

Показатели индекса минерализации у животных с костным дефектом на фоне лечения лова-

статином в различных дозах и наночастицами ловастатина.

Создание травматического костного де-

фекта также сопровождалось изменением со-

держания гликозамингликанов в сыворотке кро-

ви. В частности, уровень ГАГ в интактных жи-

вотных составил 57,05 ± 2,56 мкмоль/л, тогда

как в группе контрольных животных этот пока-

затель вырос на 130,8% (Р≤0,01). Такой рост

данного показателя характеризует ухудшение

костного метаболизма, спровоцированное харак-

тером травмы. У животных, получавших лова-

статин в дозе 0,1, 1,0 и 5,0 мг/кг также отмеча-

лось повышение ГАГ по сравнению с интактны-

ми животными на 116,5%, 89,1% и 126,1% соот-

ветственно (во всех трех группах Р≤0,01), а у

животных получавших ловастатин в виде нано-

частиц данный показатель составлял 104,9 ± 5,91

мкмоль/л и статистически отличался по сравне-

нию с контрольной группой (Р≤0,01).

Рис. 6.

Показатели содержания гликозаминогликанов у животных с костным дефектом на фоне лече-

ния ловастатином в различных дозах и наночастицами ловастатина.

Рис. 7.

Динамика колагенолитической активности плазмы крови у животных с костным дефектом на

фоне лечения ловастатином в различных дозах и наночастицами ловастатина.

Я.В. Панасюк, М.М. Корда

Биология ва тиббиёт муаммолари, 2016, №3 (89) 153

На 3-и сутки также отмечали статистиче-

ски достоверный рост колагенолитической ак-

тивности плазмы крови по сравнению с интакт-

ными животными, что подтверждает протекание

асептического воспалительного процесса в зоне

костного дефекта. В интактных животных этот

показатель зафиксирован на уровне 7,76 ± 0,33.

КАП крови резко возрастала в контрольной

группе (на 58,1%), у животных получавших ло-

вастатин в дозе 0,1 мг/кг (на 52,4%), в дозе 1,0

мг/кг (на 69,3%), в дозе 5 0 мг/кг (на 37,6%).

Наименьший рост КАП крови (на 31,9%) отме-

чен в группе животных, получавших наночасти-

цы ловастатина.

На седьмой день эксперимента наблюдали

нормализацию всех биохимических маркеров

регенерации костной ткани по сравнению с тре-

тьим днем. Применение наночастиц ловастатина

не способствовало статистически достоверной

разнице показателей остеорегенерации и остео-

резорбции по сравнению с животными кон-

трольной группы (рис. 1-7) Полученные резуль-

таты указывают на уменьшение воспалительных

и деструктивных процессов в травмированных

животных на седьмой день.

На четырнадцатые сутки отмечали после-

дующую нормализацию показателей Са и Р в

сыворотке крови во всех исследуемых группах.

У животных, которым вводили ловастатин ста-

тистически достоверной разницы между группа-

ми не выявлено (рис. 1-2). Показатели активно-

сти щелочной фосфатазы на четырнадцатый

день также уменьшались в контрольной группе,

и в группе животных, получавших ловастатин в

дозе 0,1 и 1,0 мг/кг. Их величины приближались

к показателям интактных животных и статисти-

чески с ними не отличались (табл. 1-2). В то же

воемя активность щелочной фосфатазы в группе

животных, получавших ловастатин в дозе 5

мг/кг и в виде наночастиц оставалась достаточно

высокой - 3427,4 ± 143,4 мккат/л (на 117%

больше контрольной группы, Р≤0,01) и

3704,6±129,9 мккат/л (на 126,7% больше кон-

трольной группы, Р≤0,01). Если учесть, что на

данном сроке исследования наиболее активно

проходит пролиферация костной ткани именно

за счет остеобластов, содержащих в большом

количестве ЛФ, то можно утверждать, что ин-

тенсивность течения остеорепаративных процес-

сов в этих двух группах на данном этапе выше.

Активность КФ на четырнадцатый день

значительно снизилась. Так, в контрольной

группе данный показатель составил 496,6±30,3

мккат/л. Близкими были показатели активности

КФ у животных, которым вводили ловастатин в

дозе 0,1 мг/кг (504,0±38,5мккат/л) и 1,0 мг/кг

(487,4 ± 30,5 мккат/л), в этом случае данные по-

казатели статистически не отличались от кон-

трольной группы. Полученные величины могут

свидетельствовать о завершении остеорезорб-

тивних явлений в исследуемых группах. По

сравнению с контрольной группой более суще-

ственным оказалось уменьшение активности КФ

у животных, которым вводили ловастатин в дозе

5,0 мг (420,6±34,2 мккат/л, что на 15,3% меньше

по сравнению с контролем, р≤ 0,05) и в группе

животных, леченных наночастицами ловастати-

на (408,9 мккат/л, что на 17,6% меньше по срав-

нению с контролем, р≤0,05). По данным уровней

активности КФ можно говорить о менее интен-

сивной остеорезорбции на четырнадцатый день

у крыс, получавших наноловастатин и ловаста-

тин в дозе 5,0 мг/кг.

Индекс минерализации по сравнению с

контролем достоверно вырос в группе живот-

ных, леченных ловастатином в дозе 5,0 мг/кг (+

42,7%, р ≤ 0,05) и наночастицами ловастатина (+

55,8%, р ≤ 0,05). Вероятно, такая динамика ИМ

свидетельствует о более интенсивной остеореге-

нерации в данных животных.

Биохимические показатели ГАГ и КАП

крови на четырнадцатый день у животных III-й и

IV-й групп статистически не отличались от кон-

трольной группы и от интактных животных, что

свидетельствует о значительном угасании воспа-

лительных процессов у экспериментальных жи-

вотных на этой стадии исследования.

На 28-е сутки полученные данные харак-

теризовались нормализацией практически всех

биохимических маркеров остеоерегенерации,

что может свидетельствовать о завершении про-

лиферативных явлений. Отмечали только досто-

верное увеличение показателя ИМ в группе жи-

вотных, получавших ловастатин в дозе 5 мг/кг, и

животных, получавших наночастицы ловастати-

на. Вероятно, данные изменения обусловлены

интенсивной рекальцификацией костной мозоли

в этот период исследования.

Выводы.

1. Трансдермальное введение

ловастатина в дозах 0,1, 1,0 и 5,0 мг/кг суще-

ственно не способствует стимуляции остеореге-

нерации в посттравматическом периоде. 2. Вве-

дение наночастиц ловастатина способствует до-

стоверным изменениям показателей активности

кислой и щелочной фосфатазы, индекса минера-

лизации на 14-й и 28-й день после травмы, что

свидетельствует о положительной динамике

стимуляции остеорегенерации. 3. Использование

ловастатина, заключенного в хитозановые нано-

частицы, может быть перспективным методом

восстановления травматического костного де-

фекта.

Эффект применения наночастиц ловастатина для оптимизации остеорегенерации в условиях…

154 Проблемы биологии и медицины, 2016, №3 (89)

Литература:

1.

Balasundaram

G.

Nanotechnology

and

biomaterials for orthopedic medical applications.

Review / G. Balasundaram, T. J. Webster //

Nanomedicine.- 2006. - Vol. 2. - P. 169-76.

2.

Effects of osteoporosis and nutrition supplements

on structures and nanomechanical properties of bone

tissue / [Chang Y. T., Chen C. M., Tu M. Y. et all.]

// Mech. Behav. Biomed. Mater. — 2011. — Vol.

7. - P.1412-20.

3.

No Y. J. Nanomaterials: the next step in

injectable bone cements / Y. J. No, S. I. Roohani-

Esfahani, H. Zreiqat // Nanomedicine. - 2014. –

Vol. 11. - P. 1745-64.

4.

Perspectives on the role of nanotechnology in

bone tissue engineering / [Saiz E., Zimmermann E.

A., Lee J.S. et all.]. Dent Mater. - 2013. P. 103-15.

5.

Pleshko N. Nanotechnology in orthopaedics /

Pleshko N., Grande D. A., Myers K. R. // J. Am

Acad. Orthop. Surg. - 2012. - P. 60-62.

6.

Reconstruction of alveolar bone defects using

bone morphogenetic protein 2 mediated rabbit

dental pulp stem cells seeded on nano-

hydroxyapatite/collagen/poly(L-lactide) / [Liu HC,

E LL, Wang DS et all.]. – Tissue Eng Part A. —

2011. - P. 2417-33.

7.

Sampath Т.К., Maliakal G.C., Hauschka P.V.

Recombinant human osteogenic protein-1 (rhOP-1)

induces new bone formation in vivo with a specific

activity comparable with natural bovine osteogenic

protein and stimulates osteoblast proliferation and

differentiation in vitro //J. Biol. Chem. - 1992. - P.

20352-20362.

8.

Serum bone formation marker correlation with

improved osseointegration in osteoporotic rats

treated with simvastatin / [Du Z, Chen J, Yan F et

all.]. – Clin. Oral. Implants Res. - 2013. – Vol. 24-

A. - P. 422-427. 2013 Apr;24(4). – 422-7 p.

9.

Streicher R. M. Nanosurfaces and nanostructures

for artificial orthopedic implants. Review / Streicher

RM, Schmidt M, Fiorito S. – Nanomedicine. —

2007. - P. 861-874.

10.

Xu X. Bone morphogenetic protein-2-

encapsulated

grafted-poly-lactic

acid-

polycaprolactone nanoparticles promote bone repair

/ [Xu X, Yang J, Ding L, Li J.]. – Cell

BiochemBiophys. - 2015. – Vol. 71. - P. 212-225

11.

Левицкий А.П. Экспериментальные мето-

ды исследования стимуляторов остеогенеза:

Метод. рекомендации / А. П. Левицкий, А.

Макаренко, А. В. Деньгаи др. - М.: ГФЦ, 2005.

- 30 с.

12.

Панасюк Я. В. Біохімічна характеристика по-

сттравматичного репаративного остеогенезу при

застосуванні наноаквахелатів металів / Я. В.

Панасюк, М. М. Корда. – Літопис травматології

та ортопедії. – №1-2, 2014. – С.62-65.

13.

Панасюк Я. В. Вплив ловастатину на регене-

рацію кісткової тканини у щурів / Я. В. Панасюк,

М. М. Корда. – Медична хімія. - 2014. - Т. 16, №

3. - С. 123.

14.

Шараев П. Н., Пишков В. Н., Зворыгина Н.Г.,

Шинкарева Л.Ф., напольских В. М., Роготнев

А.Н., Ибатов А.Д. Определение коллагенолити-

ческой активности плазмы крови // Лаб. Дело. -

1987. - № 1. - С. 60-62.

15.

Шварц Г.Я. Статины и формирование кости //

Остеопороз и остеопатии. 2003. No 3. С. 17–20.

ЭФФЕКТ ПРИМЕНЕНИЯ НАНОЧАСТИЦ

ЛОВАСТАТИНА ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ

ОСТЕОРЕГЕНЕРАЦИИ В УСЛОВИЯХ

КОСТНОГО ДЕФЕКТА У КРЫС

Я.В. ПАНАСЮК, М.М. КОРДА

Тернопольский Государственный медицинский

университет им. И.Я. Горбачевского,

Украина, г. Тернополь

В работе приведены результаты исследо-

вания биохимических показателей остеорегене-

рации у крыс при травматическом костном де-

фекте на фоне трансдермального введения нано-

частиц ловастатина. Биохимические маркеры

соединительной ткани, такие как активность ще-

лочной и кислой фосфатаз, индекс минерализа-

ции, колагенолитическая активность плазмы

крови и содержание гликозамингликанов, при

костной травме на фоне использования ловаста-

тина в обычной форме характеризовались недо-

стоверными изменениями относительно кон-

троля. Более информативными были результаты

показателей обмена соединительной ткани при

лечении травматического дефекта наночастица-

ми ловастатина, что свидетельствовало о воз-

можности использования такой формы препара-

та для оптимизации остеорегенерации.

Ключевые слова:

наночастицы, лова-

статин, остеорегенерация.