128
ПРОБЛЕМЫ
БИОЛОГИИ
И
МЕДИЦИНЫ
3 (66) 2011
Хаджибаев
А
.
М
.,
Касымова
К
.
Р
.
НОВЫЕ
ВОЗМОЖНОСТИ
ФОТОБИОЛОГИИ
В
ВОЗДЕЙСТВИИ
НА
НОЗОКОМИАЛЬНУЮ
ИНФЕКЦИЮ
Республиканский
Научный
Центр
Экстренной
медицинской
помощи
РУз
.
Рост
антибиотикорезистентной
нозокомиальной
инфекции
(
НКИ
) —
одна
из
наиболее
серь
-
езных
проблем
современной
медицины
.
От
25
до
30%
всех
госпитализированных
больных
имеют
риск
гнойно
-
септических
осложнений
,
связанных
с
НКИ
[3, 4, 5].
Возрастает
актуаль
-
ность
поиска
альтернативных
методов
инактивации
болезнетворных
микроорганизмов
[7].
Антимикробная
фото
динамическая
терапия
(
ФДТ
)
в
последнее
время
привлекает
присталь
-
ное
внимание
исследователей
различного
профиля
вследствие
ее
высокой
эффективности
.
Она
характеризуется
широким
спектром
антимикробного
действия
и
,
в
отличие
от
антибиотиков
,
практически
полным
отсутствием
побочных
эффектов
и
неспособностью
микроорганизмов
вы
-
рабатывать
устойчивость
к
данному
фактору
[9,13].
В
основе
метода
ФДТ
лежит
введение
в
организм
химических
препаратов
–
фото
–
сенси
–
билизаторов
(
ФС
),
которые
обладают
повышенной
тропностью
к
клеткам
мишеням
(
раковые
клетки
,
воспалительные
ткани
,
микробы
и
вирусы
) [8].
При
воздействии
светом
определенной
длины
волны
и
энергии
,
ФС
начинают
вырабатывать
атомарный
(
синглетный
)
кислород
,
а
так
-
же
генерацию
других
активных
форм
кислорода
(
АФК
),
которые
вызывают
окислительное
по
-
вреждение
различных
молекул
(
белков
,
ненасыщенных
жирных
кислот
,
нуклеиновых
кислот
)
и
клеточных
структур
(
мембран
,
ферментных
систем
,
генетического
аппарата
и
др
.),
что
влечет
инактивацию
патогенов
[10].
Метиленовый
синий
(
МС
)
из
группы
фенотиазинов
известен
как
ФС
применяемый
для
ан
-
тимикробной
ФДТ
,
не
обладающий
токсичностью
и
относительно
инертный
к
живым
организ
-
мам
[11, 12].
МС
-
окислительно
-
восстановительный
индикатор
.
Механизмы
антимикробного
эффекта
сенсибилизированной
МС
фототерапии
находятся
в
стадии
исследования
.
Некоторые
авторы
связывают
их
с
тем
,
что
внутриклеточное
воздействие
света
реализуется
через
химиче
-
ские
(
фотоокисление
,
фотовосстановление
,
фотодиссоциация
и
др
.)
и
физические
процессы
превращения
энергии
[6].
Одним
из
механизмов
может
быть
прямой
фотохимический
процесс
,
связанный
с
активным
поглощением
света
молекулярным
кислородом
на
длинах
волн
638
и
762
нм
[2]
и
усилением
свободнорадикальных
процессов
[1].
Целью
настоящего
исследования
явилось
изучение
влияния
фотодинамического
воздействия
с
метиленовой
синью
на
госпитальные
штаммы
Klebsi
е
lla
р
n
е
umona.
Материалы
и
методы
исследования
.
Были
исследованы
госпитальные
штаммы
К
lebsiela
Р
.,
выделенных
из
дыхательных
путей
пациентов
находившихся
в
отделениях
реанимации
РНЦЭМП
.
Для
приготовления
инокулюма
использовали
чистую
суточную
культуру
микроор
-
ганизмов
,
выросших
на
плотных
средах
.
Отбирали
несколько
однотипных
,
четко
изолирован
-
ных
колоний
,
выросших
на
неселективных
плотных
питательных
средах
.
Петлей
переносили
незначительное
количество
материала
с
верхушек
колоний
в
пробирку
со
стерильным
изотони
-
ческим
раствором
хлорида
натрия
,
доводя
плотность
инокулюма
до
0,5
по
стандарту
Мак
-
Фарланда
.
Оптическая
плотность
бактериальной
суспензии
с
концентрацией
1,5x108
КОЭ
/
мл
при
визуальном
контроле
точно
соответствует
стандарту
мутности
0,5
по
Мак
-
Фарланду
.
Затем
на
готовый
инокулюм
добавляли
50
и
100 µ
М
МС
и
после
120
минутной
экспозиции
проводили
световое
воздействие
аппаратом
ФДУ
-1
с
длиной
волны
630±10
нм
на
фокусном
расстоянии
2
см
от
кюветы
в
течение
10, 20
и
30
минут
.
Режим
излучения
непрерывный
с
плотностью
мощ
-
ности
в
фокусе
до
200
мВт
/
см
2
.
Антибактериальный
эффект
исследуемых
препаратов
оценива
-
ли
по
высеиванию
образца
по
методу
Gold
в
кровяной
агар
.
Результаты
регистрировали
через
24
часа
.
В
работе
использовали
0,01%
растворы
МС
,
приготовленные
на
дистиллированной
во
-
де
(
Методические
указания
№
012-3/0093 2007).
Спектры
поглощения
МС
исследовали
на
спектрофотометре
Ас
ta-
С
-III
фирмы
«
Вес
kman»
(
США
).
Результаты
и
их
обсуждение
.
Перед
изучением
фотодинамической
эффективности
метиле
-
нового
синего
в
отношении
штаммов
К
.
р
neumjniae,
был
определен
спектр
поглощения
водного
129
ПРОБЛЕМЫ
БИОЛОГИИ
И
МЕДИЦИНЫ
3 (66) 2011
раствора
метиленового
синего
(
Рис
. 1)
и
спектр
излучения
светодиодной
установки
ФДУ
-1
(
Рис
. 2).
Рис
. 1.
Спектр
поглощения
раствора
метиленового
синего
Рис
. 2.
Спектр
излучения
ФДУ
-1
Как
следует
из
представленных
рисунков
,
максимальный
спектр
поглощения
метиленового
синего
находится
в
диапазоне
от
500-700
нм
,
а
спектр
излучения
светодиодной
установки
ФДУ
-
1
составляет
600-660
нм
.
Полученные
данные
свидетельствуют
о
практически
полном
совпаде
-
нии
спектров
излучателя
и
фотосенсибилизатора
,
что
при
плотности
мощности
до
200
мВт
/
см
возможно
проведение
антимикробного
фотодинамического
эффекта
.
При
изучении
фотодинамической
инактивации
штаммов
К
.
р
n
е
umoniae
на
первом
этапе
ис
-
следовали
антимикробные
свойства
по
отдельности
только
излучения
и
только
растворов
фото
-
сенсибилизатора
МС
.
При
этом
установлено
полное
отсутствие
с
их
стороны
антимикробной
активности
в
отношении
изученных
штаммов
К
.
р
n
е
umoniae.
Тогда
как
комбинированное
воз
-
действие
обоих
факторов
было
эффективным
.
Результаты
антимикробного
действия
МС
при
фотодинамической
терапии
представлены
в
таблице
1.
По
результатам
исследований
антимикробная
активность
ФДТ
прямо
зависела
как
от
кон
-
центрации
МС
,
так
и
от
длительности
облучения
.
Наиболее
выраженный
эффект
наблюдался
при
использовании
0,1%
раствора
МС
.
При
этом
,
если
при
экспозиции
облучения
10
мин
еще
регистрировался
слабый
разряженный
рост
колоний
,
то
при
больших
экспозициях
(20-30
мин
),
микробный
рост
отсутствовал
.
130
ПРОБЛЕМЫ
БИОЛОГИИ
И
МЕДИЦИНЫ
3 (66) 2011
Таблица
1.
Результаты
фотодинамического
воздействия
на
культуру
К
.
Р
n
е
umoniae
Кол
-
во
опытов
Конц
.
МС Доза
МС
цК
Время
облучения
10
мин
20
мин
30
мин
1-
Контроль
8
++++
++++
++++
2
8
0,05%
50
+++
++
++
3
8
0,05%
100
+++
++
+
4
10
0,1%
50
++
+
+
5
10
0,1%
100
++
+
0
Условные
обозначения
: +, ++, +++, ++++ -
интенсивность
микробного
роста
; 0 -
отсутствие
микробного
роста
.
Таким
образом
,
антимикробная
ФДТ
является
одним
из
новых
способов
воздействия
на
па
-
тогенные
микробы
,
и
она
может
быть
применена
в
комбинации
отечественного
устройства
ФДУ
-1
и
метиленовой
сини
.
Антимикробная
ФДТ
характеризуется
выраженной
ингибирующей
активностью
в
отношении
полирезистентных
штаммов
К
.
р
n
е
umoniae,
что
свидетельствует
о
перспективности
ее
применения
для
лечения
внутрибольничных
гнойно
-
воспалительных
про
-
цессов
.
Выводы
1.
Максимальный
спектр
поглощения
раствора
метиленового
синего
находится
в
диапазоне
от
500-700
нм
,
а
спектр
излучения
светодиодной
установки
ФДУ
-1
составляет
600-660
нм
,
что
обуславливает
целесообразность
их
совместного
использования
для
получения
фотодинамиче
-
ского
эффекта
.
2.
Антимикробная
ФДТ
с
применением
метиленового
синего
и
светодиодной
установки
ФДУ
-
1
характеризуется
выраженной
ингибирующей
активностью
в
отношении
полирезистентных
штаммов
К
.
р
n
е
umoniae,
что
свидетельствует
о
перспективности
ее
применения
для
лечения
внутрибольничных
инфекций
.
Использованная
литература
1.
Журавлева
Л
.
А
.
Светотерапия
при
тонзиллитах
/
Л
.
А
.
Журавлева
,
И
.
И
.
Чанков
,
Т
.
В
.
Коннова
//
Сбор
-
ник
научно
-
практических
материалов
первого
межрегионального
совещания
: 15-16
января
2004,
Томск
. - 2004.
2.
Захаров
С
.
Д
.,
Иванов
А
.
В
. //
Квант
,
электроника
. 1999.
Т
. 29.
3.
Лозовская
,
Е
.
Л
.
и
др
. "
Биофизика
" 1997.
№
3.
4.
Лозовская
Е
.
Л
.
и
др
.
Вопросы
медицинской
химии
. 1998.
№
2.
5.
Страчунский
Л
.
С
.,
Белоусов
Ю
.
Б
.,
Козлов
С
.
Н
.
Практическое
руководство
по
антиинфекционной
хи
-
миотерапии
.
Смоленск
:
МАКМАХ
, 2007.
6.
Чанков
И
.
И
.,
Хлусов
И
.
А
.
Способ
лечения
хронического
тонзиллита
.
Патент
РФ
№
2235568.
Приори
-
тет
от
20.01.2003.
Опубл
. 24.03.2004,
Б
.
И
.
№
30.
7.
Эйдельштейн
М
.
В
.
Выявление
(3-
лактамаз
расширенного
спектра
у
грамотрицательных
бактерий
с
помощью
фенотипических
методов
.
Клин
,
микроб
., 2001.-
№
2.
8.
А
riane Felgentrager, Fernanda Periers Gonzalea “Photodynamic Inactivation of Candida albicans biofilms:
detection of singlet Oxygen luminescence and phototoxic efficacy” // 35 th Meeting of the American Society
for photobiology, Abstracts June 12-16, Providence, 2010. POS-37.
9.
Bergogne-Berezin E. Current guidelines for the treatment and prevention of nosocominal infections. Drugs,
1999. – Vol. 58, suppl. 1.
10.
Corona M. Cassidy, R.F. Donnelly, et al. “ Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) of Burk-
holderia cepcia complex” 8
th
International Symposium on Photodynamic Therapy and photodiagnosis in
Clinical Practice, October 6-9, 2010, WE2-2.
11.
Joao Paulo Tarvido, Aura Del Giglio, Carla Santos de Olivera et al. Methylene blue in photodynamic thera-
py: from basic mechanisms to clinical applications// Photodiagnosisa and Photodynamic Therapy. -2005-.
V.2, Issue 3, September.- p. 175-191.
12.
Lucas de Paula, Renata O. Santos, Henrique D. Menezes et al. A comparative study of irradiation systems for
photoinactivation of microorganisms// J. Braz. Soc. -2009.- no 1-7.
13.
Tavares A., CArvalho C., Faustino M. et al. Antimicrobial Photodynamic Therapy: Study of Bacterial Re-
covery Viability and Potential Development of Resistance after Treatment. Mar. Drugs, 2010. -vol. 8.- p. 91-
105
