АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН
ИНСТИТУТ БИОХИМИИ
На правах рукописи
УДК: 577.217+577.218
МАМАТКУЛОВ ДОНИЁР АНВАРОВИЧ
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И
ЗАКОНОМЕРНОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ТИРЕОГЛОБУЛИНА
ПРИ ОПУХОЛЕОБРАЗОВАНИИ В КЛЕТКАХ ЩИТОВИДНОЙ
ЖЕЛЕЗЫ
03.00.04-Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Ташкент – 2010
2
Работа выполнена в лаборатории биохимии гормонов Института биохи-
мии Академии Наук Республики Узбекистан.
Научный руководитель:
доктор биологических наук
КАДЫРОВА Дильбар Абдуллаевна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
ДАЛИМОВА Сурайё Нугмановна
доктор биологических наук, профессор
ЗИЛЯЛИЕВА Марьям Валиевна
Ведущая организация:
Институт биофизики и физиологии
Академии наук Республики Узбекистан.
Защита состоится «____»_____________2010 года в _____ часов на за-
седании специализированного совета Д 015.16.01 по присуждению ученой
степени доктора биологических наук при Институте биохимии АН РУз по
адресу: 100143, Ташкент, ул. Х.Абдуллаева, 56. Телефон: (99871) 262-25-66,
факс: (998) 262-24-41.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохи-
мии АН РУз.
Автореферат разослан «____»_______ 2010 г.
Ученый секретарь
Специализированного совета
кандидат биологических наук
Г.У.Усманова
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальность работы:
Канцерогенез–сложный многоэтапный процесс,
ведущий к глубокой опухолевой реорганизации нормальных клеток. Из всех
теорий канцерогенеза мутационная теория заслуживает наибольшего внима-
ния. Согласно этой теории, опухоли являются генетическими заболеваниями,
патогенетическим субстратом которых является повреждение генетического
материала клетки (точечные мутации, хромосомные аберрации, структурно-
функциональные нарушения хроматина, изменение содержания индивиду-
альных полирибосом и т.п.). Повреждение специфических участков ДНК
приводит к нарушению механизмов контроля за пролиферацией и дифферен-
цировкой клеток и, в конце концов к возникновению опухоли .
Опухоли щитовидной железы занимают 0,5-3% в структуре заболевае-
мости всеми злокачественными новообразованиями. Проблема рака щито-
видной железы остается актуальной в связи с тем, что узловой зоб встречает-
ся более чем у 4% населения и более чем в 90% случаев рак щитовидной же-
лезы при обследовании выявляется как аденома. Как известно, картина раз-
вития злокачественных опухолей щитовидной желез остается неполной, не
определены факторы, влияющие на трансформацию этих клеток. Остается не
ясным, является связь рака щитовидной железы с доброкачественными узел-
ковыми образованиями и зобом реальной, как происходят процессы реплика-
ции, транскрипции и мутирования ДНК при злокачественном перерождении
клеток, по каким критериям можно установить диагноз в ранние сроки раз-
вития опухолей щитовидной железы.
ТГ – основной белок, синтезируемый клетками щитовидной железы иг-
рающий ключевую роль в метаболизме тиреоидных гормонов. Одним из
факторов образования опухолей щитовидной железы является резкое нару-
шение синтеза ТГ, раковые клетки не синтезируют ТГ, т.е. ТГ полностью от-
сутствует. Для изучения процессов опухолеобразования щитовидных желез
необходимо иметь индивидуальные полирибосомы и выделенные из них на-
тивные мРНК, поэтому исследование структуры, функции, содержания ин-
дивидуальных полирибосом и мРНК можно считать одним из механизмов
опухолеобразования в клетках щитовидной железы.
Несмотря на то, что в настоящее время достаточно подробно изучены
все этапы образования опухолей щитовидной железы, однако конкретные
механизмы развития каждой отдельной опухоли щитовидной железы различ-
ны, и полную картину этих изменений сегодня дать невозможно. Полученная
информация позволяет уже сейчас предупреждать развитие некоторых видов
опухолей щитовидной железы. Однако эта информация недостаточна для
ранней диагностики и развития методов эффективной терапии различных
опухолей щитовидной железы. Профилактика, диагностика и лечение ново-
образований щитовидной железы представляют собой одну из самых акту-
альных проблем.
4
Данная проблема должна быть решена, особенно в условиях нашей Рес-
публики, где частота встречаемости различных опухолей щитовидной желе-
зы достаточно высока. Всестороннее изучение этих вопросов с применением
высокоинформативных методов позволит создать основу для ранней диффе-
ренциальной диагностики с целью профилактики и лечения этих заболева-
ний.
Исследование нарушений регуляции экспрессии гена ТГ, структурной
организации данного гена и его значимости для ранней диагностики является
одной из наиболее важных задач.
Исходя из вышесказанного, изучение закономерностей экспрессии гена
ТГ при различных опухолях щитовидной железы, создание теоретической ба-
зы для ранней диагностики этих заболеваний весьма актуально и своевремен-
но.
Степень изученности проблемы:
Для новообразований щитовидной
железы характерны генетические изменения, встречающиеся только при дан-
ном заболевании. К ним относятся хромосомные транслокации, протоонко-
гены и опухолевые супрессоры, нарушение регуляции экспрессии гена ТГ,
изменение содержания индивидуальных ТГ полирибосом, структурно-
функциональные изменения хромосом. Специфичность таких изменений
можно объяснить следующими причинами. Во-первых, в определенных ти-
пах клеток может быть повышена вероятность некоторых генетических пере-
строек. Во-вторых, тканеспецифическими могут быть экспрессия или дей-
ствие определенных онкогенов или опухолевых супрессоров. И, в третьих,
для приобретения злокачественного фенотипа разные клетки могут нуждать-
ся в неодинаковых наборах биологических свойств. Генетические наруше-
ния, которые наиболее часто встречаются в клетках щитовидной железы при
различных опухолях – это нарушение регуляции экспрессии гена ТГ, струк-
турно-функциональные изменения хроматина, изменение РНК-полимеразной
активности, нарушение синтеза ТГ, снижение количества ТГ - синтезирую-
щих полирибосом.
В различных опухолях щитовидной железы количество ТГ варьирует,
возможно, это связано с низкоэффективным образованием йодтиронинов, что
наиболее вероятно объясняется нарушением структурно-функциональных
взаимосвязей процесса гормоногенеза и позволяет определять молекулярный
базис генетических дефектов при опухолеобразовании щитовидной железы.
Связь диссертационной работы с тематическими планами НИР:
Ра-
бота выполнена в рамках фундаментального проекта Ф-4.1.32 «Структурно-
функциональная организация и закономерности экспрессии генов и генов-
супрессоров, ответственных за опухолеобразование в клетках эндокринных
желез и анализ для диагностики».
Цель исследования:
Изучение молекулярно-генетического механизма
образования опухолей щитовидной железы, изучение нарушений регуляции
экспрессии гена ТГ.
5
Задачи исследования
:
1.Определение размера популяции ТГ полирибосом в клетках щитовид-
ной железы в норме и при различных опухолях,
2. Изучение структурно-функциональных свойств хроматина и различ-
ных модификаций ДНК при опухолеобразовании в клетках щитовидной же-
лезы,
3. Изучение регуляции экспрессии гена ТГ в клетках щитовидной желе-
зы при некоторых опухолях.
Объект и предмет исследования:
Щитовидные железы больных, уда-
ленные во время операции по поводу различных опухолей. Были использова-
ны образцы ДНК, выделенные из крови больных с различными опухолями
щитовидной железы (32 – папиллярная аденокарцинома, 24 – фолликулярная
аденокарцинома), в качестве контроля использовали ДНК из крови 12 здоро-
вых доноров.
Методы исследований:
В работе были использованы современные ме-
тоды биохимии и молекулярной биологии: выделение полирибосом магние-
вым методом, выделение суммарной РНК, выделение высокомолекулярной
ДНК, рестрикционный анализ ДНК, электрофорез продуктов гидролиза ДНК
рестриктазами в 0,8% агарозном геле, полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. При различных опухолях щитовидной железы происходит резкое
уменьшение содержания ТГ – синтезирующих полирибосом, Процесс опу-
холеобразования сопровождается заметным снижением синтеза ТГ, что объ-
ясняется нарушением регуляции экспрессии гена ТГ на уровне транскрипции
и трансляции.
2. При образовании различных опухолей щитовидной железы большое
значение имеет выяснение структурной организации и функциональных
свойств транскрипционно активных участков гена ТГ, выявление факторов,
определяющих потенциально активное состояние гена ТГ и обеспечивающих
транскрипцию данного гена.
3. При опухолеобразовании в клетках щитовидной железы выявляются
мутационные изменения в молекуле ДНК, происходит нарушение регуляции
экспрессии гена ТГ.
Научная новизна:
В данной диссертации проведено изучение наруше-
ний регуляции экспрессии гена ТГ на всех уровнях, а именно: на уровне
трансляции, на уровне транскрипции, процессинга (созревание молекулы
мРНК), на уровне выхода мРНК из ядра и вхождения мРНК в полирибосомы,
на уровне метилирования молекулы ДНК. Впервые проведено изучение из-
менения содержания индивидуальных ТГ полирибосом при опухолеобразо-
вании в клетках щитовидной железы.
Результаты, полученные при выполнении работы, имеют фундаменталь-
ное значение для выяснения структурной организации и функционирования
генома человека, для изучения молекулярных механизмов реализации гене-
6
тической информации и общих механизмов образования различных опухолей
эндокринных желез.
В настоящей работе дана молекулярно-генетическая характеристика
различных опухолей щитовидной железы, проведено изучение дефектов ре-
гуляции активности гена ТГ, выявлены различные молекулярно-
генетических факторы образования данного заболевания, одним из основ-
ных, среди которых, являются дефекты гена ТГ. Данное исследование пред-
ставляет собой базу для дальнейшего развития молекулярно-генетических
исследований опухолей щитовидной железы, связанных с нарушениями ра-
боты гена ТГ.
Научная и практическая значимость результатов исследования:
Предложены новые подходы к ранней диагностике, профилактике и лечения
различных опухолей щитовидной железы
Полученные экспериментальные данные об изменении размера популя-
ции ТГ – синтезирующих полирибосом, нарушении регуляции экспрессии
гена ТГ, изменении структурно-функциональных свойств хроматина, нару-
шении паттерна метилирования ДНК при опухолеобразовании в клетках щи-
товидной железы расширяют наши знания о патогенезе данного заболевания
и могут быть включены в курс лекций по биохимии и молекулярной биоло-
гии.
Введение в практику молекулярно-генетических методов исследования
различных опухолей щитовидной железы приведут к углубленному понима-
нию вопросов патогенеза опухолеобразования, что может послужить надеж-
ным критерием прогноза исхода заболевания.
Выявленные нарушения регуляции экспрессии гена ТГ могут быть ис-
пользованы в качестве маркеров ранней доклинической диагностики различ-
ных опухолей щитовидной железы с целью профилактики и дальнейшего ле-
чения данного заболевания.
Реализация результатов:
Основные положения диссертации включены
в курс лекций по биохимии и молекулярной биологии факультета естествен-
ных наук Ташкентского Государственного Педагогического Университета
им. Низами.
Апробация работы:
Основные положения диссертации докладывались
на международных и республиканских съездах, конгрессах, симпозиумах,
конференциях: «Третий Московский Международный конгресс» (Пущино,
2005), конференции молодых ученых Института Биохимии АН РУз (Таш-
кент,2006), на конференциях «Современные проблемы биохимиии и эндо-
кринологии» с международным участием (Ташкент,2006), «Современные
проблемы физиологии и биофизики» (Ташкент, 2007), на IV съезде микро-
биологов Узбекистана (Ташкент, 2008), на 6-й Российской конференции по
фундаментальной онкологии (Санкт-Петербург, 2010), на научном семинаре
при Специализированном совете Д.015.16.01 при Институте биохимии АН
РУз (Ташкент, 2010).
7
Опубликованность результатов
: По теме диссертационной работы в
различных изданиях Узбекистана и Российской федерации опубликовано
5 журнальных статей, 8 тезисов.
Структура и объём диссертации:
Диссертация изложена на 107 стра-
ницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, опи-
сания материалов и методов исследования, глав с результатами собственного
исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций. Иллю-
страции:12 таблиц и 15 рисунков. Библиографический указатель включает
122 источника авторов стран СНГ и зарубежных авторов.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.
Во введении
раскрыты актуальность работы, сформулированы цель и
задачи исследования, научная новизна, научная и практическая значимость,
сформулированы положения, выносимые на защиту, обосновано практиче-
ское внедрение полученных результатов исследования.
В первой главе
освещены молекулярно-генетические аспекты различ-
ных опухолей щитовидной железы. Проанализированы структурно-
функциональная организация и строение гена ТГ, функциональная роль ме-
тилирования ДНК при опухолеобразовании.
Во второй главе
даны материал и методы. ДНК выделяли из крови
больных с различными опухолями щитовидной железы. В качестве контроля
использовали ДНК из крови здоровых доноров. Полирибосомы и ДНК выде-
ляли из клеток щитовидной железы человека, удаленных во время операции
по поводу различных опухолей.
Суммарные полирибосомы из клеток щитовидной железы получали
магниевым методом, с помощью которого удалось добиться оптимального
выхода полирибосом (Лейтин В.Л., Лерман М.И., 1969г.).
Индивидуальные ТГ полирибосомы получали с помощью иммуносор-
бентов, представляющих собой ковалентно связанные комплексы белковых
антигенов с нерастворимой основой и содержащих антитела к синтезируемо-
му белку. В качестве нерастворимой основы «сандвич» - сорбента брали
коммерческий препарат ионообменника – парааминобензилцеллюлозы
(ПАБЦ). ПАБЦ имеет первичные ароматические аминогруппы, которые мо-
гут диазотироваться и соединяться с белками, гистонами и антителами, обра-
зуя специфичные адсорбенты.
Суммарную РНК выделяли SDS–фенол-хлороформным методом.
Выделение высокомолекулярной ДНК из лейкоцитов крови проводили в
соответствии с методом фенольной экстракции (Шипицина и соавт., 1980г.).
Выделение фракций ДНК проводили модифицированным фенольным
методом, который позволяет выделить три фракции ДНК, благодаря приме-
нению различных условий депротеинизации.
Гибридизацию фракций ДНК с
3
Н ТГ кДНК проводили при 65
0
С в ги-
бридизационных пробах объемом по 30 мкл, содержащих по 30 мкг одной из
8
фракций ДНК, 50 мкг
3
Н ТГ кДНК (1000 имп/мин), 3 мМ NaCI, 0,01М трис-
HCI, рН 7,5. Через определенные промежутки времени пробы охлаждали,
разбавляя водой до 100 мкл, и наносили по 30 мкл на фильтры “Rufs” для
подсчета общей радиоактивности.
Гибридизацию нейлоновых фильтров “Bi-
odan”, содержащих фрагменты ДНК с
32
Р-ТГ кДНК проводили в течение 15
часов при 65
0
С в 10 мл смеси, содержащей 4хССР, четырехкратный раствор
Денхардта, 0,5мг/мл полиU, 0,1% додецилсульфата натрия, 10% декстран-
сульфата (Pharmacia) и 10 имп/мин/мл меченой по фосфору ТГ кДНК.
ТГ комплементарную ДНК получали методом полимеразной цепной ре-
акции (ПЦР).
Ядра из клеток щитовидной железы выделяли осаждением их в 0,25 М
сахарозе, содержащей 5 мМ MgCl
2
1 мМ дитиотрейтола (ДТТ) 10 мМ трис-
HCI pH 7.5 (буфер Б) и дальнейшей очисткой их путём наслоения на раствор
2 М сахарозы в буфере Б (24000 об\мин 1 час ротор SW-27, «Beckman»).
Третья глава
посвящена изучению нарушений
регуляции экспрессии
гена ТГ при различных опухолях щитовидной железы
Синтез и физико-химическая характеристика кДНК для гена тирео-
глобулина.
Для того чтобы изучить нарушения, происходящие в гене ТГ,
при различных опухолях щитовидной железы необходимо иметь ТГ кДНК,
которая используется в качестве зонда в экспериментах по гибридизации для
обнаружения мутационных изменений в гене ТГ. Синтез кДНК для гена ТГ
проводили методом ПЦР. ТГ комплементарную ДНК синтезировали на 0,5
мкг суммарной РНК в присутствии обратной транскриптазы с применением
праймеров, специфичных для гена ТГ:
for 5’ – AGGCTAGGAAAATGGCCCTGGTCC – 3’;
rev 5’ – TTGGATCCTTATGTGGGGGAATCTGCC – 3’.
ПЦР проводили в инкубационной среде: 50мкл содержали 60 мМ трис-
НС1 (рН 8,6), 6 мМ ЭДТА, 10 мМ
-меркаптоэтанола, 10 мкг/мл ВСА, 1 мМ
каждого из 4-х нуклеотидов, 2 ед. обратной транскриптазы. ПЦР имела 35
циклов. Для синтеза кДНК для гена ТГ использовали как ДНК-полимеразу I,
так и РНК-зависимую ДНК-полимеразу (ревертазу).
По окончании 35 циклов амплификации пробы в течение 10 мин выдер-
живали при 72
0
С для завершения элонгации, после чего проверяли степень
амплификации электрофорезом аликвоты реакционной смеси (10 мкл) в 1%
агарозе с бромистым этидием.
На рис. 1 представлены результаты амплификации, последующего элек-
трофореза и ультрацентрифугирования кДНК для гена ТГ в 5-20% сахароз-
ном градиенте. В качестве маркера брали цитоплазматическую РНК из пече-
ни мышей. Показано, что коэффициент седиментации кДНК для гена ТГ со-
ставляет 33S, что соответствует литературным данным и нашим собственным
результатам.
9
Таким образом, синтезированный препарат кДНК для гена ТГ, будет ис-
пользоваться в экспериментах по изучению дефектов экспрессии этого гена в
клетках щитовидной железы при различных опухолях.
Анализ процесса иммуносорбции индивидуальных полирибосом и
определение емкости ПАБЦ-ТГ:аТГ.
Для выделения индивидуальных ТГ
полирибосом мы использовали иммуносорбенты типа “сандвич”. В качестве
нерастворимой основы “сандвич”-сорбента был использован коммерческий
препарат ионообменника ПАБЦ, имеющий первичные ароматические амино-
группы, которые могут диазотироваться и соединяться с белками, гистонами
и антителами, образуя специфические адсорбенты.
Для того, чтобы измерить, какое количество аТГ связывается с ПАБЦ-ТГ при
различных условиях, определить уровень неспецифической сорбции и вы-
брать оптимальные условия для приготовления “сандвич» - сорбента, иссле-
довали кривые связывания ПАБЦ-ТГ с нормальной и аТГ сывороткой
(рис.2). При увеличении концентрации аТГ в инкубационной смеси повыша-
ется достигаемая емкость иммуносорбента. Однако, полученная емкость не
является максимальной, о чем свидетельствует отсутствие плато на кривой
связывания. Форма кривой указывает на наличие нескольких типов связыва-
ния, что, по-видимому, является отражением неэквивалентности аминогрупп
ПАБЦ.
При приготовлении иммуносорбента ПАБЦ-ТГ:аТГ мы выбрали соот-
ношение 1мл аТГ на 1 мг ПАБЦ-ТГ, потому, что при этих условиях обеспе-
чивается достигаемая емкость ПАБЦ-ТГ по аТГ 0,6 мг аТГ/мг ПАБЦ-ТГ.
Рис. 1. Синтез тиреоглобулиновой кДНК и ультрацентрифуги-
рование в градиенте плотности сахарозы
10
Кривая 1 - антитиреоглобулиновая сыворотка
Кривая 2 - нормальная сыворотка
Рис. 2. Кривые связывания белков из нормальной и антитиреогло-
булиновой сыворотки с ПАБЦ-ТГ:аТГ
При данных условиях инкубации с 1 мг ПАБЦ-ТГ связывается до 1мг
аТГ (рис. 2, кривая 1). Уровень неспецифической сорбции белков из нор-
мальной сыворотки не превышает 0,1мг/мг ПАБЦ, причем число мест неспе-
цифического связывания с иммуносорбентом строго ограниченно (рис.2,
кривая 2).
Таким образом, нами получен иммуносорбент ПАБЦ-ТГ:аТГ, который
характеризуется высокой емкостью и низкой неспецифической сорбцией.
Определение размера популяции индивидуальных тиреоглобулино-
вых полирибосом щитовидной железы при различных опухолях.
При ряде заболеваний щитовидной железы содержание ТГ в тиреоидной
ткани сильно изменяется, отмечаются изменения и в структуре ТГ. При изу-
чении механизма образования опухолей щитовидной железы, для разработки
методов ранней диагностики особое место занимает вопрос о размере попу-
ляции индивидуальных полирибосом, поскольку именно количество транс-
лируемых молекул мРНК и определяет скорость синтеза белка.
Для изучения процессов опухолеобразования щитовидных желез необ-
ходимо иметь индивидуальные полирибосомы и выделенные из них натив-
ные мРНК, поэтому исследование структуры, функции и содержания инди-
видуальных полирибосом и мРНК можно считать одним из механизмов опу-
холеобразования в клетках щитовидной железы. Полирибосомы выделяли из
ткани каждого случая опухоли магниевым методом, с помощью которого
11
удалось добиться оптимального выхода полисом. В таблице 1 представлены
данные, позволяющие оценить спектральные свойства и выход полирибосом,
полученных из ткани патологических желез и нормальной ткани. Из данных
таблицы видно, что выделенные суммарные полирибосомы по физико-
химическим свойствам могут быть использованы в исследованиях по опре-
делению размера популяции индивидуальных ТГ полирибосом в клетках щи-
товидной железы при различных опухолях. Нами было использовано 28 об-
разцов ткани щитовидной железы, из них: папиллярная аденокарцинома (12
случаев), фолликулярная аденокарцинома (8 случаев), нормальная тиреоид-
ная ткань (8случаев)
Таблица 1
Некоторые физико-химические свойства полирибосом
полученные магниевым методом(t-критерий Стыодента для независи-
мых выборок)
№
Объект
исследования
Д
260
/
Д
235
Д
260
/
Д
280
Содержание
РНК мкг/г
сырой ткани
Выход полисом
мкг/г
сырой ткани
%
1
Нормальная
тиреоидная ткань
1,47
0,8
1,81
0,18
390
21
500
34
80
1,5
2
Папиллярная
карцинома
1,55
0,14
1,81
0,22
457
26**
572
42** 75
1,9
3
Фолликулярная
карцинома
1,41
0.24
1,75
0,16
470
21**
520
29*
76
1,8
Примечание: Достоверное отличие **р<0,05 ,*р<0,01 по отношению к норме.
Для определения количества ТГ-синтезирующих полирибосом готовили
серии инкубационных смесей, содержащих фиксированное количество поли-
рибосом и разное количество “сандвич”- сорбента ПАБЦ-ТГ:аТГ (табл. 2).
Таблица 2
Состав инкубационных смесей
№
Полирибо-
сомы
мл
*
ПАБЦ-
ТГ:аТГ
мл**
Буфер
Инкубационная смесь содержит:
Полирибосомы
ПАБЦ-ТГ:аТГ
мг
мг/мл
мг
мг/мл
1
0.12
0,012
0,0175
0,016
1,0
0,12
5
1,2
2
0,12
0,025
0,005
0,016
1,0
0,25
0,64
3
0,12
0,025
0,005
0,016
1,0
0, 5
0,32
4
0,12
0,05
--
0,016
1,0
1,0
0,16
*- концентрация полирибосом в исходном растворе 1,2 мг\мл
** - концентрация иммуносорбента 10 мг\мл в 1 и 2 точках, 20мг\мл в 3 и 4 точка
12
Нами было проведено определение содержания ТГ полирибосом при
фолликулярной аденокарциноме. Размер популяции ТГ полирибосом при
фолликулярной аденокарциноме составляет 5,4%. В следующей серии экспе-
риментов было проведено определение содержания ТГ полирибосом при па-
пиллярной аденокарциноме. Определению размера популяции ТГ полири-
босом при папиллярной карциноме показало, что размер популяции ТГ поли-
рибосом в клетках щитовидной железы при папиллярной карциноме состав-
ляет 0,07%. На рисунке 3 суммированы данные по определению размера по-
пуляции ТГ – синтезирующих полирибосом в клетках щитовидной железы.
%
20
10
0
16,0%
14,8%
12,6%
5,4%
0,07,%
1 2 3 4
5
Снижение размера популяции ТГ – синтезирующих полирибосом при
опухолях щитовидной железы указывает на то, что при данных заболеваниях
ТГ мРНК либо практически отсутствует, либо образуется, но не способна
транслироваться.
Биосинтез тиреоглобулина в клетках щитовидной железы при раз-
личных опухолях.
Процесс опухолеобразования обычно связан с дефектом
синтеза ТГ. Нами было проведено исследование активности белоксинтези-
рующей системы из клеток щитовидной железы в норме и при различных
опухолях щитовидной железы. Компоненты белоксинтезирующего аппарата
(полирибосомы, белковые факторы трансляции, тРНК и аминоацил-тРНК-
синтетазы) вносили в систему в виде фракции, получаемой центрифугирова-
нием гомогената клеток при 3000 g в течение 10 мин (фракция S
30
). Концен-
трация фракции S
30
в системе составляла 20 ед. Д
260
на 1 мл. Бесклеточную
систему инкубировали при 37
0
в течение 1 часа. Результаты по включению
С
14
- аминокислот в бесклеточную белоксинтезирующую систему представ-
лены в таблице 3. Из данных таблицы видно, что белоксинтезирующая ак-
тивность щитовидной железы при фолликулярной карциноме снижается на
77%, а при папиллярной карциноме на 98%. Полученные результаты указы-
1- нормальная тиреоидная ткань, 2- бычьи щитовидные железы,
3- узловой эутиреоидный зоб, 4- фолликулярная аденокарцинома,
5- папиллярная аденокарцинома.
Рис. 3. Размер популяции индивидуальных ТГ - полирибосом
13
вают на то, что при опухолях щитовидной железы происходит нарушение ре-
гуляции экспрессии гена ТГ на уровне трансляции.
Таблица 3
Включение С
14
–аминокислот в бесклеточную
белок-синтезирующую систему из клеток щитовидной железы
Вид патологии
Включение С
14
– аминокислот
(имп/мин на 20 ед. S
30
)
Диффузный токсический зоб n-10
Фолликулярная карцинома n-8
Папиллярная карцинома n-12
1416
82
320
21
15,6
1,9
Изучение транскрипционно-активной фракции ДНК в клетках
щитовидной железы при опухолях
. Для изучения особенностей структуры
ДНК, функционально различных участков хроматина при различных опухо-
лях щитовидной железы было проведено выделение фракций ДНК с различ-
ной транскрипционной активностью и с помощью ДНК-ДНК гибридизации
исследовано содержание последовательностей гена ТГ в этих фракциях.
Из клеток щитовидной железы при папиллярной и фолликулярной аде-
нокарциноме методом дифференциальной бездетергентной фенольно-
солевой депротеинизации выделены три фракции ДНК I, ДНК II и ДНК III.
Фракция ДНК I охарактеризована как транскрипционно активная ДНК
на основании высокого содержания в ней гибридной ДНК, обогащенной
уникальными последовательностями. ДНК II представляет собой ДНК ста-
бильно репрессированных участков генома. ДНК III является потенциально
активной областью генома. Данный метод позволяет получить транскрипци-
онно активную ДНК в высокомолекулярной форме, что открывает возмож-
ности для исследования ее структурных особенностей.
Прямые доказательства функциональных различий ДНК I, ДНК II и
ДНК III были получены при изучении содержания последовательностей гена
ТГ методом молекулярной гибридизации этих фракций с избытком
3
Н ТГ
кДНК, содержащей 5’ область гена ТГ. На рисунке 4 представлены кривые
гибридизации фракции ДНК I из клеток щитовидной железы в норме и при
патологии. Из данных рисунка видно, что кривая гибридизации фракции
ДНК I при папиллярной аденокарциноме выходит на плато при 2,5%, кривая
гибридизации фракции ДНК I при фолликулярной аденокарциноме – при
4,0%, тогда как в случае нормальной тиреоидной ткани плато достигается
при 15%.
На рисунке 5 представлены кривые гибридизации фракции ДНК III из
клеток щитовидной железы в норме, при папиллярной и фолликулярной аде-
нокарциноме. Из данного рисунка видно, что кривая гибридизации фракции
ДНК III при папиллярной аденокарциноме достигает плато при 8%, тогда как
в случае фолликулярной аденокарциномы плато достигается при 10%. По-
вышенное содержание последовательностей гена ТГ во фракции ДНКIII в
14
клетках щитовидной железы при папиллярной и фолликулярной аденокар-
циноме свидетельствует о том, что эта фракция более обогащена транскри-
бируемыми последовательностями генома, в отличие от фракции ДНК I.
1 – диффузный токсический зоб, 2 - фолликулярная аденокарцинома,
3 - папиллярная аденокарцинома
Рис. 4. Кривые гибридизации фракции ДНК I.
Таким образом, из полученных данных видно, что при фолликулярной
и папиллярной аденокарциноме фракция ДНК I не является транскрипционно
активной и последовательности гена ТГ при данной патологии находятся в
потенциально активных районах генома. Это хорошо коррелирует с низкой
транскрипционной активностью клеток щитовидной железы при папилляр-
ной и фолликулярной аденокарциноме: ТГ мРНК при этих заболеваниях
практически отсутствует.
1 – диффузный токсический зоб, 2 - фолликулярная аденокарцинома,
3 - папиллярная аденокарцинома
Рис. 5. Кривые гибридизации фракции ДНК III.
15
Изучение метилирования молекулы ДНК при опухолеобразовании в
клетках щитовидной железы.
Одним из молекулярно-генетических факто-
ров образования различных опухолей щитовидной железы является измене-
ние сайтов метилирования ДНК, при этом происходит избирательное локаль-
ное гиперметилирование цитозина в составе CpG – динуклеотидов (неметили-
рованных в норме), т.е. наблюдается гиперметилирование молекулы ДНК. В
опухолевых клетках происходит также общее деметилирование. Для того,
чтобы понять причину одновременного гиперметилирования и гипометилиро-
вания ДНК в различных опухолях нами была изучена активность ДНК - мети-
лтрансферазы в ДНК нормальных и опухолевых клеток. С этой целью из лей-
коцитов крови практически здоровых людей и крови при папиллярной и фол-
ликулярной аденокарциноме были выделены молекулы ДНК и обработаны
ферментом ДНК - метилтрансферазой. Нами было показано изменение актив-
ности метилтрансферазы в опухолевых клетках щитовидной железы. На рис. 6
приведены кривые, отражающие изменение активности данного фермента, в
зависимости от формы опухоли. Из данных рисунка видно, что при папилляр-
ной аденокарциноме активность метилтрансферазы повышается в 1,76 раза,
по сравнению с нормой.
1 – норма, 2 – папиллярная аденокарцинома
Рис. 6. Активность метилтрансферазы в клетках
щитовидной желе-
зы при папиллярной аденокарциноме.
При изучении взаимосвязи между экспрессией гена ТГ и его метилиро-
ванием показано, что чувствительные к метилированию сайты, расположен-
ные в 5’ –фланкирующей области гена ТГ, гиперметилируются при папил-
1 – норма, 2 – папиллярная аденокарцинома
Рис. 7. Активность метилтрансферазы в клетках
щитовидной железы при папиллярной аденокарциноме
аденокарциноме
16
лярной аденокарциноме, в то время как в клетках нормальной тиреоидной
ткани наблюдается недометилирование этих сайтов.
Рестрикционное картирование ДНК для определения мутационных
изменений в гене тиреоглобулина.
В клетках щитовидной железы при раз-
личных опухолях наблюдаются различные мутационные изменения в гене
ТГ, которые нарушают его функционирование. Нарушение регуляции экс-
прессии гена ТГ приводит к различным наследственным заболеваниям, а
также происходит образование опухолей в клетках щитовидной железы.
Из клеток щитовидной железы при папиллярной и фолликулярной аде-
нокарциноме, а также из нормальной крови человека были выделены высо-
комолекулярные молекулы ДНК.
Обработку ДНК рестрикционными эндонуклеазами BamH1, HindIII,
EcoRV, EcoRI, PstI проводили в буфере, содержащем 0,04М трис-НСI, рН
7,4, 0,01М МgCI
2
, 0,05M NaCI, 0,01М дитиотрейтол. В качестве маркера ис-
пользовали ДНК бактериофага
обработанную теми же рестриктазами. По-
сле электрофореза фрагменты ДНК переносили на нейлоновые фильтры «Bi-
odan» по методу Саузерна.
При обработке ДНК больного при папиллярной аденокарциноме эндо-
нуклеазой EcoRI методом рестрикционного анализа было выявлено 3 фраг-
мента, а при фолликулярной аденокарциноме выявлено 4 фрагмента. В ДНК
больных при папиллярной аденокарциноме отсутствует фрагмент ДНК раз-
мером 3,4 т.п.н. Из полученных данных видно, что при папиллярной адено-
карциноме произошла делеция последовательностей ДНК, содержащих ген
ТГ. В ДНК больных при фолликулярной аденокарциноме мутационных из-
менений в молекуле ДНК не обнаружено.
Из приведенных данных видно, что при папиллярной аденокарциноме
происходит резкое уменьшение количества ТГ мРНК, подтверждением чего
являются мутационные изменения в гене ТГ. Изменение уровня ТГ мРНК
определяет состояние щитовидной железы при опухолеобразовании. Регуля-
ция экспрессии гена ТГ на уровне транскрипции играет существенную роль
при различных опухолях щитовидной железы.
Таким образом, в патогенезе тиреоидных новообразований нарушение
регуляции экспрессии гена ТГ занимает важное место и является одним из
факторов опухолеобразования в клетках щитовидной железы и может быть
использован в качестве маркера ранней доклинической диагностики этих за-
болеваний.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
Результаты исследования позволили сформулировать выводы:
1. Получен иммуносорбент ПАБЦ-ТГ:аТГ, для определения размера по-
пуляции индивидуальных ТГ полирибосом, достигаемая емкость полученно-
го иммуносорбента равна 0,14 мг/мг.
17
2. Определен размер популяции индивидуальных ТГ полирибосом в
клетках щитовидной железы в норме и при различных опухолях щитовидной
железы, установлено, что размер популяции ТГ полирибосом составляет: в
клетках нормальной тиреоидной ткани–26%, при фолликулярной аденокар-
циноме-5,4%, при папиллярной аденокарциноме – 0,07%.
3. Показано, что белоксинтезирующая активность клеток щитовидной
железы при фолликулярной аденокарциноме уменьшается на 77%, а при
фолликулярной аденокарциноме - на 98%.
4. Проведено изучение содержания последовательностей гена ТГ во
фракциях ДНК I и ДНК III в клетках щитовидной железы при папиллярной и
фолликулярной аденокарциноме. Показано, что при фолликулярной и папил-
лярной аденокарциноме фракция ДНК I не обогащена последовательностями
гена ТГ и не является транскрипционно активной.
5. При папиллярной аденокарциноме выявлены хромосомные аберра-
ции, что приводит к генетической нестабильности, частота хромосомных
аберраций составляет 2,8%.
6.Установлено, что при папиллярной аденокарциноме активность метил
трансферазы повышается в 1.76 раза, по сравнению, с нормой. При папил-
лярной аденокарциноме происходит гиперметилирование регуляторной об-
ласти ТГ гена.
7. При обработке ДНК рестриктазой EcoRI при папиллярной аденокарци
номе происходит потеря гетерозиготности, что сопровождается появлением
крупной делеции в гене ТГ, размером 3,4 т.п.н.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ
1
.
Маматкулов Д., Абдугаффурова Д. Изменение содержания тиреогло-
булиновых полирибосом в клетках щитовидной железы при различных опу-
холях// Матер. научно-практич. конф. «Современные проблемы биохимии и
эндокринологии». – Ташкент, 2006.- С.47-48.
2. Кадырова Д.А.,
Ибрагимов А.А., Ибрагимова Э.А., Саидкаримов
И.С., Маматкулов Д.А.
Сравнительный анализ ДНК клеток крови и слюны
при некоторых формах тиреоидной патологии// Проблемы биологии и меди-
цины. – Самарканд, 2007. Т.50.- С. 27-30.
3. Кадырова Д.А., Маматкулов Д.А., Зиямухамедова С.А., Абдугаффуро-
ва Д.Г. Молекулярно-генетические факторы образования опухолей щитовид-
ной железы, ранняя диагностика// Проблемы биологии и медицины. – Самар-
канд, 2007. № 4 (50).- С.34-37.
4. Ибрагимова Э.А., Кадырова Д.А., Маматкулов Д.А., Ялалова И.Р., Зи-
ямухамедова С.А. Характеристика полирибосом щитовидной железы челове-
ка при различных опухолях// Современные проблемы физиологии и биофи-
зики: Матер. респуб. науч. конф. 24-25 октябрь. – Ташкент, 2007.- С.44-45.
5
.
Маматкулов Д.А., Кадырова Д.А., Абдугаффурова Д.Г., Зиямухамедо-
ва С.А. Структурно-функциональные особенности и закономерности экс-
18
прессии гена тиреоглобулина при опухолях щитовидной железы// Современ-
ные проблемы физиологии и биофизики: Матер. респуб. науч. конф. 24-25
октябрь. – Ташкент, 2007.- С.74-75.
6. Кадырова Д.А., Маматкулов Д.А., Зиямухамедова С.А., Абдугаффу-
рова Д.Г. Изменения структуры хроматина, связанные с экспрессией гена ти-
реоглобулина при различных опухолях щитовидной железы// ДАН РУз. –
Ташкент, 2008.- № 4.- С.98-101.
7. Кадырова Д.А., Маматкулов Д.А., Абдугаффурова Д.Г., Алланазаро-
ва Б. Нарушение регуляции экспрессии гена тиреоглобулина в клетках щито-
видной железы при различных опухолях// Матер. конф. «Фундаментальная и
клиническая эндокринология, проблемы и перспективы». – Харьков, 2008.-
С.65-66.
8. Кадырова Д.А., Абдугафурова Д.А., Маматкулов Д.А. Активность ме-
тилтрансферазы при различных опухолях щитовидной железы и при клеточ-
ном старении// Матер. респуб. науч. конф. «Проблемы современной микро-
биологии и биотехнологии». – Ташкент, 2009.- С.115.
9. Кадырова Д.А., Маматкулов Д.А. Изучение статуса метилирования
ДНК и экспрессии гена тиреоглобулина при различных опухолях щитовид-
ной железы// Матер. 6-й Российской конф. по фундаментальной онкологии. –
Санкт-Петербург, 2010.- С.23-24.
10. Кадырова Д.А., Маматкулов Д.А., Абдугафурова Д.Г. Содержание
тиреоглобулиновых полирибосом щитовидной железы в норме и при опухо-
леобразовании// Матер. 6-й Российской конф. по фундаментальной онколо-
гии. – Санкт-Петербург, 2010.- С.24.
11. Кадырова Д.А., Маматкулов Д.А., Касымов О.Ш., Ибрагимов А.А.
Значение процесса метилирования ДНК гена р53 при различных опухолях
щитовидной железы// Матер. 6-й Российской конф. по фундаментальной он-
кологии. – Санкт-Петербург., 2010.- С.24-25.
12. Кадырова Д.А., Маматкулов Д.А. Нарушение регуляции экспрессии
гена тиреоглобулина – один из маркеров диагностики опухолей щитовидной
железы// Проблемы биологии и медицины. – Самарканд, 2010.- № 1(60).-
С.139-143.
13. Кадырова Д.А., Маматкулов Д.А.,Ялалова И.Р., Абдуллаева М.И.
Содержание последовательностей гена тиреоглобулина во фракциях ДНК с
различной транскрипционной активностью в клетках щитовидной железы
при различных опухолях// Назарий ва клиник тиббиёт–Ташкент, 2010.-№4.-
С.82-85.
19
Биология фанлари номзоди илмий даражасига талабгор Маматқулов Дониёр
Анваровичнинг 03.00.04 - Биокимё ихтисослиги бўйича «
Қалқонсимон без
ҳужайраларидаги
ўсма
ҳосил
бўлишида
тиреоглобулин
гени
экспрессияси
қонунлари
ва
структура-функционал
тузилиши
»
мавзусидаги диссертациясининг
РЕЗЮМЕСИ
Таянч (энг муҳим) сўзлар:
қалқонсимон без,
тиреоглобулин,
индивидуал ТГ полирибосомалар, иммуносорбент, метилланиш, РНК, ДНК,
экспрессия, папилляр аденокарцинома, фолликуляр аденокарцинома.
Тадқиқот объектлари:
бемор ва соғлом донорлар қонидан олинган
ДНК намуналари, турли ўсма ҳолатларида беморларда ўтказилган жарроҳлик
амалиётида олинган қалқонсимон без намуналари.
Ишнинг мақсади:
ишнинг асосий мақсади ҳар хил қалқонсимон без
ўсмаларида ТГ гени экспрессияси қонуниятлари ва таркибий–функционал
тузилишини, ўсмалар ҳосил бўлишининг молекуляр–гентик механизмларини
ва ТГ гени экспрессияси регуляциясининг бузилишларини ўрганиш ва ушбу
касалликларни эрта ташҳислаш учун назарий асос яратиш.
Тадқиқот методлари:
полирибосома ажратиб олишнинг магнийли
усули, суммар РНК ажратиш, ПАБЦ-ТГ:аТГ иммуносорбенти олиш, юқори
молекуляр ДНК ажратиш, ДНК рестрикцион таҳлили, рестриктазаланган
ДНК гидролизи маҳсулотларининг 0,8% агароза гелида электрофорези, ДНК
фрагментларини сақловчи “Biodan” нейлон фильтрида
32
Р-нишонланган
кДНК билан дурагайлаш, Полимераза занжир реакциялари.
Олинган натижалар ва уларнинг янгилиги:
ПАБЦ-ТГ:аТГ
иммуносорбенти олинди. Индивидуал ТГ полирибосомалар миқдори
аниқланди. Папилляр аденокарциномада индивидуал ТГ полирибосомалар
миқдорининг камайиши кузатилди. Папилляр аденокарциномада генетик
ўзгаришларга сабабчи хромосома аберрациялари ўрганилди, хромосома
аберрацияларининг
частотаси
2,8%
ташкил
этади.
Папилляр
аденокарциномада ТГ гени экспрессияси регулясиясидаги бузилишлар мРНК
синтези даражасида, яъни транскрипция даражасида рўй беради.
Амалий аҳамияти:
қалқонсимон без ўсмаларини тадқиқ қилишнинг
молекуляр–генетик усулларини амалиётга жорий қилиш ўсма пайдо бўлиш
механизмларини янада тўлиқ ва чуқур ўрганиш имконини беради, бу
касаллик оқибатини эрта аниқлашнинг жиддий мезони саналади.
Татбиқ этиш даражаси ва иқтисодий самарадорлиги:
тадқиқот
натижаларидан
қалқонсимон
без
ўсмаларини
эрта
ташҳислашда,
университетларнинг биология факультетларида молекуляр биология ва
гормонлар биокимёси, тиббиёт институтларида эндокринология курсларини
ўқитишда фойдаланиш мумкин.
Қўлланиш (фойдаланиш) соҳаси:
биокимё, молекуляр биология, био-
технология, тиббиёт, эндокринология.
20
РЕЗЮМЕ
диссертации Маматкулова Дониёра Анваровича на тему:
«Структурно-
функциональная организация и закономерности экспрессии гена тирео-
глобулина при опухолеобразовании в клетках щитовидной железы»
на
соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности
03.00.04-Биохимия
Ключевые слова:
щитовидная железа, тиреоглобулин, ТГ полирибосо-
мы, иммуносорбент, метилирование, РНК, ДНК, экспрессия, папиллярная
аденокарцинома, фолликулярная аденокарцинома.
Объекты исследования:
образцы ДНК, полученные из крови больных и
здоровых доноров,
щитовидные железы больных, удаленные во время опера-
ции по поводу различных опухолей.
Цель исследования:
изучить структурно-функциональные особенности
и закономерности экспрессии гена ТГ при различных опухолях щитовидной
железы, молекулярно-генетические механизмы образования опухолей щито-
видной железы, нарушение регуляции экспрессии гена ТГ и создание теоре-
тической базы для ранней диагностики этих заболеваний.
Методы исследования:
выделение полирибосом магниевым методом,
выделение суммарной РНК, получение иммуносорбента ПАБЦ-ТГ:аТГ, вы-
деление высокомолекулярной ДНК, обработка ДНК рестрикционными эндо-
нуклеазами, электрофорез продуктов гидролиза ДНК рестрикционными эн-
донуклеазами. Гибридизация нейлоновых фильтров “Biodan”, содержащих
фрагменты ДНК с
32
Р-меченой кДНК, полимеразная цепная реакция.
Полученные результаты и их новизна:
получен иммуносорбент
ПАБЦ-ТГ:аТГ. Определен размер популяции индивидуальных ТГ полирибо-
сом. Показано, что при папиллярной аденокарциноме наблюдается снижение
содержания индивидуальных ТГ полирибосом.
При папиллярной аденокарциноме выявлены хромосомные аберрации,
что приводит к генетической нестабильности, частота хромосомных аберра-
ций составляет 2,8%. Показано, что при папиллярной аденокарциноме про-
исходит нарушение регуляции экспрессии гена ТГ на уровне синтеза мРНК,
т.е. на уровне транскрипции.
Практическая значимость:
введение в практику молекулярно-
генетических методов исследований опухолей щитовидной железы способ-
ствует более полному пониманию механизма опухолеобразования, что явля-
ется существенным критерием прогноза исхода заболевания.
Степень внедрения и экономическая эффективность:
результаты ис-
следований могут быть использованы при разработке подходов для ранней
диагностики опухолей щитовидной железы, а также при чтении курсов моле-
кулярной биологии и биохимии на биологических факультетах Университе-
тов и курсах эндокринологии медицинских институтов.
Область применения:
биохимия, молекулярная биология, биотехноло-
гия, медицина, эндокринология.
21
THE RESUME
Thesis of Mamatkulov Donier Anvarovich on the scientific degree competition of
the doctor of philosophy in biology on specialty 03.00.04-Biochemistry,
subject: "
Structurally functional organization and laws expression of
thyroglobulin gene at cancerogenesis in cells of the thyroid gland”
Key words:
a thyroid gland, thyroglobulin, TG polyribosomes, immuno-
sorbent, methylation, RNA, DNA, expression, papillary adenocarcinome, follicular
adenocarcinome.
Subjects of research:
samples DNA received from blood of sick and healthy
donors, the thyroid glands of patients removed during operation concerning vari-
ous tumors.
Purpose of work:
studying structurally - functional features and laws expres-
sion TG gene at various tumors of a thyroid gland, studying of the molecular-
genetic mechanism of formation of tumors of a thyroid gland, studying of in-
fringements of regulation expression TG gene and creation of theoretical base for
early diagnostics of these diseases.
Methods of researches:
allocation of polyribosomes by a magnesium meth-
od, allocation total RNA, reception of immunosorbent PABC-TG:аTG, allocation
high-molecular DNA, processing DNA restriction endonucleases, electrophoresis
products of hydrolysis DNA by restriction endonucleases, hybridization of the ny-
lon filters " Biodan " containing fragments DNA with
32
Р- marked cDNA, poly-
merase chain reaction.
The results obtained and their novelty:
it is received immunosorbent
PABC-TG:аTG. The size of a population individual TG polyribosomes is deter-
mined Is shown, that at papillary adenocarcinome decrease of the maintenance in-
dividual TG polyribosomes is observed. At papillary adenocarcinome
chromoso-
mal aberrations that leads to genetic instability are revealed, frequency of chromo-
somal aberrations makes 2,8 %. It is shown, that at papillary adenocarcinome occur
infringement of regulation expression TG gene at a level of synthesis mRNA, i.e.
at a level of a transcription.
Practical value:
Introduction in practice of molecular-genetic methods of re-
searches of tumors of a thyroid gland stimulate more full understanding of the
mechanism cancerogenesis, that is essential criterion of the forecast of an outcome
of disease.
Degree of embed and economic effectivity:
Results of researches can be
used by development of approaches for early diagnostics of tumors of a thyroid
gland, and also at reading rates of molecular biology and biochemistry of hor-
mones at biological faculties of Universities, and rates endocrinology in medical
institutes.
Field of application:
biochemistry, molecular biology, biotechnology, medi-
cine, endocrinology.
