Последние несколько десятков лет биоактивные стекла (БС) рассматриваются в качестве оптимальных материалов для остеозамещения благодаря их способности связываться как с твердыми, так и с мягкими тканями, создавая при этом стабильный интерфейс, а также оказывая содействие жизнеспособности клеток, регенерации здоровых тканей и ангиогенезу [2, 5, 6, 13, 16, 18]. По сравнению с гидроксиаппатитами биостекло и стеклокерамика (биоситаллы) после имплантации в костный дефект не инкапсулируются, а находятся в прямом контакте с костной тканью. По данным литературы прямая связь клеток-предшественников и остеобластов с поверхностью биостекла обеспечивается ионами Si и Са, выделяющимися в процессе растворения биостекла и контролирующими прикрепление клеток к поверхности биоматериала [17,21].
Эпоха БС началась в 1969 году с изобретения первой биоактивной композиции, предложенной доктором Т.К. Гринли на кафедре ортопедии Университета Флориды и известной под названием 45S5 Bioglass® (45SiO2- 24,5CaO-24,5Na2O-6P2O5 мас.%). [15]. В его исследованиях было продемонстрировано, что биоактивный механизм основан на ионном растворении стекла и приводит к остеоинтеграции и остеогенетическому ответу, что приводит к ускорению регенеративных путей [14,15].
Одним из представителей такого биостекла является натрий-калиевое силикофосфатное стекло (47.5 SiO2-10 Na2O-10 K2O-10 MgO-20 CaO-2.5 P2O5 моль.%), которое получило название 47,5В и первоначально было разработанно в
Туринском политехническом университете (Италия) для потенциального использования в качестве остеозамещающего материала [21].
Предыдущие исследования 47.5B, как in vitro, так и in vivo, выявили безопасность материала [1, 3, 19], его высокие биоактивные, термические и технологические свойства [9, 10, 11], что свидетельствует о высоком потенциале использования его в качестве основного материала для производства трехмерных пористых заменителей кости с адекватными механическими свойствами [2, 4, 7, 8,
10] и повышенной способностью к образованию гидроксиапатита [12, 20, 21].
Таким образом, все эти многообещающие результаты предыдущих исследований мотивировали необходимость биологической оценки материала.
Целью данной экспериментальной работы явилось изучение биосовместимости силикофосфатного стекла 47,7В и влияние его на регенерацию костной ткани.
Материалы и методы.
Экспериментальные исследования были проведены в Межведомственном исследовательском центре Ташкентской медицинской академии. Разрешение на проведение тестов in vivo было получено Министерством здравоохранения Узбекистана (сертификат выдан Межведомственному исследовательскому центру Ташкентской медицинской академии, Узбекистан, справка № 3 от 13 января 2020 года).
Используемое в данной работе Силикофосфатное стекло 47,5В (47,5SiO2- 10Na2O-10K2O-10MgO-20CaO-2,5P2O5 мол.%) было получено было получено стандартным методом плавки в платиновом тигле следующим образом. Сырые исходные вещества (SiO2, Na2CO3, K2CO3, (MgCO3)4·Mg(OH)2·5H2O, CaCO3 и Ca3(PO4)2 - высокочистые порошки, приобретенные у Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), гомогенно смешивали и плавили в открытом виде в платиновом тигле при температуре 1500°С в течение 30 мин. Затем сплав был охлажден в деионизированной воде для получения фритты, которая была измельчена аппартом Pulverisette 0 (Fritsch, Идар-Оберштайн, Германия) и просеяна с
помощью сита из нержавеющей стали (Giuliani Technology Srl, Турин, Италия) с получением конечного продукта с частицами менее 32 мкм [19, 9, 10].
Эксперимент был проведен на 24 кроликах-самцах породы шиншилла с исходной массой тела 2500,0–3000,0 г. До начала эксперимента все животные были помещены в карантин и содержались в одинаковых условиях и на обычном рационе. В эксперимент были включены только здоровые особи. Рандомным методом они были разделены на четыре группы (по шесть голов в каждой). Всем животным была проведена операция по созданию искусственного дефекта в бедренной кости с последующим заполнением дефекта силикофосфатным стеклом 47.5B. Исследование проводили в соответствии с международными требованиями о гуманном отношении к лабораторным животным, соблюдая правила «Европейской конвенции защиты позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях» (Страсбург, 1986), Протокол экспериментов на животных утвержден Этическим Комитетом (протокол №4 от 26 декабря 2020 г.).
Ход операции. После взвешивания кролика в ушную вену особи медленно вводили заранее подготовленный 10% раствор уретана из расчета 0,8-1 мг/кг. После достижения глубокого наркоза животное фиксировали на операционном столе и местно в верхнюю часть голени вводили 2% лидокаин. Операционное поле обрабатывали дезинфицирующим раствором, сбривали шерсть, открыв доступ к плоской поверхности верхней части голени. Далее, сделав разрез мягких тканей и послойно раскрыв их, бором создавали искусственный дефект (отверстие) диаметром 10 мм. После заполнения дефекта 47.5B осуществляли послойное зашивание раны кетгутом.
После операции особи содержались индивидуально. В ходе эксперимента изучалось общее состояние животных, потребление корма и воды, изменение массы тела, особенности их поведения, интенсивность и характер двигательной активности, частота и глубина дыхательных движений, состояние шерстного и кожного покрова в области раны. Сроки наблюдения составили 1, 2, 3 и 6 мес.
По истечении сроков наблюдения каждой стадии имплантации испытуемых животных умерщвляли немедленным обезглавливанием. Для последующих морфологических исследований выделяли бедренную кость с дефектом у каждой особи.
а 
б 
в 
г Рисунок 1: Диафизальная часть бедренной кости кролика после замещения
искусственного дефекта: а, б, в, г – извлеченные бедренные кости через 1, 2, 3 и 6 месяцев после операции соответственно.
Далее фрагменты костей бедра фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Далее, для размягчения их декальцинировали в растворе 4% азотной кислоты и обезвоживали в спиртах возрастающей крепости, после чего заключали в парафин. Из полученных парафиновых блоков на микротоме изготавливали серийные гистологические срезы толщиной 7–8 мкм, которые окрашивали железным гематоксилином Вейгерта и эозином.
Готовые препараты оценивали под бинокулярным микроскопом LEIKA (Германия) и фотографировали фотоаппаратом серии HM-35.
Результаты собственных исследований.
Поскольку достижение полноценной целости кости от момента механического повреждения костной пластики до завершения репаративной регенерации требует определенного времени, в наших сериях экспериментов мы выбрали сроки исследования в 1, 2, 3 и 6 месяцев.
Изучение регенерации кости при использовании 47.5B через 1 месяц выявило в фрагментах костной ткани сплошь элементы красного костного мозга с обильной васкуляризацией. При большем увеличении отмечались примитивные костные балочки, погруженные в густую фиброретикулярную строму в области дефекта (рис. 2).
Через 2 месяца после операции восстановления костного дефекта силикофосфатным стеклом 47.5B во фрагментах компактной костной ткани можно отметить участки нарастания плотности и наличие единичных остеоцитов (рис. 3).
а б
Рисунок 2. Фрагменты компактной костной ткани через 1 месяц после операции: 1 - примитивные костные балочки, 2 – сосуды, 3 - элементы красного костного мозга.
б
Рисунок 3. Фрагменты компактной костной ткани через 2 месяца после операции:
1- глыбки остеопластического порошка, 2 – остеоциты.
С увеличением сроков после операции (3 месяца) отмечается остеогенная потенция в области имплантации, о чем свидетельствует обильная васкуляризация и гиперемия сосудов в области дефекта, восстановленного 47.5B. На поперечном срезе при большем увеличении в поле зрения определяются слабо обызвествлённые участки, замещающиеся плотной костной массой (рис. 4). Можно увидеть новую кость с единичными остеоцитами.
а б
Рисунок 4. Фрагменты компактной костной ткани через 3 месяца после операции:
1 - новообразованная кость, 2 – обызвествлённые участки, 3- кровенаполненные сосуды.
а б
Рисунок 5. Фрагменты компактной костной ткани через 6 месяцев после операции:
1 - новая кость, 2 - материнская кость, 3 – кристаллики остеопластического вещества.
Через 6 месяцев после операции на поперечном срезе диафизальной части бедренной кости в области дефекта, имплантированного силикофосфатного стекла 47.5B, можно увидеть костную ткань с равномерной интенсивностью уплотнения. Под большим увеличением отмечаются отчетливые границы новообразованной кости бледно розового цвета и материнской кости более густой окраски по периферии. Число остеоцитов умеренное (рис. 5).
Обсуждение.
Исследования показали, что на ранних сроках (1 месяц) процесс заживления дефекта, имплантированного силикофосфатным стеклом 47.5B, характеризуется обильной васкуляризацией, что свидетельствует о высокой костной регенерационной способности. С увеличением сроков заживления отмечается усиление репаративной регенераторной способности костной ткани в области дефекта, которая выражается в нарастании плотности костной ткани с наличием зрелых остеоцитов. Полученные нами данные соответствуют результатам экспериментальных исследований изучения биосовместимости местного биоактивного стекла пастообразной формы [9]. Так, через месяц после заполнения искусственного дефекта пастообразным биоактивным стеклом отмечалось частичное сращение биоматериала с костными балочками материнской кости. С увеличением сроков после имплантации интенсивность сращения биаматериала с материнской костью увеличивалась и через 3 месяца можно было увидеть примитивные балочки новообразованной кости.
МорфПоследние несколько десятков лет биоактивные стекла (БС) рассматриваются в качестве оптимальных материалов для остеозамещения благодаря их способности связываться как с твердыми, так и с мягкими тканями, создавая при этом стабильный интерфейс, а также оказывая содействие жизнеспособности клеток, регенерации здоровых тканей и ангиогенезу [2, 5, 6, 13, 16, 18]. По сравнению с гидроксиаппатитами биостекло и стеклокерамика (биоситаллы) после имплантации в костный дефект не инкапсулируются, а находятся в прямом контакте с костной тканью. По данным литературы прямая связь клеток-предшественников и остеобластов с поверхностью биостекла обеспечивается ионами Si и Са, выделяющимися в процессе растворения биостекла и контролирующими прикрепление клеток к поверхности биоматериала [17,21].
Эпоха БС началась в 1969 году с изобретения первой биоактивной композиции, предложенной доктором Т.К. Гринли на кафедре ортопедии Университета Флориды и известной под названием 45S5 Bioglass® (45SiO2- 24,5CaO-24,5Na2O-6P2O5 мас.%). [15]. В его исследованиях было продемонстрировано, что биоактивный механизм основан на ионном растворении стекла и приводит к остеоинтеграции и остеогенетическому ответу, что приводит к ускорению регенеративных путей [14,15].
Одним из представителей такого биостекла является натрий-калиевое силикофосфатное стекло (47.5 SiO2-10 Na2O-10 K2O-10 MgO-20 CaO-2.5 P2O5 моль.%), которое получило название 47,5В и первоначально было разработанно в
Туринском политехническом университете (Италия) для потенциального использования в качестве остеозамещающего материала [21].
Предыдущие исследования 47.5B, как in vitro, так и in vivo, выявили безопасность материала [1, 3, 19], его высокие биоактивные, термические и технологические свойства [9, 10, 11], что свидетельствует о высоком потенциале использования его в качестве основного материала для производства трехмерных пористых заменителей кости с адекватными механическими свойствами [2, 4, 7, 8,
10] и повышенной способностью к образованию гидроксиапатита [12, 20, 21].
Таким образом, все эти многообещающие результаты предыдущих исследований мотивировали необходимость биологической оценки материала.
Целью данной экспериментальной работы явилось изучение биосовместимости силикофосфатного стекла 47,7В и влияние его на регенерацию костной ткани.
Материалы и методы.
Экспериментальные исследования были проведены в Межведомственном исследовательском центре Ташкентской медицинской академии. Разрешение на проведение тестов in vivo было получено Министерством здравоохранения Узбекистана (сертификат выдан Межведомственному исследовательскому центру Ташкентской медицинской академии, Узбекистан, справка № 3 от 13 января 2020 года).
Используемое в данной работе Силикофосфатное стекло 47,5В (47,5SiO2- 10Na2O-10K2O-10MgO-20CaO-2,5P2O5 мол.%) было получено было получено стандартным методом плавки в платиновом тигле следующим образом. Сырые исходные вещества (SiO2, Na2CO3, K2CO3, (MgCO3)4·Mg(OH)2·5H2O, CaCO3 и Ca3(PO4)2 - высокочистые порошки, приобретенные у Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), гомогенно смешивали и плавили в открытом виде в платиновом тигле при температуре 1500°С в течение 30 мин. Затем сплав был охлажден в деионизированной воде для получения фритты, которая была измельчена аппартом Pulverisette 0 (Fritsch, Идар-Оберштайн, Германия) и просеяна с
помощью сита из нержавеющей стали (Giuliani Technology Srl, Турин, Италия) с получением конечного продукта с частицами менее 32 мкм [19, 9, 10].
Эксперимент был проведен на 24 кроликах-самцах породы шиншилла с исходной массой тела 2500,0–3000,0 г. До начала эксперимента все животные были помещены в карантин и содержались в одинаковых условиях и на обычном рационе. В эксперимент были включены только здоровые особи. Рандомным методом они были разделены на четыре группы (по шесть голов в каждой). Всем животным была проведена операция по созданию искусственного дефекта в бедренной кости с последующим заполнением дефекта силикофосфатным стеклом 47.5B. Исследование проводили в соответствии с международными требованиями о гуманном отношении к лабораторным животным, соблюдая правила «Европейской конвенции защиты позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях» (Страсбург, 1986), Протокол экспериментов на животных утвержден Этическим Комитетом (протокол №4 от 26 декабря 2020 г.).
Ход операции. После взвешивания кролика в ушную вену особи медленно вводили заранее подготовленный 10% раствор уретана из расчета 0,8-1 мг/кг. После достижения глубокого наркоза животное фиксировали на операционном столе и местно в верхнюю часть голени вводили 2% лидокаин. Операционное поле обрабатывали дезинфицирующим раствором, сбривали шерсть, открыв доступ к плоской поверхности верхней части голени. Далее, сделав разрез мягких тканей и послойно раскрыв их, бором создавали искусственный дефект (отверстие) диаметром 10 мм. После заполнения дефекта 47.5B осуществляли послойное зашивание раны кетгутом.
После операции особи содержались индивидуально. В ходе эксперимента изучалось общее состояние животных, потребление корма и воды, изменение массы тела, особенности их поведения, интенсивность и характер двигательной активности, частота и глубина дыхательных движений, состояние шерстного и кожного покрова в области раны. Сроки наблюдения составили 1, 2, 3 и 6 мес.
По истечении сроков наблюдения каждой стадии имплантации испытуемых животных умерщвляли немедленным обезглавливанием. Для последующих морфологических исследований выделяли бедренную кость с дефектом у каждой особи.
а б в г Рисунок 1: Диафизальная часть бедренной кости кролика после замещения
искусственного дефекта: а, б, в, г – извлеченные бедренные кости через 1, 2, 3 и 6 месяцев после операции соответственно.
Далее фрагменты костей бедра фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Далее, для размягчения их декальцинировали в растворе 4% азотной кислоты и обезвоживали в спиртах возрастающей крепости, после чего заключали в парафин. Из полученных парафиновых блоков на микротоме изготавливали серийные гистологические срезы толщиной 7–8 мкм, которые окрашивали железным гематоксилином Вейгерта и эозином.
Готовые препараты оценивали под бинокулярным микроскопом LEIKA (Германия) и фотографировали фотоаппаратом серии HM-35.
Результаты собственных исследований.
Поскольку достижение полноценной целости кости от момента механического повреждения костной пластики до завершения репаративной регенерации требует определенного времени, в наших сериях экспериментов мы выбрали сроки исследования в 1, 2, 3 и 6 месяцев.
Изучение регенерации кости при использовании 47.5B через 1 месяц выявило в фрагментах костной ткани сплошь элементы красного костного мозга с обильной васкуляризацией. При большем увеличении отмечались примитивные костные балочки, погруженные в густую фиброретикулярную строму в области дефекта (рис. 2).
Через 2 месяца после операции восстановления костного дефекта силикофосфатным стеклом 47.5B во фрагментах компактной костной ткани можно отметить участки нарастания плотности и наличие единичных остеоцитов (рис. 3).
а б
Рисунок 2. Фрагменты компактной костной ткани через 1 месяц после операции: 1 - примитивные костные балочки, 2 – сосуды, 3 - элементы красного костного мозга.
б
Рисунок 3. Фрагменты компактной костной ткани через 2 месяца после операции:
1- глыбки остеопластического порошка, 2 – остеоциты.
С увеличением сроков после операции (3 месяца) отмечается остеогенная потенция в области имплантации, о чем свидетельствует обильная васкуляризация и гиперемия сосудов в области дефекта, восстановленного 47.5B. На поперечном срезе при большем увеличении в поле зрения определяются слабо обызвествлённые участки, замещающиеся плотной костной массой (рис. 4). Можно увидеть новую кость с единичными остеоцитами.
а б
Рисунок 4. Фрагменты компактной костной ткани через 3 месяца после операции:
1 - новообразованная кость, 2 – обызвествлённые участки, 3- кровенаполненные сосуды.
а б
Рисунок 5. Фрагменты компактной костной ткани через 6 месяцев после операции:
1 - новая кость, 2 - материнская кость, 3 – кристаллики остеопластического вещества.
Через 6 месяцев после операции на поперечном срезе диафизальной части бедренной кости в области дефекта, имплантированного силикофосфатного стекла 47.5B, можно увидеть костную ткань с равномерной интенсивностью уплотнения. Под большим увеличением отмечаются отчетливые границы новообразованной кости бледно розового цвета и материнской кости более густой окраски по периферии. Число остеоцитов умеренное (рис. 5).
Обсуждение.
Исследования показали, что на ранних сроках (1 месяц) процесс заживления дефекта, имплантированного силикофосфатным стеклом 47.5B, характеризуется обильной васкуляризацией, что свидетельствует о высокой костной регенерационной способности. С увеличением сроков заживления отмечается усиление репаративной регенераторной способности костной ткани в области дефекта, которая выражается в нарастании плотности костной ткани с наличием зрелых остеоцитов. Полученные нами данные соответствуют результатам экспериментальных исследований изучения биосовместимости местного биоактивного стекла пастообразной формы [9]. Так, через месяц после заполнения искусственного дефекта пастообразным биоактивным стеклом отмечалось частичное сращение биоматериала с костными балочками материнской кости. С увеличением сроков после имплантации интенсивность сращения биаматериала с материнской костью увеличивалась и через 3 месяца можно было увидеть примитивные балочки новообразованной кости.
Морфологические исследования костных тканей, имплантированных различными видами биоактивного стекла, свидетельствуют о начале интенсивной регенерации остеоидной ткани через 3 месяца после операции.
Формирование на поверхности имплантата активных остеобластов с последующим формированием костной ткани свидетельствует о биоактивности исследуемого материала. А отсутствие признаков воспаления, аллергической реакции и деструктивных изменений в окружающих дефект тканях свидетельствует о биосовместимости изучаемого силикофосфатного стекла.
Выводы.
Таким образом, по результатам полученных экспериментальных данных исследуемое силикофосфатное стекло 47,5В характеризуется выраженной остеоинтеграцией и остеокондуктивностью, обладает биосовместимостью, что позволяет использовать его в качестве остеозамещающего материла для восстановления костных дефектов.ологические исследования костных тканей, имплантированных различными видами биоактивного стекла, свидетельствуют о начале интенсивной регенерации остеоидной ткани через 3 месяца после операции.
