➤

Применение культур клеток (нормальных и злокачественно трансформированных) для скрининга биологически активных веществ и получения моноклональных антител

Аннотация

Актуальность и востребованность темы диссертации. Одной из актуальных задач биоорганической химии, клеточной биологии и фармакологии является выявление новых соединений, обладающих противоопухолевым действием и другими биологическими активностями. На протяжении многих лет в научных лабораториях республики проводятся систематические исследования по выделению и синтезу различных классов соединений и изучению их фармакологической активности, часть соединений протестированы на различные виды биологической активности, такие как антиаритмическая, холинэстеразная, эстрогенная и противовоспалительная, однако не изучена их цитотоксическая активность.
Скрининг цитотоксической активности химических соединений, лекарственных препаратов, медицинских изделий in vitro на различных культурах клеток является составной частью доклинических исследований по международным требованиям GLP (Good Laboratory Practice). Методы исследования веществ in vitro позволяют значительно удешевить и сократить сроки предварительного исследования новых химических соединений.
Такие проблемы как дифференцировка, канцерогенез, клеточная подвижность, пролиферация, передача наследственной информации, регуляция экспрессии генов и другие решаются в мировой науке, в основном с применением клеточных культур. Клеточные культуры имеют также большое значение для решения прикладных задач медицины и сельского хозяйства. В частности, к основным прикладным задачам следует отнести массовое промышленное производство вакцин и физиологически активных соединений, получение моноклональных антител методами гибридомной технологии, лечение тяжелых заболеваний методами генотерапии и клеточной заместительной терапии.
В связи с вышеизложенным выявление соединений, ингибирующих рост опухолевых клеток с низкой токсичностью для нормальных клеток и веществ, пролиферирующих рост нормальных клеток, но не раковых для регенеративной медицины, а также получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к эритропоэтину является актуальной.
Данное диссертационное исследование в определенной степени служит выполнению задач, предусмотренных в Постановлениях Президента Республики Узбекистан от 28 ноября 2011 года № ПП-1652 «О мерах по дальнейшему углублению реформирования системы здравоохранения» и Кабинета Министров Республики Узбекистан от 29 марта 2012 г. № 91 «О мерах по дальнейшему укреплению материально-технической базы и совершенствованию организации деятельности медицинских учреждений», а также другим нормативно-правовым документам.
Целью исследования является поиск цитостатических соединений -ингибиторов роста раковых клеток, низкотоксичных для нормальных клеток, и соединений, ускоряющих рост нормальных клеток, но не рост раковых клеток, а также получение гибридных клеток (гибридом), продуцирующих моноклональные антитела к рекомбинантному эритропоэтину.
Научная новизна исследования заключается в том, что впервые:
выявлена новая фармакологическая активность ряда соединений и экстрактов;
доказано, что экстракты - из растений рода Convolvulus, растений Vinca major и Arundo donax, а также грибов-эндофитов, паразитирующих на растениях рода Vinca, обладают избирательной цитотоксической активностью на культурах раковых клеток;
выявлен селективный ингибитор роста клеток рака гортани - N-бензил конвольвин - производное алкалоида конвольвина, выделенного из активного экстракта растения рода Convolvulus, который не ингибирует рост клеток рака молочной железы, шейки матки и низкотоксичный для нормальных клеток;
выявлены селективные ингибиторы роста раковых клеток - п-С1-ацетилфенилуксусная кислота, n-Cl-феноксиуксусная кислота и йодметилат фенилгидразона норфлуорокурарина;
установлено, что хлорсодержащие алкалоиды, в частности производные конвольвина и винканина, проявляют высокую цитотоксическую активность на культурах раковых клеток на уровне препарата цисплатина;
разработан способ получения культур мезенхимальных клеток;
доказано, что фитостероид - экдистерон увеличивает пролиферацию «нормальных» клеток кожи - фибробластов и кератиноцитов, и не вызывает пролиферацию клеток рака гортани, рака молочной железы и шейки матки;
установлено, что экдистерон совместно с аллофибробластами способствует увеличению пролиферации аутоэпидермоцитов и эпителизации ткани, что может быть использовано в терапии ожоговых ран;
получены гибридомы - продуценты моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину.
выводы
1. Изучена цитотоксическая активность экстрактов растений рода Vinca и грибов эндофитов, паразитирующих на растениях рода Vinca на культурах клеток рака гортани - НЕр-2, рака шейки матки - HeLa, рака молочной железы- HBL-100 и на нормальных клетках фибробластов, гепатоцитов. Установлено, что экстракты как растений, так и грибов обладают цитотоксической активностью. При этом экстракт из корней Vinca major проявляет большую специфичность к клеткам HcLa, а экстракт грибов эндофитов Alternaria sp., паразитирующих на листьях Vinca erecta обладает большей специфичностью к клеткам HBL-100 при низкой цитотоксичности для нормальных клеток.
2. Изучена цитотоксическая активность суммарных фракций алкалоидов из растений родов Convolvulus, Arundo и Buxus. Установленно, что алкалоиды из надземной части растения Convolvulus krauseanus ингибируют рост клеток НЕр-2, а из корней Arundo donax ингибируют рост клеток НЕр-2 и HeLa, при низкой токсичности для фибробластов.
3. Изучена цитотоксическая активность тропановых алкалоидов из растений рода Convolvulus и их производных. Установлено, что цитотоксическая активность зависит от природы радикала при атоме азота тропанового остатка. Наибольшей специфичностью обладает N-бензил конвольвин, ингибируя рост клеток НЕр-2 (1С$о = 12,3 мМ/л) с низкой токсичностью для клеток фибробластов (ICso= 32,8 мМ/л).
4. Изучена цитотоксическая активность норфлуорокурарина алкалоида из растения Vinca erecta и его синтетических производных. Установлено, что наибольшей избирательностью обладает йодметилат фенилгидразона норфлуорокурарина, ингибируя рост клеток НЕр-2, HcLa и HBL-100 (IC50 =19,1 мМ/л для всех раковых клеток) при низкой токсичности для фибробластов (IC50 = 95,5 мМ/л).
5. Изучена цитотоксическая активность производных фенил- и феноксиуксусных кислот. Выявлен селективный ингибитор роста клеток рака гортани - n-Cl-феноксиуксусная кислота (1С50 = 5,2-52 мМ/л), низкотоксичный для нормальных клеток (IC50 = 442 мМ/л). п-С1-ацетилфенилуксусная кислота ингибирует рост клеток Hep-2, HeLa и HBL-100 (IC50 = 4,7-5 мМ/л) и низкотоксичен для нормальных клеток (IC50 = 94 мМ/л).
6. Изучена цитотоксическая и пролиферативная активность фитостероидов. Установлено, что фитостероид - экдистерон подавляет рост клеток Hep-2, HeLa и HBL-100 на 15% и при этом вызывает пролиферацию роста нормальных клеток фибробластов на 80%.
7. Оптимизирован способ получения тканеинженерной конструкции кожи, состоящей из клеток фибробластов на коллагеновой подложке, для лечения ожоговых ран. Показано, что использование экдистерона совместно с тканеинженерной конструкцией, в 2 раза ускоряет эпителизацию ожоговых ран.
8. Получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к рекомбинантному эритропоэтину. Отобраны два наиболее перспективных субклона гибридных клеток-продуцентов, которые в дальнейшем использованы для получения препаративных количеств моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину.
9. Выделены из асцитной жидкости, очищены и охарактеризованы моноклональные антитела к рекомбинантному эритропоэтину. Установлено, что моноклональные антитела к рекомбинантному эритропоэтину перекрёстно взаимодействуют как с плазменным эритропоэтином, так и с рекомбинантным, и относятся к классу IgG. Титр антител в асцитной жидкости составил 1 х 107, в культуральной - 2 х 104. Высокий титр 4 х 107 показала суммарная очищенная фракция МКАТ-ЭПО.
10. Разработан метод выделения эритропоэтина из плацентарной крови человека с использованием иммуносорбента, синтезированного на основе моноклональных антител к эритропоэтину человека.
11. Разработаны и утверждены Методические Рекомендации «Оценка цитотоксичности лекарственных средств, изделий медицинского назначения, косметических средств, химических соединений, пестицидов и средств для ветеринарии» (8Н-Р/18 от 02.03.2016г.).

Тип источника: Авторефераты
Годы охвата с 1992
inLibrary
Google Scholar
Каталог авторефератов
Выпуск:
Отрасль знаний
CC BY f
1-93
38

Скачивания

Данные скачивания пока недоступны.
Поделиться
Скачать
Цеомашко, Н. (2023). Применение культур клеток (нормальных и злокачественно трансформированных) для скрининга биологически активных веществ и получения моноклональных антител. Каталог авторефератов, 1(1), 1–93. извлечено от https://inlibrary.uz/index.php/autoabstract/article/view/48224
1
Цитаты
Crossref
Сrossref
Scopus
Scopus
Google
Google

Ключевые слова:

Ультура клеток / скрининг противоопухолевых препаратов / трехмерные модели клеточных культур

Аннотация

Актуальность и востребованность темы диссертации. Одной из актуальных задач биоорганической химии, клеточной биологии и фармакологии является выявление новых соединений, обладающих противоопухолевым действием и другими биологическими активностями. На протяжении многих лет в научных лабораториях республики проводятся систематические исследования по выделению и синтезу различных классов соединений и изучению их фармакологической активности, часть соединений протестированы на различные виды биологической активности, такие как антиаритмическая, холинэстеразная, эстрогенная и противовоспалительная, однако не изучена их цитотоксическая активность.
Скрининг цитотоксической активности химических соединений, лекарственных препаратов, медицинских изделий in vitro на различных культурах клеток является составной частью доклинических исследований по международным требованиям GLP (Good Laboratory Practice). Методы исследования веществ in vitro позволяют значительно удешевить и сократить сроки предварительного исследования новых химических соединений.
Такие проблемы как дифференцировка, канцерогенез, клеточная подвижность, пролиферация, передача наследственной информации, регуляция экспрессии генов и другие решаются в мировой науке, в основном с применением клеточных культур. Клеточные культуры имеют также большое значение для решения прикладных задач медицины и сельского хозяйства. В частности, к основным прикладным задачам следует отнести массовое промышленное производство вакцин и физиологически активных соединений, получение моноклональных антител методами гибридомной технологии, лечение тяжелых заболеваний методами генотерапии и клеточной заместительной терапии.
В связи с вышеизложенным выявление соединений, ингибирующих рост опухолевых клеток с низкой токсичностью для нормальных клеток и веществ, пролиферирующих рост нормальных клеток, но не раковых для регенеративной медицины, а также получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к эритропоэтину является актуальной.
Данное диссертационное исследование в определенной степени служит выполнению задач, предусмотренных в Постановлениях Президента Республики Узбекистан от 28 ноября 2011 года № ПП-1652 «О мерах по дальнейшему углублению реформирования системы здравоохранения» и Кабинета Министров Республики Узбекистан от 29 марта 2012 г. № 91 «О мерах по дальнейшему укреплению материально-технической базы и совершенствованию организации деятельности медицинских учреждений», а также другим нормативно-правовым документам.
Целью исследования является поиск цитостатических соединений -ингибиторов роста раковых клеток, низкотоксичных для нормальных клеток, и соединений, ускоряющих рост нормальных клеток, но не рост раковых клеток, а также получение гибридных клеток (гибридом), продуцирующих моноклональные антитела к рекомбинантному эритропоэтину.
Научная новизна исследования заключается в том, что впервые:
выявлена новая фармакологическая активность ряда соединений и экстрактов;
доказано, что экстракты - из растений рода Convolvulus, растений Vinca major и Arundo donax, а также грибов-эндофитов, паразитирующих на растениях рода Vinca, обладают избирательной цитотоксической активностью на культурах раковых клеток;
выявлен селективный ингибитор роста клеток рака гортани - N-бензил конвольвин - производное алкалоида конвольвина, выделенного из активного экстракта растения рода Convolvulus, который не ингибирует рост клеток рака молочной железы, шейки матки и низкотоксичный для нормальных клеток;
выявлены селективные ингибиторы роста раковых клеток - п-С1-ацетилфенилуксусная кислота, n-Cl-феноксиуксусная кислота и йодметилат фенилгидразона норфлуорокурарина;
установлено, что хлорсодержащие алкалоиды, в частности производные конвольвина и винканина, проявляют высокую цитотоксическую активность на культурах раковых клеток на уровне препарата цисплатина;
разработан способ получения культур мезенхимальных клеток;
доказано, что фитостероид - экдистерон увеличивает пролиферацию «нормальных» клеток кожи - фибробластов и кератиноцитов, и не вызывает пролиферацию клеток рака гортани, рака молочной железы и шейки матки;
установлено, что экдистерон совместно с аллофибробластами способствует увеличению пролиферации аутоэпидермоцитов и эпителизации ткани, что может быть использовано в терапии ожоговых ран;
получены гибридомы - продуценты моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину.
выводы
1. Изучена цитотоксическая активность экстрактов растений рода Vinca и грибов эндофитов, паразитирующих на растениях рода Vinca на культурах клеток рака гортани - НЕр-2, рака шейки матки - HeLa, рака молочной железы- HBL-100 и на нормальных клетках фибробластов, гепатоцитов. Установлено, что экстракты как растений, так и грибов обладают цитотоксической активностью. При этом экстракт из корней Vinca major проявляет большую специфичность к клеткам HcLa, а экстракт грибов эндофитов Alternaria sp., паразитирующих на листьях Vinca erecta обладает большей специфичностью к клеткам HBL-100 при низкой цитотоксичности для нормальных клеток.
2. Изучена цитотоксическая активность суммарных фракций алкалоидов из растений родов Convolvulus, Arundo и Buxus. Установленно, что алкалоиды из надземной части растения Convolvulus krauseanus ингибируют рост клеток НЕр-2, а из корней Arundo donax ингибируют рост клеток НЕр-2 и HeLa, при низкой токсичности для фибробластов.
3. Изучена цитотоксическая активность тропановых алкалоидов из растений рода Convolvulus и их производных. Установлено, что цитотоксическая активность зависит от природы радикала при атоме азота тропанового остатка. Наибольшей специфичностью обладает N-бензил конвольвин, ингибируя рост клеток НЕр-2 (1С$о = 12,3 мМ/л) с низкой токсичностью для клеток фибробластов (ICso= 32,8 мМ/л).
4. Изучена цитотоксическая активность норфлуорокурарина алкалоида из растения Vinca erecta и его синтетических производных. Установлено, что наибольшей избирательностью обладает йодметилат фенилгидразона норфлуорокурарина, ингибируя рост клеток НЕр-2, HcLa и HBL-100 (IC50 =19,1 мМ/л для всех раковых клеток) при низкой токсичности для фибробластов (IC50 = 95,5 мМ/л).
5. Изучена цитотоксическая активность производных фенил- и феноксиуксусных кислот. Выявлен селективный ингибитор роста клеток рака гортани - n-Cl-феноксиуксусная кислота (1С50 = 5,2-52 мМ/л), низкотоксичный для нормальных клеток (IC50 = 442 мМ/л). п-С1-ацетилфенилуксусная кислота ингибирует рост клеток Hep-2, HeLa и HBL-100 (IC50 = 4,7-5 мМ/л) и низкотоксичен для нормальных клеток (IC50 = 94 мМ/л).
6. Изучена цитотоксическая и пролиферативная активность фитостероидов. Установлено, что фитостероид - экдистерон подавляет рост клеток Hep-2, HeLa и HBL-100 на 15% и при этом вызывает пролиферацию роста нормальных клеток фибробластов на 80%.
7. Оптимизирован способ получения тканеинженерной конструкции кожи, состоящей из клеток фибробластов на коллагеновой подложке, для лечения ожоговых ран. Показано, что использование экдистерона совместно с тканеинженерной конструкцией, в 2 раза ускоряет эпителизацию ожоговых ран.
8. Получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к рекомбинантному эритропоэтину. Отобраны два наиболее перспективных субклона гибридных клеток-продуцентов, которые в дальнейшем использованы для получения препаративных количеств моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину.
9. Выделены из асцитной жидкости, очищены и охарактеризованы моноклональные антитела к рекомбинантному эритропоэтину. Установлено, что моноклональные антитела к рекомбинантному эритропоэтину перекрёстно взаимодействуют как с плазменным эритропоэтином, так и с рекомбинантным, и относятся к классу IgG. Титр антител в асцитной жидкости составил 1 х 107, в культуральной - 2 х 104. Высокий титр 4 х 107 показала суммарная очищенная фракция МКАТ-ЭПО.
10. Разработан метод выделения эритропоэтина из плацентарной крови человека с использованием иммуносорбента, синтезированного на основе моноклональных антител к эритропоэтину человека.
11. Разработаны и утверждены Методические Рекомендации «Оценка цитотоксичности лекарственных средств, изделий медицинского назначения, косметических средств, химических соединений, пестицидов и средств для ветеринарии» (8Н-Р/18 от 02.03.2016г.).


background image

БИООРГАНИК КИМЁ ИНСТИТУТИ ВА ЎЗБЕКИСТОН МИЛЛИЙ
УНИВЕРСИТЕТИ ҲУЗУРИДАГИ ФАН ДОКТОРИ ИЛМИЙ ДАРАЖАСИНИ
БЕРУВЧИ 16.07.2013 К/В/Т. 13.01 РАҚАМЛИ ИЛМИЙ КЕНГАШ
ЎСИМЛИК МОДДАЛАРИ КИМЁСИ ИНСТИТУТИ

ЦЕОМАШКО НАТАЛЬЯ ЕВГЕНЬЕВНА

БИОЛОГИК ФАОЛ МОДДАЛАР СКРИНИНГИ ВА МОНОКЛОНАЛ
АНТИТАНАЛАР ОЛИШ УЧУН ҲУЖАЙРА КУЛЬТУРАЛАРИДАН
(НОРМАЛ ВА ХАТАРЛИ ТРАНСФОРМАЦИЯЛАНГАН) ФОЙДАЛАНИШ

02.00.10 – Биоорганик кимё
(биология фанлари)

ДОКТОРЛИК ДИССЕРТАЦИЯСИ АВТОРЕФЕРАТИ ТОШКЕНТ–2016

1

УДК 573.6.086.83:57.083.3,576.5,612.017.1:616-097, 615.277.3


background image

Докторлик диссертацияси автореферати мундарижаси

Оглавление автореферата докторской диссертации

Content of the abstract of doctoral dissertation

Цеомашко Наталья Евгеньевна

Биологик фаол моддалар скрининги ва моноклонал антитаналар олиш учун

ҳужайра культураларидан (нормал ва хатарли

трансформацияланган)

фойдаланиш....………………………………….. 5

Цеомашко Наталья Евгеньевна

Применение

культур

клеток

(нормальных

и

злокачественно

трансформированных) для скрининга биологически активных веществ и
получения моноклональных антител………………………………… 33

Tseomashko Natalya Yevgenevna

Uzing cell cultures (normal and transformed malignantly) for screening
biologically

active

substances

and

obtaining

the

monoclonal

antibodies……………………………….……………………………….… 63

Эълон қилинган ишлар рўйхати

Список опубликованных работ
List of published works……………………………………………………… 90

2

БИООРГАНИК КИМЁ ИНСТИТУТИ ВА ЎЗБЕКИСТОН МИЛЛИЙ


background image

УНИВЕРСИТЕТИ ҲУЗУРИДАГИ ФАН ДОКТОРИ ИЛМИЙ
ДАРАЖАСИНИ БЕРУВЧИ 16.07.2013 К/В/Т. 13.01 РАҚАМЛИ
ИЛМИЙ КЕНГАШ
ЎСИМЛИК МОДДАЛАРИ КИМЁСИ ИНСТИТУТИ

ЦЕОМАШКО НАТАЛЬЯ ЕВГЕНЬЕВНА

БИОЛОГИК ФАОЛ МОДДАЛАР СКРИНИНГИ ВА МОНОКЛОНАЛ
АНТИТАНАЛАР ОЛИШ УЧУН ҲУЖАЙРА КУЛЬТУРАЛАРИДАН
(НОРМАЛ ВА ХАТАРЛИ ТРАНСФОРМАЦИЯЛАНГАН)
ФОЙДАЛАНИШ

02.00.10 – Биоорганик кимё
(биология фанлари)

ДОКТОРЛИК ДИССЕРТАЦИЯСИ АВТОРЕФЕРАТИ


background image

ТОШКЕНТ–2016

3

Докторлик

диссертацияси

мавзуси

Ўзбекистон

Республикаси

Вазирлар

Маҳкамаси ҳузуридаги Олий аттестация комиссиясида 30.09.2014/В2014.5.В69 рақам
билан рўйхатга олинган.

Докторлик диссертацияси Ўсимлик моддалари кимёси институтида бажарилган.

Диссертация автореферати уч тилда (ўзбек, рус, инглиз) Илмий кенгаш веб-саҳифасига
(http://ss.biochem.uz) ва “ZiyoNet” таълим ахборот тармоғида (www. ziyonet.uz)
жойлаштирилган.

Илмий маслаҳатчи: Азимова Шахноз Садыковна

биология фанлар доктори, профессор

Расмий оппонентлар: Ахунов Али Ахунович

биология фанлар доктори, профессор

Далимова Сурайё Нугмановна

биология фанлар доктори, профессор

Саитмуратова Огилжон Худайбергеновна

биология фанлар доктори, доцент

Етакчи ташкилот: Тошкент фармацевтика институти

Диссертация ҳимояси Биоорганик кимё институти ҳамда Ўзбекистон Миллий

университети ҳузуридаги 16.07.2013 К/В/8Т.13.01 рақамли Илмий кенгаш асосидаги бир
марталик Илмий кенгашнинг 2016 йил «___»__________куни соат___даги мажлисида бўлиб
ўтади. (Манзил: 100125, Тошкент ш., Мирзо Улуғбек кўч., 83. Тел 262 35 40, факс (99871) 262
70 63).

Докторлик диссертацияси билан Биоорганик кимё институти Ахборот-ресурс марказида

танишиш мумкин (Манзил: 100125, Тошкент ш., Мирзо Улуғбек кўч., 83. Тел.: 262 35 40,
факс (99871) 262 70 63; e-mail: asrarov54@mail.ru

Автореферат 2016 йил «____»______________да тарқатилди.

(2016 йил _____________даги__________рақамли реестр баённомаси)

А.С. Тўраев,


background image

Фан доктори илмий даражасини берувчи

Илмий кенгаш раиси, к.ф.д., профессор

М.И. Асраров,

Фан доктори илмий даражасини берувчи

Илмий кенгаш илмий котиби, б.ф.д., проф.

Д.А. Кадирова,

Фан доктори илмий даражасини берувчи

Илмий кенгаш ҳузуридаги илмий семинар

раиси, б.ф.д.

4

КИРИШ (докторлик диссертацияси аннотацияси)

Диссертация

мавзусининг

долзарблиги

ва

зарурати.

Турли

ўсмаларга қарши ҳамда бошқа биологик фаолликларга эга бўлган янги
бирикмаларни

аниқлаш

биоорганик

кимё,

ҳужайра

биологияси

ва

фармакологиянинг долзарб муаммоларидан биридир. Республикамизнинг бир
қанча илмий лабораторияларида кўп йиллар мобайнида систематик тарзда
турли фаол бирикмаларини ажратиш ва синтез қилиш, ушбу бирикмаларнинг
фармакологик фаоллигини аниқлаш бўйича ишлар амалга ошириб келинган
ва ушбу бирикмаларнинг оз қисминигина антиаритмик,

холинэстераза,

эстроген ва яллиғланишга қарши биологик фаолликлари синалган бўлиб,
уларнинг цитотоксик фаоллиги ҳозиргача ўрганилмаган.

Кимёвий

бирикмалар, доривор воситалар ва тиббиёт жиҳозларини турли ҳужайра
культураларида

in vitro

усулларида цитотоксик фаоллигининг

скрининги

Халқаро GLP (Good Laboratory Practice) талабларига биноан клиниколди
синовларининг таркибига киради. Моддаларнинг

in vitro

текшириш усуллари

янги кимёвий бирикмаларнинг дастлабки тадқиқоти

учун ҳаражатларни

камайтириш ва вақтни тежаш имконини беради.

Дифференцировка,

канцерогенез,

ҳужайра

ҳаракатчанлиги,

пролиферация, наслий маълумотни ўтказиш, генлар экспрессиясини назорат
қилиш каби муаммоларни ечишда жаҳон фанида, асосан, ҳужайра
культураларидан фойдаланилади. Шунингдек, ҳужайра культураси тиббиёт ва
қишлоқ хўжалигининг амалий муаммоларни ҳал қилишда катта аҳамиятга
эга. Хусусан, асосий амалий вазифаларга вакциналар ва физиологик фаол
бирикмаларни саноат миқёсида ишлаб чиқариш, гибридома технологиялари
ёрдамида моноклонал антитаналарни олиш, оғир хасталикларни генотерапия
ва ҳужайра терапияси ёрдамида даволаш кабилар киради.

Юқорида

айтиб

ўтилган

фикрларга боғлиқ равишда, нормал

ҳужайраларга нисбатан паст заҳарлиликка эга ва ўсма ҳужайралари ўсишини
ингибирловчи бирикмаларни ҳамда регенератив тиббиёт учун ўсма
ҳужайраларини эмас, балки нормал ҳужайралар пролиферациясини келтириб


background image

чиқарувчи моддаларни аниқлаш, эритропоэтинга моноклонал антитаналарни
ҳосил қилувчи гибридомаларни олиш долзарб саналади.

Ўзбекистон Республикаси Президентининг 2011 йил 28 ноябрдаги

ПҚ–1652-сон «Соғлиқни сақлаш тизимини ислоҳ қилишни янада
чуқурлаштириш чора-тадбирлари тўғрисида»ги ва Ўзбекистон Республикаси
Вазирлар Маҳкамасининг 2012 йил 29 мартдаги 91-сон «Тиббиёт
муассасаларининг моддий-техника базасини янада мустаҳкамлаш ва
фаолиятини ташкил этишни такомиллаштириш чора-тадбирлари тўғрисида»ги
қарорлари ҳамда мазкур фаолиятга тегишли бошқа меъёрий ҳуқуқий
ҳужжатларда белгиланган вазифаларни амалга оширишга ушбу диссертация
тадқиқоти муайян даражада хизмат қилади.

Тадқиқотнинг республика фан ва технологиялари ривожланиши

устувор йўналишларига боғлиқлиги.

Мазкур тадқиқот республика фан ва

5

технологиялар ривожланишининг VI. «Тиббиёт ва фармакология» устувор

йўналишига мувофиқ бажарилган.

Диссертация мавзуси бўйича хорижий илмий-тадқиқотлар шарҳи.

Ўсма ҳужайраларини ҳар бир типи учун юқори фаолликка бўлган
бирикмаларни аниқлашга ва цитотоксиклигини скрининг қилишга
йўналтирилган, шунингдек, заҳарлиликнинг специфик турларини кенг
ассортиментини тадқиқ қилиш, кимёвий бирикмалар ва дори воситаларини
клиниколди синовларини

in vitro

усуллари бўйича илмий изланишлар,

жаҳоннинг етакчи илмий марказлари ва олий таълим муассасаларида,
жумладан, Саломатлик Миллий институти (Мэриленд, АҚШ), Ўсма Миллий
институти (Роквилле, АҚШ), Патология институти (Сиэтл, АҚШ), Рокфеллер
университети (АҚШ), ЖССТ қошидаги ўсмаларни ўрганиш маркази
(Брюссель, Бельгия), Цитология институти (Санкт-Петербург, Россия),
Биоорганик кимё институти (Ўзбекистон); EURL ECVAM ва EPAA (Европа),
– JaCVAM (Япония), KoCVAM (Корея), Health Canada (Канада), ICATM
(АҚШ), Vitroscreen (Италия) олиб борилмоқда.

Турли ҳужайра культураларида ўсма ҳужайраларига танлаб таъсир

қилувчи моддаларни

in vitro

усулида аниқлаш бўйича жаҳонда олиб борилган

тадқиқотлар натижасида қатор, жумладан, қуйидаги илмий натижалар
олинган: ўсма ҳужайраларига танлаб таъсир қилувчи, асосан, ўсма
ҳужайраларда

мутант

оқсилларни

инактивациясини

чақирувчи

янги

воситалар – винтафолид (Merk&Co, АҚШ), эрлотиниб (Roche, Швейцария),
афатиниб (Boehringer ingelheim pharm. Inc., АҚШ), кризотиниб (Pfizer Inc.,
АҚШ) ва церитиниб (Novartis, АҚШ) каби доривор воситалар ишлаб
чиқилган, бевацизунаб (Pfizer Inc., АҚШ) ангиогенезни ингибирлаган; турли
антигенларга, шу жумладан, эритропоэтинга ҳам монокланал антитаналар
олинган («Roche», Швейцария, «Протеиновый контур», Россия).

Дунёда

in vitro

усулида кимёвий бирикмалар ва доривор воситаларнинг

скринингини

ўтказиш

бўйича

қатор,

жумладан,

қуйидаги

устувор


background image

йўналишларда тадқиқотлар олиб борилмоқда: онкологияда қўллаш учун ўсма
ҳужайраларини ўсишини тўхтатувчи, танлаб таъсир этувчи моддаларни

аниқлаш; регенератив тиббиёт учун нормал ҳужайралар ўсиши селектив

пролифераторларини аниқлаш; цитотоксикликни умумий ва специфик
турларини

белгилаш;

ҳужайра

даражасида

бирикмаларнинг

таъсир

механизмларини исботлаш.

Муаммонинг ўрганилганлик даражаси.

In vitro

усулларини қўллаб

ўсма ҳужайраларини ингибирловчи бирикмаларни аниқлаш ишлари ўтган
асрнинг 70-йиллари охирида R.I.Freshney, Т.Mosmann, K.Taylor, G.Taju каби
олимлар

томонидан

ўрганилган.

Регенератив

тиббиётда

ҳужайра

культураларидан фойдаланишни эса улардан олдин P.B.Medawar, J.Rheinwald,
Н.Green ва бошқалар йўлга қўйган, гибридома технологиялар ривожланиши
бўлса 80-йилларда Kohler ва Milstein бошланган. Ҳозирги

кунда ушбу

йўналишлар

жадал

ривожланмоқда,

масалан,

автоматлаштирилган

лабораторияларда янги бирикмалар скрининги (Рокфеллерлар университети
ва Саломатлик Миллий институти) 96

6

катакчали планшетларда эмас, балки 384, 1536 ёки 3456 катакчали

планшетларда HTS (high-throughput screening) деб номланувчи усулда амалга
оширилиб, бутун дунёдан олинган бирикмалар ўрганилмоқда (J.Agrestia,
X.Zhang, A.Florian).

МДҲ давлатларида одам ва ҳайвон ҳужайра культураларидаги

бирикмаларни скрининг қилишда М.Ю.Еропкин, Г.Георгиев, Н.Р.Тафришьян,
А.А.Алексеев, В.И.Шумаков, Е.В.Парфенова каби олимлар

ютуқларга

эришган.

Ўзбекистонда ҳам ҳужайра культурасидан фойдаланиш ўтган асрнинг

охириларида бошланган. Ўша даврнинг 70–80 йилларида Абдукаримов А.А.,
А.А.Арипджанова, Т.Г.Гулямова, Ш.С.Азимова, О.Петрова, С.Е.Мучник ва
бошқаларнинг изланишлари одам эмбрионининг нормал ҳужайралари ва
HeLa ҳужайраларининг рецептор тизимини ўрганишга бағишланган эди.
Ўсимлик моддалари кимёси институтида А.Х.Юлдашев томонидан илк марта
ўсмага қарши фаолликка эга винкристин ва винбластин моддалари ажратиб
олинган бўлиб, уларнинг ўсма ҳужайралари ўсишини ингибирловчи хоссаси
бу институтда эмас, балки Венгрияда аниқланди. 2002–2003 йиллардаёқ
молекуляр генетика лабораториясида проф. Ш.С.Азимова бошчилигида В
гепатитининг сиртқи антигенларига моноклонал антитана ҳосил қилувчи
гибрид ҳужайралар олинди. 2005 йилда Биоорганик кимё институтида
Н.Н.Кузнецова томонидан сичқонлар меланомаси ҳужайраларининг янги
линияси олиниб, патентланган. Шу йилда Ўсимлик моддалари кимёси
институтининг молекуляр генетика лабораториясига верификацияланган
ўсма ҳужайралари (Hela, Hep–2 ва HBL–100) линияси келтирилган. Ҳозирги
вақтда молекуляр генетика лабораториясининг ҳужайра культуралари
коллекциялари доимий тарзда ҳужайраларнинг янги линиялари билан
тўлдирилиб келинмоқда ва ҳужайра культуралари бўйича систематик


background image

тадқиқотлар олиб борилмоқда.

Диссертация мавзусининг диссертация бажарилган олий таълим

муассасасининг илмий-тадқиқот ишлари билан боғлиқлиги.

Диссертация

тадқиқоти Ўсимлик моддалари кимёси институти илмий-тадқиқот ишлари
режасининг № А–10–144 «Одам эритропоэтинига қарши моноклонал
антитаналар олиш» (2006–2008), № ФА–Ф3–Т041 «Ген-ҳужайра биологияси
усуллари ёрдамида биологик фаол бирикмаларни олиш ва фармако
токсикологик хусусиятларини ўрганиш” (2007–2011) ва № ФА–Ф6–Т198,

«Биологик фаол моддаларни ҳужайра метаболизмига таъсирини ўрганиш»
(2012–2016) мавзусидаги фундаментал ва амалий лойиҳалар доирасида
бажарилган.

Тадқиқотнинг мақсади

нормал ҳужайраларга кам заҳарли бўлиб, ўсма

ҳужайралари ўсишини ингибирлайдиган, ўсма ҳужайраларига таъсир
қилмаган ҳолда нормал ҳужайралар ўсишини тезлатадиган цитотоксик
бирикмаларни

аниқлаш

ҳамда

рекомбинант

эритропоэтинга

қарши

моноклонал

антитаналарни

синтез

қилувчи

гибрид

ҳужайраларни

(гибридомалар) олишдан иборат.

7

Тадқиқотнинг вазифалари.

Ўсма ҳужайраларини ингибиторларини аниқлаш бўйича:
экстрактлар

ва

индивидуал

бирикмаларни

хатарли

трансформацияланган ҳужайраларнинг (Hela – бачадон бўйни ўсмаси, Hep–2
– ҳиқилдоқ ўсмаси ва HBL–100 – сут безлари ўсмаси) ҳужайра моделларига
таъсирини аниқлаш;

бирикмалар скрининги учун одам фибробластлари ва каламуш

гепатоцитлари нормал ҳужайралари культураларини олиш; нормал
ҳужайраларнинг (фибробластлар ва гепатоцитлар) ҳужайра моделларида
экстрактлар ва индивидуал бирикмалар таъсирини ўрганиш. Регенератив
тиббиёт учун нормал ҳужайралар пролифераторларини аниқлаш бўйича:

фибробластлар ва кератиноцитларнинг ҳужайра культураларини

ажратиб, улар асосида тўқима-муҳандислик конструкцияларини яратиш;
одам ва қуён фибробластларнинг ҳужайра культураларига флавоноидлар ва
фитостероидларнинг таъсирини аниқлаш; аниқланган ҳужайралар
пролифераторлар ва тўқима-муҳандислик конструкцияларини

in vivo

шароитларида куйган яраларнинг битиш жараёнига таъсирини аниқлаш.

Эритропоэтинга қарши моноклонал антитаналар (МКАТ-ЭПО) ҳосил

қилувчи гибрид ҳужайраларни олиш бўйича:

BALB/c линияси сичқонларини рекомбинант эритропоэтин билан

иммунизация қилиш схемасини ишлаб чиқиш;

сичқон

миеломаси

X63Ag8,653

ҳужайраларини

рекомбинант

эритропоэтин билан иммунизацияланган BALB/c линия сичқонларнинг
спленоцитлари билан туташтириш;

МКАТ-ЭПО гибридом-продуцентларининг селекцияси, скрининги ва


background image

уларни клонлаштириш;

рекомбинант эритропоэтинга моноклонал антитаналарни препаратив

миқдорда олиш учун истиқболли клонларни танлаб олиш ва тавсифлаш,
асцит ажратиб олиш;

рекомбинант эритропоэтинга моноклонал антитаналарни олиш ва

тозалаш;

МКАТ-ЭПОдан фойдаланган ҳолда аффинли хроматография услуби

билан плацентар қондан табиий эритропоэтинни ажратиб олиш ва тозалаш.

Тадқиқот объекти

сифатида фибробластлар, кератиноцитлар ва

гепатоцитларининг ҳужайра культуралари, Hela – бачадон бўйни ўсма
ҳужайралар, Hep–2 – ҳиқилдоқ ўсмаси ва HBL–100 – сут бези ўсмасининг
ҳужайра культуралари, терининг дермал эквиваленти, экстрактлари, табиий
ва индивидуал бирикмалар (тропан қатор алкалоидлари, фенил- ва
феноксисирка кислоталари, фенилгидразин ва норфлуорокурарин
ҳосилалари, фитостероидлар, флавоноидлар), IIIА даражадаги термик
куйишли экспериментал ҳайвонлар, BALB/c линия сичқонлар, сичқон
миеломаси X63Ag8.653 ҳужайралари танланган.

8

Тадқиқот предмети

- цитотоксик, пролифератив ва метаболик

фаолликлари,

куйган

яралар

регенерацияси,

гибрид

ҳужайралар

эритропоэтинга моноклонал антитаналар ҳосил қилиш қобилияти ва олинган
моноклонал антитаналарни иммуносорбент сифатида қўллаш имкониятлари.

Тадқиқот усуллари.

Тадқиқотда биоорганик кимё (оқсилни бўлиш,

миқдори ва сифатини аниқлаш, спектрофотометрик, электрофорез усуллари),
ҳужайра биологияси ва инженерияси (бирламчи ҳужайра культуралари ва
гибридом олиш услублари), биокимё услублари (колориметрик услублар –
МТТ, нейтрал-қизил, ЛДГ-тест), иммунокимёвий (Уохтерлони, ИФА)
услублардан фойдаланилган.

Тадқиқотнинг илмий янгилиги

қуйидагилардан иборат:

бир қатор биологик фаол бирикмалар ва экстрактларнинг янги

фармакологик фаолликлари аниқланган;

Convolvulus

туркум ўсимликлари,

Vinca major

ва

Arundo donax

ўсимликларидан ҳамда Vinca туркуми ўсимликларида паразит яшовчи
эндофит-замбуруғлардан олинган экстрактлар ўсма ҳужайраларининг
селектив цитотоксик фаолликка эгалиги исботланган

;

Convolvulus

туркум

ўсимликларидан

олинадиган

конвольвин

алкалоидининг

ҳосиласи

ҳиқилдоқ

ўсмаси

ҳужайралари

ўсишини

ингибирлаб, айни вақтда бачадон ва сут безлари ўсма ҳужайралари ўсишини
ингибирламайдиган ҳамда нормал ҳужайраларга қарши паст цитотоксиклик
намоён қилувчи, танлаб таъсир қилувчи бирикма – N-бензил конвольвин
аниқланган;

ўсма ҳужайралари ўсишини селектив ингибирлайдиган бирикмалар – n

Cl-ацетилфенилсирка кислота, n-Cl-феноксисирка кислота ва фенилгидразон


background image

норфлуорокурарин йодметилати аниқланган;

хлорсақловчи

алкалоидлар,

хусусан,

конвольвин

ва

винканин

ҳосилаларининг танламай таъсир қилувчи юқори цитотоксик фаоллигининг
Цисплатин препаратига тенг даражада таъсир қилиши аниқланган;

мезенхимал ҳужайралар культураларини олиш услуби ишлаб чиқилган;

экдистерон фитоэкдистероиди тери ҳужайралари – фибробластлар ва
кератиноцитлар пролиферациясини ошириши ҳамда ҳиқилдоқ, сут безлари ва
бачадон ўсма ҳужайраларининг пролиферациясини чақирмаслиги аниқлаган;
экдистерон аллофибробластлар билан биргаликда аутоэпидермоцитлар
пролиферацияси ва тўқима эпителизациясининг ортишига олиб келиши
исботланган, бу эса куйган яраларни даволашда уларни қўллаш мумкинлиги
кўрсатади;

рекомбинант эритропоэтинга қарши моноклонал антитаналар ҳосил

қилувчи гибридома-продуцентлар олинган.

Тадқиқотнинг амалий натижаси

қуйидагилардан иборат: мезенхимал

ҳужайралар культурасини олишнинг оптимал усуллари ишлаб чиқилган;

экстрактлар ва индивидуал бирикмалар скрининги олиб борилиб, улар

орасидан ўсма ҳужайралари учун селектив ингибиторлар ва тери
ҳужайралари пролифераторлари аниқланган;

9

бирикмаларнинг биологик фаоллиги ва заҳарлилик дозалари

аниқланган;

IIIА даражали куйишларни даволаш учун самарали усул ишлаб

чиқилган

;

эритропоэтинга қарши моноклонал антитаналар ҳосил қилувчи

гибридом-продуцентлар олинган;

эритропоэтинга қарши моноклонал антитаналар асосида табиий ва

рекомбинант эритропоэтин олинган.

Тадқиқот натижаларининг ишончлилиги

ишда қўлланган замонавий

аналитик ва статистик усуллар, олинган натижаларни мутахассислар
томонидан тасдиқланганлиги ва тадқиқот ишлари натижаларини амалда
қўлланилиши ҳамда олинган натижаларни республика ва халқаро илмий
конференцияларда

муҳокама

қилиниши,

рецензия қилинувчи илмий

нашрларда чоп этилиши ва олинган патентлар билан асосланади.

Тадқиқот натижаларининг илмий ва амалий аҳамияти.

Тадқиқот

натижалари, шубҳасиз, фундаментал ва амалий аҳамиятга эга, чунки кўплаб
экстракт ва индивидуал бирикмалар орасидан танлаб олинган ҳужайралар
ўсишининг

фаол

ингибиторлари

ҳамда

пролифераторлари

ушбу

йўналишларда уларнинг таъсир механизмлари борасида чуқур изланишлар
истиқболини очади.

Халқаро талабларга жавоб берувчи

(GLP)

биологик фаол моддаларни,

доривор воситаларининг клиниколди скрининги

in vitro

усуллари йўлга

қўйилган бўлиб, улар ёрдамида тез ва кам ҳаражат билан янги бирикмалар ва
препаратларнинг цитоксиклиги аниқланади. Ушбу усуллар билан аниқланган


background image

паст цитотоксикликка эга ҳамда ўсма ҳужайраларини ингибирловчи
экстрактлар ва индивидуал бирикмалар ўсмаларга қарши воситалар сифатида

in vivo

синовлари учун таклиф қилинган. Ишлаб чиқилган тери

ҳужайраларининг культураларини олиш усули ва тўқима-муҳандислик
конструкциясини куйган яралар терапиясида қўллаш эпителизациясини
сезиларли тезлаштиради.

Тадқиқот натижаларининг жорий қилиниши.

Биологик фаол

бирикмаларнинг цитотоксиклигини аниқлаш учун ўтказилган скрининг ва
моноклонал антитаналар олиниши бўйича олинган илмий натижалар асосида:

гибрид ҳужайраларининг истиқболли иккита субклони ажратиб

олинган ва унга Ўзбекистон Республикаси Интеллектуал мулк агентлигининг
ихтиро патенти олинган (№ IAP 02943, 16.12.2002). Илмий-тадқиқот
натижасида реокмбинант эритропоэтинга қарши моноклонал антитаналар
олинган;

N-бензил

конвольвин

алкалоидининг

янги

биологик

хоссаси

аниқланган ва ихтирога патент билан ҳимоя қилинган (№ IAP 04965,
16.02.2012).

Илмий

тадқиқот

натижасида

ушбу

бирикма

нормал

ҳужайраларга цитотоксик таъсир қилмаганлиги сабабли ҳиқилдоқ ўсма
ҳужайралари ўсишининг селектив ингибитори сифатида тавсия қилинган.

«Ўзстандарт» агентлигидан давлатлараро стандартга мувофиқ келувчи

тиббиёт жиҳозлари ва доривор воситаларнинг цитотоксиклигини аниқлаш

10

мақсадида Синов марказидан аккредитация гувоҳномаси
(№UZ.AMT.07.MAI.220) олинган.

«Доривор воситалар, тиббий жиҳозлар, косметик воситалар, кимёвий

бирикмалар, пестицидлар ва ветеринария воситалари цитотоксиклигини
баҳолаш» услубий кўрсатмаси тасдиқланган (ЎзР ССВ Фан ва ўқув юртлари
бош бошқармаси, № 8Н-Р/18, 02.03.2016 й.).

Тадқиқот натижаларининг апробацияси.

Тадқиқот натижалари 10 та

илмий-амалий анжуманларда, жумладан, Ёш олимлар конференцияларида
(Тошкент, 2004, 2009, 2010, 2011, 2012) каби республика, Халқаро
биотехнология съездида (Пущино, РФ, 2006), 7- ва 10- Chem. of Natur. Comp.
(Тошкент, 2007, 2013), 3- Ed. Plant Res and the Bioact. Ingred. (Хитой, 2012),
11- Ed. Plant Res. and the Bioact. Ing. (Туркия, 2015) сингари халқаро илмий
амалий конференцияларда маъруза кўринишида баён этилган ҳамда
апробациядан ўтказилган.

Тадқиқот натижаларининг эълон қилиниши.

Диссертация мавзуси

бўйича жами 28 та илмий иш чоп этилган, улардан 2 та ихтиро патенти,
Ўзбекистон Республикаси Олий аттестация комиссиясининг докторлик
диссертациялари асосий илмий натижаларини чоп этишга тавсия этилган
илмий нашрларда 14 та мақола, жумладан, 11 та маҳаллий ва 3 та Халқаро
журналларда нашр этилган.

Диссертациянинг ҳажми ва тузилиши.

Диссертация таркиби кириш,

тўртта

боб, хулоса, фойдаланилган адабиётлар рўйхатидан иборат.


background image

Диссертациянинг ҳажми 227 бетни ташкил этган.

11

ДИССЕРТАЦИЯНИНГ АСОСИЙ МАЗМУНИ

Кириш

қисмида ўтказилган тадқиқотларнинг долзарблиги ва зарурати

асосланган, тадқиқотнинг мақсади ва вазифалари, объект ва предметлари
тавсифланган, республика фан ва технологиялари ривожланишининг устувор
йўналишларига мослиги кўрсатилган, тадқиқотнинг илмий янгилиги ва
амалий натижалари баён қилинган, олинган натижаларнинг илмий ва амалий
аҳамияти очиб берилган, тадқиқот натижаларини амалиётга жорий қилиш,
нашр этилган ишлар ва диссертация тузилиши бўйича маълумотлар
келтирилган.

Диссертациянинг

«Тиббиёт, биология ва кимё фанларининг илмий

ва амалий вазифаларини ечишда ҳужайра культураларини қўллашнинг
замонавий масалалари»

деб номланган биринчи бобида ҳужайра

культураси, уларни ўстириш ва қўллаш усулари, ўсимлик экстрактлари ва
индивидуал

бирикмаларни

ҳужайраларнинг

турли

культураларидаги

цитотоксик

фаолликлари,

ҳужайра

ўсиши

пролифераторлари

ва

ингибиторларини аниқлаш усуллари ва замонавий ўсмаларга қарши
препаратлар ҳақида умумий маълумотлар берилган. Бундан ташқари,
регенератив

тиббиётда

ҳужайра

культурасидан

фойдаланиш

бўйича

тадқиқотлар ва маълумотлар келтирилган. Айрим бўлинмалар гибридома
технологиялари ҳамда эритропоэтин гормони асосидаги препаратларга


background image

бағишланган.

Диссертациянинг

“Ишда қўлланилган материаллар, шароитлар ва

биоорганик кимё, биотехнология ва ҳужайра биологиясининг усуллари»

деб номланган иккинчи бобида тадқиқот изланишлари бажарилишида
фойдаланилган материаллар ва усуллар, хусусан, биоорганик кимё (оқсилни
миқдорий ва сифат аниқлаш учун гельфильтрация, иммуналмашинув ва
аффин

хроматография,

спектрофотометрия,

электрофорез

ва

бошқа

усуллари), ҳужайра биологияси ва инженерияси (бирламчи ҳужайра
культураларини, гибридом ва тўқима-муҳандислик конструкцияларини олиш
услублари), биокимёвий (колориметрик услублар – МТТ, нейтрал-қизил,
ЛДГ-тест), иммунокимёвий (Уохтерлони, ИФА) услублардан фойдаланилган.

Диссертациянинг

«Экстрактлар ва индивидуал бирикмаларнинг

цитотоксик ва пролифератив фаолликларини аниқлаш»

деб номланган

учинчи бобида нормал ва хатарли трансформацияланган ҳужайралар
культураларини ўстириш ва олиш натижалари ҳамда мазкур культураларда
экстрактлар, индивидуал бирикмаларни цитотоксик ва пролифератив
фаолликларини скрининг қилиш натижалари, регенератив тиббиётда ҳужайра
культураларидан фойдаланиш бўйича изланишлар муҳокама қилинган.

Изланишларда эксплант ноферментатив усули билан олинган фибробласт,

кератиноцит ва гепатоцитлар нормал ҳужайраларининг культураларидан

фойдаланилган. Бунда мазкур усул ўстириш факторларига (EGF – ўсишнинг

эпидермал фактори, FGF – фибробластларнинг ўсиш фактори ва ҳк.) ва

матрица оқсилларига (I ва III типдаги коллагенлар,

12

эластин, ва бошқ.) бой фибробластларни конфлюент культурасининг
супернатанти билан кондициялаш йўли билан мақбуллаштирилди. Ҳужайра
культуралари олишнинг оптималлаштирган услубимизнинг асосий ютуқлари
дифференциация босқичидаги пролифератив фаол ва яшовчан ҳужайралар
пули олинади ва шу билан бирга фидер қатлами ва қатор, қимматбаҳо
қўшимчаларга эҳтиёж қолмайди. Ушбу услуб тежамкор ва юқори унумли
бўлиб Хейфлик лимитидан йироқ, ҳужайралардан таркиб топган моноқават
бир ёшли нормал ҳужайралар культураси олинади ва бу ўз ўрнида
регенератив тиббиёт учун муҳим.

Шундай тарзда фибробласт ҳужайра культуралари – одам, қуён,

сичқон, каламуш ва уларнинг эмбрионларининг (1-расм) ФҲКлари, одам ва
қуён терисининг кератиноцитларининг бирламчи культураси – КБК (2-расм),
каламушларнинг гепатоцилари культураси - КГК (2-расм) олинган.


background image

A

B

C

D E

F

1-расм. Фибробластлар ҳужайралари культуралари:

A – одам

дермасининг экспланти, ўстиришнинг 3-суткаси; B – одам фибробластлари
моноқавати, 10-сутка; C – қуён фибробластларини моноқавати, 10- сутка; D –
каламуш

дермаси

фибробластлари,

10-

сутка;

E

–

каламуш

эмбриони

фибробластлари, ўстиришнинг 10-суткаси; F – сичқон фибробластлари, 10-сутка; ок.
×10, об. ×10.

AB


background image

2-расм. 20 кунлик одам КБК (A) ва 3 кунлик гепатоцитларнинг

культураси (B),

ок. ×10, об. ×40.

13

Олинган культараларнинг морфологик тадқиқоти КБК – эпителийсимон

ҳужайралар билан ФБК - фибробластсимон ҳужайраларидан

иборат,

гепатоцит ҳужайралар эса 1-2 йирик ядроли бўлиб, адабиёт маълумотларига
тўлиқ мос келади. Олинган ҳужайра культуралари кимёвий бирикмалар, дори
воситалари ва тиббиёт жиҳозларини клиник олди

in vitro

скрининги учун ҳамда косметология ва регенератив тиббиёт учун ҳам маъқул
келади.

Экстрактлар ва индивидуал бирикмаларни цитотоксик, пролифератив

ва бошқа фаолликларга скрининг учун РФА цитология институтининг
ҳужайра культуралари банкидан олиб келинган Hela - бачадон бўйни
ўсимтаси, HEp-2 - ҳиқилдоқ ўсимтаси ва HBL-100 - сут безлари
ўсимтасининг верификацияланган линияларидан фойдаланилган. Ўсимта
ҳужайраларидаги

тадқиқотлар

З.С.Хашимова,

Е.О.Терентьева

билан

биргаликда олиб борилди.

Шу

билан

бирга

бирикмалар

скрининги ҳужайралар нормал

культураларида ҳам олиб борилди. ФҲКдан 5-7 пассажларда, ГБК 1
пассажда,

конфлюэнтлик

80%

ни

ташкил

этганга

қўлланилди.

Ҳужайраларнинг метаболик ҳолати скрининги қуйидаги кўрсаткичлар
бўйича аниқланган: 1) митохондриал дегидрогеназаларни Мосман тест -
МТТ-тестида митохондриал дегидрогеназаларнинг умумий фаоллигини
пасайиши; 2) лизосомал функцияга коррекцияланувчи қизил витал бўёғи
эндоцитозини камайиши - нейтрал-қизил тест; 3) ҳужайра мембранасини
шикастланиш

маркери

сифатида

ишлатиладиган

(ЛДГ-тест)

лактатдегидрогеназанинг

цитозол

ферменти

инкубация

муҳитида

фаоллашиши.

Цитотоксиклик

фаоллигини

аниқлашда

солиштириш

препаратлари сифатида - «Цисплатин–Тева» (Phfarmachemie, B.V.,

Голландия) ишлатилди. Назорат сифатида ўстириш муҳитига киритилган
интакт ҳужайралардан фойдаланилган.

ЎзР ФА ЎМКИда

Vinca

туркум ўсимликларидан олинган экстрактлар

цитотоксик таъсири скрининг қилинди. Маълумки ушбу туркум ўсимликлари
таркибида винкаалкалоидлар мавжуд бўлиб улар ўсимтага қарши фаоллик
намоён қилади (R.Berges, 2014, V.Rai, 2014). Мисол учун, тиббиётда
қўлланилаётган «Винкристин» ва «Винбластин» препаратлари винка

алкалоидларга мансуб. Шу сабабли

V. major

ўсимлигининг ер устки қисми ва

илдизининг экстрактларининг цитотоксик фаоллиги ўрганилди (1-жадвал).


background image

1-жадвал

Экстрактларнинг цитотоксик фаоллиги, ҳужайралар

ўсишини ингибирлаш фойзи (М ± м, n = 9)

Намуна,

мкг/мл

HeLa

HEp-2

ФБК

100

10

100

10

100

10

V. major

ер устки

71±2,9*

30±2,2

77±3,04*

43±2,49

40±0,5*

19±0,1

V. major

илдизи

73±5,61* 50±4,38* 67±4,09*

5±0,05

30,4±0,
1

0

Цисплатин –Тева

97,5±2,
4

70±2,31* 89±0,28* 51±1,2 * 100±9,5*

72±3,1*

Назорат

0

0

0

0

0

0

Изоҳ:

назоратдан ишонарли фарқи Р<0,05; *- назоратдан ишонарли фарқи Р<0,01

14

Ўрганилган экстрактлар орасида энг кучли цитотоксик фаолликни

Vinca major

илдизидан олинган экстракт намоён қилиши аниқланди (жадв. 1).

Ушбу экстракт 10 мкг/мл концентрациясида бачадон бўйни ўсимтасини
нормал ҳужайраларни нобуд қилмасдан ингибирлаши кейинги

in vivo

тадқиқот усуллар учун қизиқиш ўйғотмоқда.

Олинган

маълумотларга

асосан

Vinca

туркум

ўсимликларида

паразитловчи эндофит замубуруғлар экстрактларини скрининг қилишни
мақсад қилдик. Шундай қилиб ЎзР ФА Микробиология институтида
(Т.Г.Гулямова раҳбарлиги остида) олинган

Vinca minor

ва

Vinca erecta

ўсимликларида паразитловчи

Solerotium sp, Alternaria sp, Penicillium sp,

Acremonium sp

и

Aspergillius tureus

штамм замбуруғларининг 8 ҳил

экстрактининг цитотоксик фаоллиги ўрганилди. Ушбу экстрактларда
винкаалкалоидлар

мавжуд

бўлиб ўсимта ҳужайраларининг ўсишини

ингибирлаши мумкин (2-жадвал).

2-жадвал

Замубуруғлар экстрактларнинг цитотоксик фаоллиги, ҳужайралар

ўсишини ингибирлаш фойзи (М ± м, n = 9)

Экстрактл

ар мкг/мл

HeLa

НEр-2

HBL-100

ПКГ

100

10

1

100

10

1

100

10

1

10

1

Solerotium
sp

V. minor

барг

51±

6,2

20,5

±0,2

0±

0,1*

43±

1,8

30,5

±0,3

21±

0,6

73,5

±8,8

47±

1,6

29±

0,9

40±

4,9

12±

2,0

Penicillium

V. мinor

поя

24±

0,4

19,5

±2,1

6±

0,1*

64±

3,3

61±

6,8

28±

0,1

72±

7,6

43±

4,2

40±

2,5

32±

3,7

9±

0,9


background image

Acremoniu

m

V. minor

барг

37,5

±1,5

6,0

±0,3

0

36±

1,2

5±

0,1*

3±

0,2*

53±

1,3

27±

1,0

25±

0,6

20±

3,2

8±

1,5

Alternaria

sp

V. minor

барг

82±

8,6

6,5±

0,6

1±

0,1*

36±

0,9

26±

1,9

11±

0,1

91±

7,5

47±

3,8

32±

3,2

76±

9,5

54±

6,2

Aspergillius

tureus

V.erecta

51±

4,2

44±

3,6

9±

0,1*

53±

4,9

45,5

±3,1

32±

0,9

56±

3,1

54±

3,1

49±

3,0

34±

3,1

12±

2,2

Penicillium

V. erecta

илдиз

36±

2,5

6,0±

0,1*

0

27±

0,6

20±

0,9

8±0,

1*

54±

2,4

50±

5,3

32±

1,2

29±

4,5

13±

2,9

Penicillium

V. erecta

барг

72,5

±8,2

48

±

4,6

39

±

1,3

90±

9,7

39±

1,2

37,5

±1,2

79±

9,8

53,5

±4,7

45±

3,2

24±

3,8

16±

2,5

Alternaria

sp

V. erecta

барг

54,5

±2,5

28,5

±2,2

13±

0,2

47,5

±2,8

27±

0,8

13±

0,1

66±

5,2

64±

5,1

48±

2,8

50±

5,7

19±

2,7

Цисплатин
Тева

99±

2,6

78±

1,9

32±

2,6

99,5

±1,8

60±

1,6

41±

0,9

93±

4,9

76±

2,9

49±

0,3

100±

5,9

49±

3,3

Назорат

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Изоҳ:

назоратдан шубҳасиз фарқи Р<0,05; *- назоратдан шубҳасиз фарқи Р<0,01;

назорат сифатида интакт ҳужайралардан фойдаланилган.

2 жадвалдан кўриниб турибдики, қуйи концентрациялардаги (1-10

мкг/мл) ўсимта ҳужайлари культураларида энг юқори ингибирловчи
фаолликни

Alternaria sp барг (V. erecta), Penicillium sp барг (V. erecta)

Aspergillius tureus илдиз (V. erecta)

ва

Penicillium sp поя (V. minor)

экстрактлари намоён қилди. Бу экстрактлар ўсимтага қарши препаратлар
билан солиштирганда гепатоцитлар нормал ҳужайраларига қарши қуйи
цитотоксик фаолликни кўрсатди. Олинган экстрактлардан танлаб таъсир
қилиш хусусиятига фақат

Alternaria sp барг (V. erecta)

экстракти намоён

15

қилган. Чунки HBL-100 – сут безлари ўсимтаси ҳужайраларида культуралар

ўсишини ингибирловчи хусусият юқори бўлди.

Vinca erecta

ўсимлигининг

баргида паразитловчи

Alternaria sp

замбуруғ экстракти танлаб таъсир

қилувчи фаолликка эгалиги сабабли кейинги ихтисослаштирилган

in vivo

тадқиқотларга тавсия этилди.

Сўнг ЎзР ФА ЎМКИда (С.Ф. Арипова раҳбарлиги остида) Cragg –

канцеролитик ўсимликлар рўйхатига кирувчи ўсимликлар алкалоидлари
йиғиндиларининг цитотоксик фаоллиги скрининг қилинди.

C. krauseanus, Buxus sempervirens

ўсимликлари ва

Arundo donax

илдиз


background image

алкалоидлар йиғиндисининг цитотоксик фаоллиги ўрганилди (3-жадвал).

3-жадвал

Алкалоидлар йиғиндисининг цитотоксик фаоллиги, ҳужайралар

ўсишини ингибирлаш фойзи (М ± м, n = 9)

Намуна

мкг/мл

HeLa

HEp-2

ФБК

100

10

100

10

100

10

A. donax

илдизи АЙ

100±3,54 43±2,35* 100±6,72

55±2,53

39±1,5*

0

C. krauseanus

АЙ

46,5±2,
7

7±0,8*

60,8±3,
9

43,6±0,5 100±9,3*

0

B.sempervirens

АЙ

99,4±5,
5

17±1,05*

97,8±7,
7

4,2±0,03 100±11,2

36±2,4*

Цисплатин –Тева

97,5±2,
4

70±2,31* 89±0,28* 51±1,2 * 100±9,5*

72±3,1*

Назорат

0

0

0

0

0

0

Изоҳ:

назоратдан ишонарли фарқи Р<0,05; *- назоратдан ишонарли фарқи Р<0,01

Arundo donax

илдизи ва

C. krauseanus

алкалоидлар йиғиндилари

ўрганилган намуналар ичида юқори цитотоксик фаоллигини намоён қилиб
нормал ҳужайраларга таъсир ўтказмай ўсимта ҳужайраларини ингибирлаши
аниқланди. Бунда

Convolvulus

туркум ўсимликларининг АЙ 10 мкг/мл

концентрациясида

ҳиқилдоқ

ўсимтасини

50%

ингибирлаб

бошқа

ўрганилаётган ҳужайраларга таъсир ўтказмаслиги кузатилди. Шу сабабли бу
алкалоидлар йиғиндиси

in vivo

тадқиқотларга тавсия қилинмоқда.

Convolvulus

туркумига мансуб ўсимликлардан

(C. subhirsutus, C.

krauseanus,

C.

pseudocanthabrica)

ЎзР

ФА ЎМКИда (С.Ф.Арипова

раҳбарлиги остида) тропан алкалоидлари ажратиб олинган ва уларнинг
кимёвий ҳосилалари олиниб цитотоксик фаолликлари ўрганилди.

Тўртта алкалоид: конвольвин (1), конволидин (2), конволинин (3) ва

филлальбин (4)

Convolvulus

туркум ўсимликларидан ажратиб олинган. N

бензил конвольвин (5) ва N-хлорацетил конвольвин (6) – конвольвинни
синтетик ҳосилалари.

NR

1

O C

OR

2

O

OCH

3

1. R

1

= H, R

2

= CH

3

2. R

1

= H,

R

2

= OH

3. R

1

= CH

2

CH

2

-OH, R

2

= CH

3

4. R

1

= CH

3,

R

2

= CH

3

5. R

1

= CH

2

-C

6

H

5

, R

2

= CH

3

6.

R

1

= COCH

2

Cl, R

2

= CH

3


background image

16

Барча бирикмалар тузилиш жиҳатидан тропан скелетига эга бўлиб

(8-азабициклооктан),

тропин

аминоспирти

ва

вератр

кислотасининг

(конвольвин,

конволинин) ёки ванилин кислотасининг (конволидин)

мураккаб эфирлари сифатида фақат азот атомидаги ўриндошлари билан
фарқланади.

Алкалоидларнинг дастлабки скрининги турли концентрацияларда тўрт

хил ҳужайраларда – HeLa, НEр-2, ФБК ва ГБК 100 мкг/мл концентрациясида
олиб борилган (4-жадвал).

4-жадвал

Моддаларнинг 100 мкг/мл концентрациясида цитотоксик фаоллиги,

ҳужайралар ўсишини ингибирлаш фойзи, % (М ± м, n = 9)

Моддалар

HeLa

НEр-2

ФБК

ГБК

Конвольвин

83,0±0,12

99,1±0,24

100±0,17

100±0,25

N-бензил конвольвин

90,3±0,22

100±0,23

100±0,28

100±0,71

Конволинин

35,0±0,12

79,0±0,32

65,5±0,31

89±4,2

Конволидин

27,0±0,35

20,0±0,12

100±0,41

98±2,5

N-хлорацетил конвольвин

100±0,24

98±0,11

100±0,13

100±2,4

Филлальбин

44±0,15

15±0,2

0

14±1,2

Цисплатин-Тева

100±0,2

100±1,5

100±0,5

100±2,5

Назорат

0

0

0

0

Изоҳ:

назоратдан шубҳасиз фарқи Р<0,05.

4 жадвалдан кўриниб турибдики, нормал ва ўсимта ҳужайраларига

нисбатан юқори цитотоксикликни конвольвин R

1

= H, R

2

= CH

3

(1) ҳамда

унинг ҳосилалари: N-бензил конвольвин R

1

= CH

2

-C

6

H

5

, R

2

= CH

3

(5), N

хлорацетил конвольвин R

1

= COCH

2

Cl, R

2

= CH

3

(6) намоён қилмоқда. Шу

билан бирга, филлальбин (4) R

1

= CH

3,

R

2

= CH

3

алкалоиди 100 мкг/мл

концентрациясида кўпроқ бачадон бўйни ўсимтаси ҳужайралари ўсишини
ингибирлаб, бошқа ҳужайраларга нисбатан 2-4 маротаба қуйи цитотоксиклик
намоён қилган. Яъни бирикмалар структурасидаги R

1

= CH

3,

R

2

= CH

3

гуруҳлар

ушбу бирикманинг заҳарлилигини пасайтирган.

Амалий тиббиёт учун оз ва жуда оз концетрацияларда фаол бўлган

бирикмалар кўпроқ қизиқиш ўйғотади. Тажрибаларда айтиб ўтилган
бирикмаларни 10 мкг/мл концентрациясида ҳам синалди (5-жадвал).


background image

5-жадвал

Моддаларнинг 10 мкг/мл концентрациясида цитотоксик фаоллиги,

ҳужайралар ўсишини ингибирлаш фойзи (М ± м, n = 9, Р<0,05)

Моддалар

HeLa

НEр-2

ФБК

ГБК

Конвольвин

15,4±0,17

8,0±0,13

100±0,24

88±6,2

N-бензил конвольвин

35,0±0,25

81,6±0,28

39,0±0,22

42±3,1

Конволинин

0

11,0±0,25

0

8±0,02

Конволидин

33,0±0,22

28,0±0,31

35,0±0,22

24±2,2

N-хлорацетил конвольвин

99,7±0,22

97±0,33

100±0,22

100±3,6

Филлальбин

0

0

Пролиф.

0

Цисплатин-Тева

88,6±0,22

91±0,53

100±0,42

100±1,6

Назорат

0

0

0

0

17

Тадқиқотлар шуни кўрсатдики, 10 мкг/мл ёки 26,3 мМ/л ва 27,3мМ/л

концентрацияларида HeLa ва НEр-2 ҳужайларига қарши юқори фаолликни
тегишли равишда N-бензил конвольвин (5) ҳамда N-хлорацетил конвольвин
(6) намоён қилди. N-хлорацетил конвольвин (6) солиштирилаётган ўсимтага
қарши препарат даражасида ўсимта ҳужайралариннг иккала турига ҳам
юқори цитотоксик фаолликни намоён қилиш билан бирга, терининг нормал
ҳужайраларига ҳам қарши фаоллик намоён қилган (Цисплатин инсон учун
LD

50

=2,2 мг/кг). Яъни бирикмалар структурасидаги R

1

= COCH

2

Cl, R

2

= CH

3

гуруҳлари синалаётган ҳужайраларга нисбатан кескин заҳарлиликни
оширади.

N-бензил конвольвин ҳиқилдоқ ўсимтаси ҳужайраларига қарши танлаб

таъсир қилишни намоён қилиб, IC

50

= 12,3 мМ/л (4,7 мкг/мл) ва нормал

ҳужайраларга 3 маротаба кам заҳарлик (нормал ҳужайралар учун IC

50

=32,8

мМ/л (12,5 мкг/мл). IC

50

кўрсаткичидан ҳисоблаб чиқилган LD

50

венага

юборишда 12,0-13,0 мг/кг тенг, ҳиқилдоқ ўсимтаси ўсишини бостирадиган
кутилаётган терапевтик концентрация эса 4,4-5,0 мг/кг бўлиши мумкин ҳамда
буни

in vivo

тадқиқотларини амалга ошириб текшириш керак.

Табиий бирикмалар билан бирга индол алкалоидлари ва уларнинг

фенилгидразин билан олинган ҳосилалари (пиразоллар) ўрганилди.
Кўндаланг ичак ўсимтасига қарши цитотоксик фаолликка эга пиразолин
(патент RU 2305545, 2006) ҳамда фенилгидразин сут безлари ва жигар
ўсимтаси ҳужайраларини ингибирловчи (Hafez O.M., 2014) ҳосилалари
маълум.

Профессор А.Х.Юлдашев

Vinca erecta

илдизидан индол алкалоид –


background image

норфлуорокурарин (C

19

H

20

N

2

O, винканин) ажратиб олинган ва пиразолнинг

мураккаб ҳосиласи норфлуорокураринни фенилгидразин билан реакцияси
натижасида норфлуорокурарин гидразони (С

25

Н

26

N

4

) синтез қилинган. Ушбу

бирикмани хлорид кислота билан таъсирлашуви натижасида фенилгидразон
норфлуорокурарин хлоргидрати C

25

H

27

N

4

Cl, йодли метил билан эса –

фенилгидразон норфлуорокурарин йодметилати ҳосил бўлади С

26

Н

29

N

4

I (3-

расм).

3-расм. Пиразол ҳосилалари: 1 - фенилгидразон норфлуорокурарин
йодметилати, 2 - фенилгидразон норфлуорокурарин хлоргидрати.

18

Ушбу бирикмаларнинг цитотоксик фаоллиги ўрганилди. Натижада

дастлабки бирикма – норфлуорокурарин гидразони ва фенилгидразин,
ўзларининг ҳосилаларидан фарқли ўлароқ, кутилаётган фаоллик намоён
қилмади (6-жадвал).

6-жадвал

Фенилгидразин ва норфлуорокурарин ҳосилаларининг цитотоксик

фаоллиги, ҳужайралар ўсишини ингибирлаш фойзи (М ± м, n = 9)

Бирикма,

Мкг/мл

HeLa

НEр-2

HBL-100

ФКК

100

10

1

100

10

1

100

10

1

100

10

1

C

25

H

27

N

4

Cl

83,5
±8,
2

53±

3,9

38±

4,2

89±

12,2

45±

4,9

32±1,

6

91,6

±2,1

36,9

±0,2

27,8

±0,9

100

±6,0

41±

7,2

29±

0,9

С

26

Н

29

N

4

I

60±6

,7

45±

2,5

11±

1,3

72±

3,1

55±

8,8

31±1,

8

49±

0,1

40±

0,5

38,6

±1,1

96,7

±5,2

0

0

С

25

Н

26

N

4

67±5

,4

30±

1,9

10±

0,6

24±

4,4

10,5

±0,9

9±0,9

39±

3,2

27±

2,1

14±

1,5

98±7,

2

60±

3,1

34±

0,5

Фенилгид
ра зин

100±

15,
5

99±

18

54±

23

99±

21,5

82±

11

37±5,

9

78±

5,0

54±

3,5

44
±
2,5

100±2

2

85±

13

74±

9,5


background image

Цисплат
ин –Тева

100±

7,1

72±

2,2

33±

1,9

100
±11

79±

4,4

23,5±

2,5

70±

0,3

60±

0,5

54±

0,1

100±1

1,3

69±

7,5

34±

2,1

Назорат

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Изоҳ

: назоратдан шубҳасиз фарқи Р<0,05.

6 жадвалдан кўриниб турибдики, фенилгидразон норфлуорокурарин

хлоргидрати (C

25

H

27

N

4

Cl) 24 мМ/л (10 мкг/мл) концентрациясида ўсимта

ҳужайрларига

қарши

юқори

цитотоксик

фаолликка

фенилгидразон

норфлуорокурарин хлоргидрати эга бўлиб, барча ҳужайралар ўсишини 50 %
сусайтириб, нормал ҳужайраларда цитотоксиклиги Цисплатинга нисбатан
анча паст. Бу бирикманинг LD

50

=7,7-12,5 мг/кг га тенг. Фенилгидразон

норфлуорокурарин йодметилати анча танлаб таъсир қилиб, 19,1 мМ/л (10
мкг/мл) концентрациясида фибробластларда токсик эмаслиги ва бошқа
ўсимта ҳужайралари ўсишни сусайтиради. LD

50

=48-52 мг/кг, 50% га яқин

ҳиқилдоқ ўсимтаси ҳужайраларини, 40 % га яқин сут бези ва бачадон бўйни
ўсимтаси ҳужайралари ўсишини тўхтатувчи кутилаётган терапевтик доза эса
10 мг/кг га тенг. Бундан ташқари, фенилгидразон норфлуорокурарин
йодметилати 1-10 мг/кг концентрацияларида Цисплатин каби ЛДГ цитозол
ферменти “чиқиб кетишига”, яъни мембрана бузилишига олиб келган бўлса,
юқори

цитотоксик фаолликка эга фенилгидразон норфлуорокурарин

хлоргидрати таъсирида бу ҳол кузатилмайди.

Шундай қилиб, ўсимта ҳужайралари ва фибробластларга қарши юқори

цитотоксик фаолликка фенилгидразон норфлуорокурарин хлоргидрати эга,
яъни умуман танлаб таъсир қилмайди. Шу пайтда фенилгидразон
норфлуорокурарин йодметилати анча танлаб таъсир қилиб, 1-10 мкг/мл (1,91-
19,1 мМ/л) концентрациясида ўсимта ҳужайраларининг ўсишини тўхтатиб,
уларниннг мембранасини шикастлайди ва нормал ҳужайралар –
фибробластларга нисбатан токсик таъсир кўрсатмайди. Иккала ҳосила
кейинчалик истиқболли ўсимтага қарши препаратларнинг компонентлари
сифатида

in vivo

усуллари ёрдамида текширилиши мумкин.

19

Табиий бирикмаларнинг ҳосилалари билан бир қаторда юқори

самарали ўсимтага қарши препаратларни яратишда синтез йўллари билан
олинган бирикмалар ҳам истиқболли саналади. Адабиётларда нормал
ҳужайраларга нисбатан қуйи цитотоксикликка, сут бези ўсимтаси 755
ҳужайраларини ингибирловчи (патент RU № 2429224, 2009й.) ёритилган. Шу
билан бирга фенилсирка кислотасининг қатор ҳосилалари синтез қилиниб
эпителиал ҳужайралардан ҳосил бўлувчи неоплазияни даволашда қўллаш
тавсия қилинмоқда (Б.С.Федоров, 2009й.).

Шу сабабли М.Улуғбек номидаги Ўзбекистон Миллий университети

Кимё факультетининг органик синтез лабораториясида (Абдушукуров А.К.


background image

раҳбарлиги

остида)

синтез

қилинган

фенил-

ва

феноксисирка

кислоталарининг ҳосилаларининг цитотоксик фаоллиги n-Cl

ацетилфенилсирка кислота ва n-Cl-феноксисирка кислотаси ўрганилди (4-

расм, 7-жадвал).

CH

2

COOH

ClCH

2

C=O

OCH

2

COOH

Cl

(1) (2)

4-расм. фенил- ва феноксисирка кислоталарининг ҳосилалари - n

Cl-ацетилфенилсирка кислота (1) ва n-Cl- феноксисирка кислота (2)

7- жадвал

Фенокси- ва фенилсирка кислота ҳосилаларининг цитотоксик

фаоллиги, ҳужайралар ўсишини ингибирлаш фойзи (М ± м, n =

9)

№

Бирикма

мкг/мл

HeLa

HEp-2

HBL-100

ФКК

10

1

10

1

10

1

10

1

1

n-Cl-ацетилфенилсир

ка кислота

13,3±

2,0

41±

1,2

23±

1,2

53±

5,1

60,0

±1,5

60,0

±0,9

25±

1,0

16±

0,9

2

n-Cl- феноксисирка

кислота

4,3±

0,9

0

57±

4,2

43,6±

0,5

33±

0,2

29

±2,0

15±

0,2

19±

1,1

3

Цисплатин –Тева

68,5±

3,4

35±

2,3

76±

1,3

44±

1,2

76±

4,5

49±

3,0

72±

3,2

45±

2,2

Изоҳ:

назоратдан ишонарли фарқи Р<0,05.

7 жадвалда берилишича, n-Cl-ацетилфенилсирка кислота фақат 1

мкг/мл концентрациядагина яққол цитотоксик фаоллик намоён қилиб,
Цисплатинга нисбатан нормал фибробласт ҳужайраларининг культурасига
деярли таъсир қилмасдан барча ўсимта ҳужайралари ўсишини ингибирлаши
аниқланди. n-Cl-феноксисирка кислота 1-10 мкг/мл концентрацияларида
ҳиқилдоқ

ўсимтасини

ингибирлаб,

нормал

ҳужайраларга,

хусусан,

фибробласт ҳужайраларининг культурасига, сут бези ва бачадон бўйи
ўсимталарига жуда паст цитотоксик фаоллик кўрсатди. Бундан ташқари,
мазкур бирикмалар 1 мкг/мл концентрациясида ўсимта ҳужайралари
мембраналарининг шикастланишига олиб келиши аниқланган. Бу, ўз

20

навбатида, ЛДГ-тестда культурал суюқликда цитозол ферменти

лактатдегидрогеназанинг пайдо бўлиши билан тасдиқланмоқда. Шундай
қилиб, n-Cl-ацетилфенилсирка кислота 4,7 мМ/л (1 мкг/мл)


background image

концентрациясида ҳиқилдоқ, сут бези ва бачадон бўйи ўсимталарини 50 %
ингибирлайди. LD

50

18-22 мг/кг, кутилаётган терапевтик доза эса 1-10 мг/кг

ташкил қилади. n-Cl-феноксисирка кислотасининг ҳиқилдоқ ўсимтаси учун
IC

50

=52 мМ/л (10 мкг/мл), LD

50

=81-92 мг/кг, кутилаётган терапевтик доза эса

1-10 мг/кг бўлиб, бунда ҳиқилдоқ ўсимтаси ингибирланади. Қўйилган
вазифаларнинг биринчи бўлимини –

ўсимта ҳужайралари

ингибиторларини аниқлаш ишлари

ни бажарилиши натижасида

Сonvolvulus krauseanus

ўсимлигининг ер устки қисмидан,

Arundo donax

ўсимлигининг илдизидан олинган алкалоидлар йиғиндилари ҳиқилдоқ
ўсимтасини ингибирлаб, нормал ҳужайраларга нисбатан қуйи токсикликни
намоён қилмода.

Vinca major

ўсимлигининг илдиз алкалоидлари йиғиндиси

бачадон бўйи ўсимтасини ингибирлаб, бошқа, жумладан, нормал
ҳужайраларда бундай таъсир курсатмайди.

Vinca

туркум ўсимликларида

паразитловчи эндофит замбуруғлар экстрактларидан нормал ҳужайралар учун
қуйи ўсимта ҳужайралари учун юқори токсикликни намоён қилувчи –
Alternaria sp (

V. erecta

баргларида), Penicillium sp (

V. erecta

барглари,

V. мinor

поясида),

Aspergillius tureus

(

V. erecta

илдизи) экстрактлар ажратиб олинган.

Индивидуал бирикмалардан нормал ҳужайраларга қуйи токсиклик намоён
қилувчи, ҳиқилдоқ ўсимтасига танлаб таъсир этувчи иккита – N-бензил
конвольвин ва n-Cl-феноксисирка кислота ҳамда танламай таъсир қилувчи
ҳиқилдоқ, сут бези ва бачадон бўйи ўсимталари ингибиторларининг иккитаси
– n-Cl-ацетилфенилсирка кислота ва фенилгидразон норфлуорокурарин
йодметилати. Ўрганилган индивидуал бирикмалардан иккита хлорсақловчи
бирикмалар – фенилгидразон норфлуорокурарин хлоргидрати ва N
хлорацетил конвольвин Цисплатинга ўхшаш цитотоксик фаоллик намоён
қилган ва кейинчалик ўсимтага қарши

in vivo

тажрибаларини олиб бориш

мумкин

.

Кейинги вазифалардан бири сифатида

регенератив тиббиёт учун

нормал ҳужайралар пролифераторларини аниқлаш

бўйича изланишлар

амалга оширилган.

Маълумки, флаваноидлар ва фитостероидлар оқсил биосинтезини

индуциялаши ҳамда нормал ҳужайраларнинг пролифераторлари бўлиши
мумкин. Пролифераторларни аниқлаш регенератив тиббиёт, косметология ва
спорт учун жуда муҳим.

Шу

сабабли

ЎзР

ФА

ЎМКИ

Экспериментал

технологик

лабораториясида (А.У.Маматханов раҳбарлиги остида) ажратиб олинган
фитостероидлар ва уларнинг йиғиндисини (

Ajuga turkestanica

ўсимлигидан

ажратиб олинган экдистерон ва туркестерон ҳамда аюстан – фитостероидлар,
иридоидлар ҳамда бошқа бирикмалар йиғиндиси), флавоноидларни (

Ferula

tenusecta

ўсимлигининг илдизидан олинган панаферол,

Ferula kuchistanica

ер

устки қисмдан ажратиб олинган куфестрол,

Ferula varia

ер устки қисмидан

ажратиб олинган цинарозид,

Glyssiriza glabra

ўсимлигининг ер устки

21

қисмидан ажратиб олинадиган пиносембрин ва глабронина) пролифератив


background image

фаоллигини тадқиқ қилишни долзарб деб ҳисобладик. Тадқиқотлар ФҲК
нинг 5-7 пассажаларида олиб борилган. Барча ўрганилган флавоноидлар ва
“Аюстан”

препарати

0,3-100

мкг/мл

концентрацияларида

сезиларли

пролифератив фаоллик намоён қилмаган, туркестерон ҳамда экдистерон
фитостероидлари эса бундан мустасно (8-жадвал).

8-жадвал

Флавоноидлар ва фитостероидларнинг ФҲКда

пролифератив фаоллиги (М ± м, n = 3)

Моддалар

Фибробластларнинг тирик ҳужайралари проценти, %

100
мкг/мл

50 мкг/мл

25
мкг/мл

12,5
мкг/мл

6,25
мкг/мл

3,12
мкг/мл

1,6
мкг/мл

0,8
мкг/мл

Аюстан

67±0,11

62±0,22

78±0,3

64±0,11

89±0,22

72±0,21

94±0,23

106±0,
3

Туркестерон

125±4,
3

130±6,0

142±5,
1

178±2,5

159±5,
2

130±7,26

100±4,
5

100±7,
3

Экдистерон

91±8,7

90±3,5

101±4,
2

180±9,2

130±5,
3

134±9,
5

146±7,
3

100±5,
3

Панаферол

0±0,02

0±0,2

0±0,1

0±0,05

0±0,1

0±0,2

48,9±2,3

74±3,3

Пиносембрин

0±0,1

0±0,05

0±0,02

14±0,6

105±8,
3

119±4,
3

106±9,
2

99±4,3

Цинарозид

58±11,2

93±9,3

75±2,1

79±9,7

91,5±6,2

91,4±6,0

81,8±6,1

84±7,1

Глабронин

23±4,2

72,9±8,6

76,3±4,9

112±1,2

113±9,
3

108±11,4

107±7,
2

105±4,
5

Пурнетин

0±0,1

0±0,02

0±0,01

47±2,2

135±9,
5

122±11,5

97±7,7

110±5,
5

Назорат

100%

Изоҳ:

назоратдан ишонарли фарқи Р<0,05; * Р<0,01.

8 жадвалда кўриниб турибдики, индивидуал фитостероидлар

экдистерон ва туркестеронга эга бўлиб, пролиферация пики 12,5 мкг/мл
концентрациясига тўғри келди ва пролиферация даражаси 180 % ни ташкил
қилди. Бунда туркестерон концентрацияси 10 мкг/млга туширилганда,
фаоллиги тенглашиши кузатилди.

Фитостероидларнинг

фаоллиги

бўйича

кўплаб

қарама-қарши

маълумотларнинг мавжудлиги, уларни тиббиёт, спорт ва косметологияда
ишлатилишини ҳисобга олган ҳолда тиббиётда кенг қўлланилаётган,
пролифератив

фаол

бўлган

экдистерон

фитотстероидини

ўсимта

ҳужайралари культураларида синаб, унинг ҳавфсизлигини аниқлаш мақсад
қилинди (9-жадвал).

9-жадвал

Экдистероннинг пролифератив фаоллигини ўсма ҳужайраларида


background image

тадқиқ қилиш (М ± м, n = 9, Р<0,05)

Тирик ҳужайралар, %

Мкг/мл

HeLa

HEp-2

HBL-100

100

25

12,5

3,12

10
0

25

12,5

3,12

100

25

12,
5

3,12

Экдисте
рон

54±

2,3

62±

5,9

62±

4,2

65±
2,3

72
±
5,3

80±

4,
8

87±
2,7

74
±
3,2

100±

16,4

100±

13,
9

97±
5,8

69±
9,4

Цисплатин

0

0

2,8±

0,2

32±
2,4

0

0

3±
0,2

48
±
3,1

0

0

0

30±
2,9

Назорат

100

9

жадвалдан

кўриниб

турибдики,

экдистерон

ўрганилган

концентрацияларда (3,12-100 мкг/мл) ўсимта ҳужайраларига нисбатан кучсиз
цитотоксик фаоллик намоён қилган.

22

Зотан,

тиббиёт

ва

спортда

кенг

қўлланилаётган

экдистерон

фитостероиди 3,12-100 мкг/мл концентрациясида ўсимта ҳужайралари
пролиферациясини келтириб чиқармайди, шунинг учун уни хавфсиз
анаболик ва пролифератор деб санаш мумкин.

Ушбу пролифератордан кейинги тадқиқот ишларида фойдаланилди.

Оптималлаштирган услубимиз ёрдамида қуён терисининг фибробласт ва
кератиноцитлар ҳужайра культуралари олиниб, IV типдаги коллаген ажратиб
олинган

ҳамда

икки

турдаги

тўқима-муҳандислик

конструкциялари

яратилган: 1) коллаген гелда фақат фибробластлар – дермал эквивалент (ДЭ);
2) коллаген гельда фибробластлар (ДЭ) ва кератиноцит ҳужайралар
культураси (ДЭ+КҲК) ўстирилган; 3) биринчи ДЭ конструкциясига,
фибробластлар ўстириш муҳитига 12,5 мкг/мл концентрациясида экдистерон
қўшилди

(ДЭ+экдистерон).

Регенератив

тиббиёт

учун

муносиб

конструкцияни топиш ва биз олган ҳужайра культураларининг ушбу
мақсадларга

лойиқлигини

тасдиқлаш

мақсадида

куйган

яраларда

конструкциялар ўтказилди.

Бунинг учун қуёнларнинг қирилган ёлига махсус электр асбоб

ёрдамида IIIА даражали 3 см

2

майдонга, ҳар бир ҳайвонга 4 тадан термик

куйишлар етказилди. Ярани ўлган тўқималардан тозалаб, антисептик восита
билан ишлов берилгандан сўнг яраларга Петри палласидан оҳисталик билан
олинган тўқима конструкциялари имплантация қилинди. Ҳар бир ҳайвоннинг
бир ярасига фақат ДЭ тортилди. Бошқа ярасига ДЭ билан пролифератив фаол
концентрациядаги (12,5 мкг/мл) экдистерон суртилди. Яна бир ярасига
ДЭ+КБК тортилди. Охирги яра назорат бўлиб, ҳеч нарса тортилмади. Яна


background image

бир қуёнга ўлган тўқималарни олиб ташлагандан сўнг экдистерон
эритмасини (12,5 мкг/мл) ДМЕМ/F12 муҳитида суртилди.

Куйган яраларни регенерация қилиш экспериментлари натижалари (10-

жадвал).

10-жадвал

ДЭ ва фитоэкдистероиднинг яралар сатҳи ва битиш мудатига

таъсири (М ± м, n = 10, Р < 0,05)

Тажриба
шароити

Ярани ўртача сатхи, см

2

Яралар регенерацияси

муддати

5 сутка

10 сутка

15 сутка

20 сутка

Суткалар

ДЭ

2,3±0,09

1,3±0,11

0,9±0,0
8

0,6±0,0
6

22,9±1,1

ДЭ + экдистерон

2,2±0,13

1,2±0,07

0,7±0,0
6

0,2±0,0
9

20,1±0,2

ДЭ + КҲК

2,2±0,11

1,2±0,12

0,6±0,0
9

0,1±0,0
9

19,9±0,2

Экдистерон

2,7±0,5

1,9±0,2

1,6±0,05

1,1±0,03

33±0,1

Назорат

2,9±0,14

2,2±0,1
6

1,9±0,02

1,5±0,07

38,9±0,6

Изоҳ: яраларнинг битиш муддати тўлиқ эпителизациясида белгиланган.

10-жадвалдан кўриниб турибдики, даволанмаган яралар ўртача 38,3-

39,5 кунда, тўқима-муҳандислик конструкцияли яралар 2 баробар тез
битмоқда. Бунда, коллаген, фибробластлар ва кератиноцитлардан иборат
мураккаб конструкция (ДЭ + КҲК) (назоратга нисбатан 18,4 – 19,4 сутка

23

аввал), коллаген ва фибробластлардан ҳамда экдистерон қўшимчаси (ДЭ +

экдистерон)

мавжуд

конструкция

билан

тенг

вақтда

тўқималарни

регенерациясига имкон бермоқда. Шу қаторда ДЭ ва экдистерон алоҳида
ҳолда регенерация жараёнига таъсир самараси кучсиз намоён бўлди. Фақат
ДЭ билан ишлов берилган яралар назоратга нисбатан 15,5 – 16,5 сутка олдин
битиб, экдистерон билан ишлов берилганлари назоратдан 5,4 – 6,4 сутка
олдин битиб кетиши кузатилди.

Шундай қилиб,

in vivo

тажрибаси шуни кўрсатдики, регенератив

тиббиётда тўқима конструкциялари билан биргаликда, экдистерон реципиент
терисида регенератив жараёнларни фаоллаштириб, ҳеч нима билан ишлов
берилмаган яраларга нисбатан 2 баробар тез битади ва биз олган тери
ҳужайраларининг культуралари регенератив тиббиёт учун қулай бўлади.
Бундан ташқари, ушбу мақсадлар учун коллагенли тагликда экдистеронли


background image

муҳитда

(ДЭ+экдистерон)

ўстирилган

фибробластлардан

иборат

соддалаштирилган конструкциядан фойдаланиш самараси бўйича анча
қимматбаҳо ва кўп меҳнатни талаб қилувчи кератиноцитли конструкцияга –
ДЭ+ КҲК тенгдир. Шу сабабли куйган ва бошқа узоқ битмаётган яраларни
даволашда коллагенли тагликда экдистеронли муҳитда (ДЭ+экдистерон)
ўстирилган фибробластлардан иборат соддалаштирилган конструкциядан
фойдаланиш энг мақбули, деб ҳисоблаймиз.

Тўртинчи бобда

нормал ва хатарли трансформацияланган ҳужайра

культураларини

рекомбинант

эритропоэтинга

қарши

моноклонал

антитаналар олиш учун фойдаланиш натижалари ва олинган антитаналарни
амалий қўллаши ҳақида маълумотлар келтирилган.

Ўсишнинг гемопоэтик омили – ЭПО эритроцитлар ҳосил қилиш

регуляциясида иштирок этади. ЭПО асосидаги препаратлар ЖССТ таклифига
асосан

тиббиёт

амалиётида химиотерапия ва радиотерапия ўтувчи

онкобеморлар ҳамда вирус билан инфекцияланганларни даволаш стандартига
қиритилган ва аҳволининг коррекцияси ҳамда турли келиб чиқишга эга
анемияни даволашда фойдаланилади. МКАТ-ЭПО биологик суюқликларда
ЭПО миқдорини аниқловчи диагностик тест-системалар яратиш учун ҳамда
табиий вар ЭПО олишда иммуносорбент сифатида ишлатилади.

рЭПО ва унга қарши антитаналардан кенг фойдаланилиши сабабли

МКАТ-ЭПОни гибридом технология ёрдамида олишни мақсад қилиб олдик.
Асосий мақсадимиз МКАТ-ЭПОни ЭПОни аниқловчи тест-системада қўллаш
ва кейинчалик рЭПОни тозалашда ундан иммуносорбент сифатида
фойдаланиш эди.

Маълумки, гибридомлар иммунизацияланган ҳайвонларнинг нормал

лимфоцитларини миелома штаммлари билан қўшилиши орқали олинади. Шу
сабабли биринчи даражали вазифа бу – агентларнинг қўшилиши учун
тайёрлаш. ЭПО сут эмизувчиларда ишлаб чиқишини ҳисобга олган ҳолда
иммун ҳаракатни юзага келтириш учун ҳайвонларнинг иммунизациялаш
схемасини ишлаб чиқиш анча мушкул.

BALB/c сичқонларининг эритропоэтинга қарши антитаналарнинг энг

катта титрини берувчи рекомбинант эритропоэтин билан иммунлашнинг

24

оптимал схемаси меъёрига етказилди. Уч ҳафталик 15-20 граммли BALB/c

линияси сичқонларга қорин соҳасига 4 мкг оқсил сақловчи 0,5 мл рЭПО
суспензиясини

(«Recormon»,

Roche,

Швейцария) Фрейнднинг тўлиқ

адъювантини (ПАФ) юбордик ва бир ҳафтадан кейин иммунизация жараёни
Фрейнднинг тўлиқсиз адъюванти (НАФ) билан қайтарилди. Сичқонлар
иммунизациясининг икки циклидан сўнг уларни бир ҳафта оралиғида икки
марта 15% додецилсульфат натрий иштирокида полиакриламидли гелга
адсорбцияланган рЭПО (гель-рЭПО) билан иммунизацияладик. Икки
ҳафтадан сўнг бустерли равишда 0,1 мл (9,8 мкг) рЭПО юборилган ва
синалган. Параллел равишда сичқонларни рЭПО билан стандарт схема
бўйича иммунизацияладик. Бунда қорин соҳасига кетма кет рЭПО суспензия


background image

билан бирга, ПАФ ва НАФ, кейин бустер равишда 9,8 мкг рЭПО юборилган
ва синалган. Ҳар бир циклдан сўнг ва иммунизация охирида қон зардоби
олиниб, антитаналарни ЭПОга қарши Оухтерлони усули билан титрланди
(гелда қўш диффузия). Биз ишлаб чиққан такомиллаштирилган иммунизация
схемаси бўйича антитаналарнинг якуний титри 1:512 ни ташкил этганда,
иммунизациянинг стандарт схемасидагги титр 1:128 дан ошмади.

Сўнг сичқон X Ag 8.653 миеломасининг ишлаб чиқилган рЭПО билан

иммунизация қилинган BALB/c линияси сичқонларининг спленоцитлари
билан полиэтиленгликолда (ПЭГ) қўшилиши натижасида гибридомлар
олинди.

Қўшилиш жараёни тугагандан сўнг чўкма ГАТ (гипоксантин,

амидоптерин, тимидин) муҳитида ресуспензияланди. Ҳужайралар 96
катакчали культурал планшетларга ўтказиб чиқилди. Бир кун олдин
катакчаларга

синген

сичқонларнинг

макрофаглари

ўтказилиб,

СО

2

-

инкубаторида ўстирилди. Гибрид ҳужайраларнинг клонлари бир ҳафтадан
сўнг пайдо бўлди. 192 катакчадан 45 тасидагина гибридомлар ҳосил бўлгани
кузатилди (5-расм).

5-расм. Гибрид ҳужайралар колонияларининг пайдо бўлиши

(сичқон X Ag 8.653 миеломасини рЭПО билан иммунизация қилинган
BALB/c линияси сичқонларини спленоцитлари билан қўшилишининг
3-5 куни), микрофото, ок. ×10, об. ×40

25

Қўшилишдан кейин, 3 ҳафтасидан сўнг ГАТ муҳитини селектив

қўшимчаларсиз ўстириш муҳитига алмаштирилди ва қўшилишдан кейин 14-
кунида қаттиқ фазали иммунофермент анализ (ИФА) усули ёрдамида ИФА
учун мўлжалланган рЭПОли полистиролли планшетларда рЭПОга қарши
антитана ишлаб чиқувчи клон-продуцентлар аниқланди. Антиген – антитана
комплексини

пайдо

бўлишини

пероксидаза

билан

белги

солинган

сичқонларнинг анти-IgG ёрдамида аниқланди. Ўлчашлар натижасини ижобий
санашнинг омиллари – бу намунинг оптик зичлиги салбий назоратникидан
икки ва ундан ортиқ баробарда ортиқ бўлиши деб қабул қилинди. Тестлардан
сўнг МКАТ- ЭПО продуцентлари – 12-гибридомлар аниқланган. Гибридом


background image

продуцентлар сақловчи 12 катакчадан гибрид-ҳужайралар 3-5 ҳужайрадан

бошқа

катакчаларга

ўтказилди

(катакчаларга

олдиндан макрофаглар

ўтказилади). 7-10 кундан кейин пайдо бўлган клонларнинг культурал
суюқлик аликвоталари МКАТ-ЭПО сақланиши бўйича ИФА усули ёрдамида
скрининг қилиб борилади. Бунда 96 катакчали планшетлар туби рЭПО
(«Recormon»)

билан

иммобилизация

қилинади.

Аниқланган

клон

продуцентлар лимитловчи ўстириш усули ёрдамида бир катакчага 1
ҳужайрадан реклонланди. Сўнг яна бир бор ИФА усулида клон

продуцентларнинг аниқлаш ишлари амалга оширилди.

Клон-продуцентларни реклонлаб, серияли пассажлардан сўнг

продуктив клонларни оммавий культурага олиб чиқилди. Бунинг учун 96
катакли культурал планшетда кўпайган ҳужайраларни 24 катаклисига, кейин
4 катаклисига олиб ўтилди ва ундан кейин барқарор гибридомлар 25 – 50
млли культурал флаконларга ўтказилди.

Клонларнинг

барқарорлигини

текшириш

мақсадида

клонлар

музлатилди ва эритиб олинди. Сўнг қайта ўстирилиб, реклонланди. Бундан
кейин скрининг ва селекция натижасида МКАТ- ЭПО ишлаб чиқарувчи Е10
(ОЗ = 2.8) ва С9 (ОЗ = 2.8) гибридомасининг 2 та субклонлари танлаб олинди.
Самарали штаммга ЭЕ10С9 белгисини қўйдик. Гибрид ҳужайраларнинг
олинган штамми ЎзР Микробиология институтининг Ҳужайра культуралари
банкида рўйхатга олиш рақами № СКБ 169 остида депозитга қўйилди (№ IAP
02943, 16.12.2002 й.).

МКАТ-ЭПОни кўп миқдорда ишлаб чиқиш учун гибридом – продуцентлар

битта сичқонга 1х10

6

сонида BALB/c линияси сичқонларининг қорин соҳасига

юборилди. Бундан бир сутка олдин ҳайвонларга 0,5 млдан НАФ

инъекциялари қилинган эди. Бир ҳафтадан сўнг сичқонларда асцит (6 мл гача)

вужудга келди Антитаналар концентрацияси 6-10 мг/мл оралиғида эди.

Олинган асцит суюқликлар МКАТ-ЭПО мавжудлиги ҳамда ушбу

антитананинг рЭПО, табиий ЭПО ва иккита препарат: «Roferon» (альфа-2а
рекомбинант интерферон) ва «Neupogen» (ўсишнинг гемопоэтик омили,
нейтрофилларни ишлаб чиқиши ва уларнинг иликдан периферик қонга
ўтишини бошқаради) билан чапараста ўзаро таъсирлашуви синалди (11-
жадвал).

26

11-жадвал

МКАТ-ЭПОнинг бошқа препаратлар билан асцит суюқликларда ўзаро

таъсирлашув ИФАси, оптик зичлик кўрсатилган

Асцит

суюқликн
и эритиш

Оптик зичлик

рЭПО

Плацента

р қон
зардоби

Roferon

Neupogen


background image

Яхлит

1,888

0,740

0,233

0,223

2 баробар

1,602

0,746

0,253

0,266

4 баробар

1,455

1,085

0,234

0,246

8 баробар

1,454

1,082

0,201

О,205

16 баробар

0,745

0,905

0,232

0,216

32 баробар

0,495

0,495

0,233

0,253

64 баробар

3000

0,403

0,228

0,213

128 баробар

3000

0,213

- К

2,346

+ К

0,086

Фон

Изоҳ:

-

К

– салбий назорат (1

х

PBS),

+K

– ижобий назорат («Roche» (Швейцария)

фирмасининг «EPO-ELISA» тўпламидан).

11-жадвалдан кўриниб турибдики, асцит суюқликлари таркибида қон

зардобидаги табиий ЭПО ва рЭПО билан таъсирлашувчи, интерферон ва
нейтрофилларни ўсиш фактори билан таъсирлашмайдиган МКАТ-ЭПО
мавжуд.

МКАТ-ЭПОни культурал ва асцит суюқликларидан сульфат аммоний

эритмаси билан икки марта чўктириш йўли билан олинган. Сўнг
тузсизлантириш G-25 сефадексда олиб борилди. Якуний тозалашни 5 мМ
натрий-фосфат буфери, рН 8,0 билан ишлов берилган ДЭAЭ-целлюлозали
колонкада олиб борилди. Колонка 0 дан 0.25 М NaCl эритмаси билан ювилди

(6-расм).

6-расм. 5 мМ натрий-фосфат буфери, рН 8,0ли NaCl градиенти

билан тенглаштирилган ДЭAЭ-целлюлозали колонкада МКАТ-ЭПО
ювилиш профили.

Натижада юқори тозаликдаги МКАТ-ЭПО фракциялари олинди ва

лиофил тарзда қуритилди.

Антитаналарнинг гомогенлиги Lаemmli усули ёрдамида полиакриламид

гелда, натрий додецилсульфати иштирокида баҳоланди (7-расм).

27


background image

7-расм.

Қайтарилувчи шароитда (меркаптоэтанол) МКАТни

ЭПОга 12% ПААГ-SDS даги электрофореграммаси:

биринчи чизиқ –

маркерлар (миозин - 250 кДа, фосфорилаза - 98 кДа, глютамин дегидрогеназа - 64
кДа, алкогол дегидрогеназа - 50 кДа, карбоангидраза - 36 кДа, миоглобин - 30 кДа,
лизозим - 16 кДа); иккинчи ва учинчи чизиқлар – 2 субклонларнинг тозаланган
МКАТ-ЭПОси.

Тикланувчи шароитларда олиб борилган электрофорез усули ёрдамида

олинган моноклонал антитаналарнинг енгил занжирлари молекуляр массаси
23.000 Да, оғирларини эса 52,000 Да тенг ва ушбу антитаналарни G синфига
мансублигини тасдиқлайди.

МКАТнинг ЭПО антиген детерминанталари билан таъсирлашувининг

хусусиятини аниқлаш мақсадида тўғри ИФА олиб борилди. Бунинг учун
антиген (АГ) сифатида 96 катакли планшетга 60 мкг/мл концентрацияда
рЭПО (“Roche”, Швейцария), натив ЭПО (“Протеиновый контур”, РФ) ва

плацентар қон зардоби сорбция қилинди. Антитана (АТ) сифатида биз олган
МКАТ-ЭПО хизмат қилди (12-жадвал).

12-жадвал

ИФА усули билан МКАТ-ЭПО хусусиятинг аниқлаш

МК
АТ
ЭПО
,

мкг/мл

ИФА олиб бориш учун пластикка сорбцияланган антигенлар

рЭПО,

«Recormon
»

Табиий ЭПО,
«Протеиновый контур»

плацентар
қон зардоби

+K

-

К

20

3,000

3,000

1,120

3,000

0,110

15

1,980

2,800

0,770

3,000

0,100

10

1,900

1,890

0,430

2,790

0,110

5

1,290

1,500

0,200

1,850

0,150

2,5

0,950

1,150

0,150

1,340

0,110

1,7

0,430

0,860

0,120

0,850 Фон 0,09

Изоҳ:

-

К

– салбий назорат (1

х

PBS),

+K

– ижобий назорат - рЭПО («Roche»,

Швейцария) ва МКАТ-ЭПО «EPO-ELISA» («Roche», Швейцария)


background image

12-жадвалдан кўриниб турибдики, биз олган МКАТ-ЭПО ҳам табиий

ЭПО («Протеиновый контур») ҳам рЭПО билан чапараста ўзаро
таъсирлашиб, ўзининг фаоллиги бўйича «EPO-ELISA» («Roche», Швейцария)
МКАТ-ЭПОсидан қолишмайди.

Антитаналар титри ҳам ИФА ёрдамида. Культурал суюқликдаги

антитаналар

титри

2

х

10

4

ташкил

қилган,

асцит

суюқликдаги

антитаналарнинг юқори титри- 1 х 10

7

кўрсатмоқда

.

Тозаланган МКАТ-ЭПО

28

умумий фракция энг титрни 4 х 10

7

намоён қилди. Шундай қилиб МКАТ

ЭПО олинди, ажратилди, тозаланди ва тавсифланди.

Олинган

МКАТ-ЭПОнинг

иммуносорбент

сифатида

аффин

хроматография усули ёрдамида плацента қон зардобидан ЭПО препаратив
олиш ва тозалашда самарасини синаш мақсадида ажратиб олинган ва
тозаланган МКАТ-ЭПО асосида иммуносорбент яратилди – BrCN-сефароза
4В – МКАТ-ЭПО). Иммуносорбент антитаналарни BrCN-сефароза 4В билан
коньюгациялаш йўли орқали тайёрланди. Бунинг учун BrCN билан
фаоллаштирилган ва 1мМ HCl эритмасида бўктирилган 1г 4В сефарозага
олинган МКАТ-ЭПО 3 мл. (15 мг/мл) қўшилиб 12 соат инкубация қилинди.
Антитаналар диализ йўли билан 0,5M NaCl сақлаган 0,1М натрий-карбонатли
буфер эритмага олинди (рН 8,3). Антитаналар адсорбциясидан сўнг
сефарозали суспензияни 0,1М натрий-карбонатли буфер (рН 8,3) билан
ювилиб сўнгра 1М этаноламин (рН 9) эритмаси қўшилди. Бундан кейин
сорбент 1M NaCl сақлаган 0,1М натрий-карбонатли буфер (рН 8), 1М NaCl
сақлаган 0,1М натрий-ацетатли буфер (рН 4) ва якунда 1M NaCl сақлаган
0,1М натрий-боратли буфер, (рН 8,5) эритмалари билан кетма-кет тартибда
ювилди. 1x10 см колонка эритропоэтинга қарши 30 мг антитаналар сақловчи
гель билан тўлдирилди.

ЭПО плацентар қон зардобидан ажратилиб, қоннинг шаклли

элементлари чиқариб ташланди, таркибида 3,75 мМ NaCl ва 1 %
фенилметилсульфонилфлуорид эритмаси бўлган 25 мМ фосфат буферда (рН
4,5) диализ қилинди. Сўнг балласт моддалар ДЕАЕ целлюлоза-52да олиб
ташланди. ДЕАЕ целлюлоза-52 дан ЭПО ни таркибида 0,5 М NaCl ва 1%
фенилметилсульфонилфлуорид эритмаси мавжуд 0,1 М натрий фосфат
буфери (рН 4,5) билан ювиб олинди. Элюат сувда диализ қилиниб лиофил
қуритилди. Лиофил қуритилган ЭПО сақловчи фракциялар 0,5 М NaCl
эритмаси сақлаган 0,1 М натрий-боратли буферда (рН 8,5) эритилди ва 5 мл
оқсил (концентрация 3 мг/мл) эритмаси BrCN-сефарозой 4В – МКАТ-ЭПО
биосорбентли колонкага солинди. Боғланмаган оқсиллар шу буферни ўзида
олиб чиқади. Кейинчалик оқсил элюцияси кетма-кет 0,5М NaCl сақловчи,
рН=3,2 бўлган 0,1М натрий-ацетатли буфер билан ҳамда 1MNaCl сақловчи,
рН=3,2 бўлган 0,5М натрий ацетатли буфер билан давом эттирилган.
Фракцияларнинг оптик зичлиги фракций 280 нм тўлқин узунлигида амалга
оширилди (8-расм).


background image

8-расм. Таббий ЭПОнинг BrCN-сефароза 4В-МКАТ-ЭПОли

аффинли хроматографиядаги элюция кўрсаткичи.

Колонка 1х10 см рН 8,5

бўлган 0,1 М Na-боратли буфер билан тенглаштирилган.

29

Оқсилнинг 3 фракцияси олиниб ИФА ёрдамида оқсилнинг иккинчи

фракциясидаги ЭПО миқдори (ОП=0,979) аниқланди. Учинчи фракцияда ҳам
ЭПО миқдорининг (ОП=0,507) аниқланиши ЭПО фракцияларининг турли
аффинлигига далолат бўлади. II ва III фракцияларни бирлаштириб,
дистилланган сувда диализ қилинди ва лиофил қуритилди.

Бирлаштирилган фракциянинг гомогенлиги Lаemmli усули ёрдамида

гель-электрофорез усулида аниқланган (9-расм).

9-расм. ЭПО фракцияларининг β-меркаптоэтанол иштирокида

12% ПААГ-SDS даги электрофореграммаси:

1 - маркер оқсилларни

аралашмаси (фосфорилаза В – 96 кДа, буқанинг зардоб альбумини - 67 кДа,
овалбумин – 43 кДа, соядан олинган трипсин ингибитори - 24 кДа.), 2 – аффинли
хроматографиядан сўнг ЭПО фракцияси, 3 – дастлабки ЭПО фракцияси,
хроматографиядан олдин.

Олинган ЭПО молекуляр массаси 32-36 кДа атрофида бўлиб

адабиётларда келтирилган маълумотлар билан мос келади ва ЭПОнинг турли
даражада гликозалашганига боғлиқ.

Хуллас, олинган МКАТ-ЭПО табиий ва рекомбинант ЭПО олишда

аффин хроматографияда, нафақат диагностик тест-система компонентлари,
балки биосорбент сифатида катта миқдорда рЭПОни ажратиб олишда ҳам
қўллаш мумкин.

ХУЛОСАЛАР

1.

Vinca

туркум ўсимликлари ва уларда паразитловчи эндофит

замубуруғларнинг

экстрактларининг

цитотоксик

фаоллиги

ҳиқилдоқ


background image

ўсимтаси - HEp-2, бачадон бўйни ўсимтаси - HeLa, сут бези ўсимтаси - HBL
100 ва фибробластлар, гепатоцитларнинг нормал ҳужайраларида ўрганилди.
Ўсимлик ва замбуруғ экстрактлари цитотоксик фаолликка эгалиги аниқланди.
Бунда Vinca major ўсимлигининг илдизидан олинган экстракт

HeLa

ҳужайраларига,

V. erecta

ўсимлигининг баргларида паразитловчи

Alternaria sp

эндофит

паразит

замбуруғнинг

экстракти

эса

HBL-100

ўсимтаси

ҳужайраларига кўпроқ танлаб таъсир қилиб, нормал ҳужайраларга нисбатан
қуйи цитотоксиклик намоён қилади.

2.

Сonvolvulus, Arundo

ва

Buxus

туркумларига мансуб ўсимликларнинг

алкалоидлар йиғиндисининг таъсири ўрганилди.

Сonvolvulus krauseanus

ер

устки қисми олинган алкалоидлар йиғиндиси HEp-2 ҳужайраларини ва

30

Arundo donax

илдизларидан олинган алкалоидлар йиғиндиси эса HEp-2 ва

HeLa

ҳужайраларини

ингибирлаб

фибробластларга

нисбатан

қуйи

цитотоксиклик намоён қилиши аниқланди.

3.

Сonvolvulus

туркум ўсимликларидан ажратиб олинган индивидуал

алкалоидлар ва ҳосилаларининг цитотоксик фаоллиги ўрганилди. Ушбу
бирикмаларнинг цитотоксиклиги алкалоиднинг тропан қолдиғидаги азот
атомига бириккан радикал табиатига боғлиқлиги аниқланди. HEp-2
ҳужайраларини ингибирлаб (IC

50

= 12,3 мМ/л), фибробласт ҳужайраларида

қуйи цитотоксиклик намоён қилувчи (IC

50

= 32,8 мМ/л) танлаб таъсир қилиш

ҳусусияти юқорилиги билан N-бензил конвольвин ажралиб туради.

4.

Vinca erecta

ўсимлигидан олинган норфлуорокурарин ва унинг

ҳосилаларининг цитотоксик фаоллиги ўрганилди. Ушбу бирикмалар орасида
энг кўп танлаб таъсир қилиш ҳусусиятини норфлуорокурарин фенилгидразон
йодметилати намоён қилиб HEp-2, HeLa ва HBL-100 (IC

50

= 19,1 мМ/л барча

ўсимта ҳужайралари учун) ҳужайраларини ингибирлаб фибробластларга
нисбатан қуйи токсиклик (IC

50

= 95,5 мМ/л) намоён қилиши аниқланди.

5.

Фенил-

ва

феноксисирка

кислоталарининг

ҳосилаларининг

цитотоксик фаоллиги ўрганилди. n-Cl-феноксисирка кислота ҳиқилдоқ
ўсимтаси ҳужайраларига танлаб таъсир қилувчи ингибиторлик (IC

50

= 5,2-52

мМ/л) ва нормал ҳужайраларга қуйи цитотоксик фаоллик (IC

50

= 442 мМ/л)

намоён қилиши аниқланди. n-Cl-ацетилфенилсирка кислотаси Hep-2, HeLa ва

HBL-100

ҳужайраларини ингибирлаб (IC

50

= 4,7-5 мМ/л) нормал

ҳужайраларга паст цитотоксиклик (IC

50

= 94 мМ/л) намоён қилиши

аниқланди.

6.

Фитостероидларнинг

пролифератив

фаоллиги

ўрганилди.

Ўрганилган фитостероид – экдистерон эса Hep-2, HeLa ва HBL-100 ўсимта
ҳужайраларини 15% ингибирлаб, фибробластлар ҳамда кератиноцитларнинг
яхши пролифератори эканлиги аниқланди.

7. Куйган яраларни даволашда коллаген асосдаги фибробластлардан

иборат

тўқима-муҳандислик

конструкцияларини

олиш

усули

такомиллаштирилди. Тўқима-муҳандислик конструкциялари билан бирга


background image

экдистерондан

фойдаланиш

аутокератиноцитлар

бўлинишини

жадаллаштириб эпителизацияни 2 баробарга тезлаштириши белгилаб ўтилди.

8. Рекомбинант эритропоэтинга қарши моноклонал антитаналарни

ишлаб чиқувчи гибридомалар олинди. Улардан препаратив миқдорда рЭПОга
қарши моноклонал антитаналар олишда фойдаланиш мумкин бўлган гибрид
ҳужайра-продуцентларининг истиқболли иккита субклони ажратиб олинди.

9. Асцит суюқликдан рекомбинант эритропоэтинга қарши моноклонал

антитаналар ажратиб олинди, тозаланди ва тавсифланди. Олинган МКАТ
ЭПО ҳам плазма эритропоэтини ҳам рекомбинант эритропоэтини билан
ўзаро таъсирлашиши ва IgG синфига мансуб эканлиги аниқланди. Асцит
суюқликда антитаналар титри 1x10

7

, культурал суюқликдагиси - 2 х 10

4

ташкил қилди. Тозаланган МКАТ-ЭПО фракцияси юқори титрни кўрсатиб
4x10

7

ташкил қилди.

31

10. Эритропоэтинга қарши моноклонал антитаналар асосида яратилган

иммунносорбентда плацентар қон зардобидан одам эритропоэтини ажратиб
олиш усули ишлаб чиқилди.

11. «Доривор воситалар, тиббий жиҳозлари, косметик воситалар,

кимёвий

бирикмалар,

пестицидлар

ва

ветеринария

воситалари

цитотоксиклигини баҳолаш» услубий кўрсатма тасдиқланган (ЎзР ССВ, №
8Н-Р/18, 02.03.2016 й.).


background image

32

НАУЧНЫЙ СОВЕТ 16.07.2013.К/В/Т.13.01 ПРИ ИНСТИТУТЕ

БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ И НАЦИОНАЛЬНОМ

УНИВЕРСИТЕТЕ УЗБЕКИСТАНА ПО ПРИСУЖДЕНИЮ УЧЕНОЙ

СТЕПЕНИ ДОКТОРА НАУК

ИНСТИТУТ ХИМИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ


background image

ЦЕОМАШКО НАТАЛЬЯ ЕВГЕНЬЕВНА

ПРИМЕНЕНИЕ КУЛЬТУР КЛЕТОК (НОРМАЛЬНЫХ И

ЗЛОКАЧЕСТВЕННО ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ) ДЛЯ СКРИНИНГА

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ И ПОЛУЧЕНИЯ

МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

02.00.10 – Биоорганическая химия

(биологические науки)

АВТОРЕФЕРАТ ДОКТОРСКОЙ ДИССЕРТАЦИИ

ТАШКЕНТ – 2016

33

Тема докторской диссертации зарегистрирована в Высшей аттестационной

комиссии

при

Кабинете

Министров

Республики

Узбекистан,

за

номером

30.09.2014/В2014.5.В69

Докторская диссертация выполнена в Институте химии растительных веществ АН


background image

РУз.

Полный текст докторской диссертации размещён на веб-сайте Научного совета

16.07.2013.К/В/Т.13.01

при

Институте

биоорганической химии и Национальном

Университете РУз по адресу (http://ss.biochem.uz)

Автореферат диссертации на трёх языках (узбекский, русский, английский)

размещён

на

веб-странице

Научного

совета

по

адресу

http://ss.biochem.uz

и

Информационно-образовательном портале «ZiyoNet» по адресу www.ziyonet.uz

Научный консультант: Азимова Шахноз Садыковна

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты: Ахунов Али Ахунович

доктор биологических наук, профессор

Далимова Сурайо Нугмановна

доктор биологических наук, профессор

Саитмуратова Огилжон Худайбергеновна

доктор биологических наук, доцент

Ведущая организация: Ташкентский фармацевтический институт

Защита состоится «___»____________2016 г. в _____ часов на заседании разового Научного

совета при Научном совете 16.07.2013.К/В/Т.13.01 при Институте Биоорганической химии

и Национальном Университете РУз (Адрес: 100125, г. Ташкент, ул. Мирзо Улугбека, 83.

Тел. 262 35 40, факс (99871) 262 70 63, e-mail: asrarov54@mail.ru

С докторской диссертацией можно ознакомиться в Информационно-ресурсном

центре Института биоорганической химии по адресу г. Ташкент, ул. Мирзо Улугбека, 83.

Автореферат диссертации разослан «___»________________2016 года
(протокол рассылки_№___от_____________2016г.)

А.С. Тураев,

Председатель Научного совета по присуждению

учёной степени доктора наук, д.х.н., профессор

М.И. Асраров,

Учёный секретарь Научного совета по присуждению

учёной степени доктора наук, д.б.н., профессор

Д.А. Кадырова,

Председатель Научного семинара при Научном совете

по присуждению учёной степени доктора наук, д.б.н.

34

ВВЕДЕНИЕ (аннотация докторской диссертации)

Актуальность и востребованность темы диссертации.

Одной из


background image

актуальных

задач

биоорганической

химии,

клеточной

биологии

и

фармакологии

является

выявление

новых

соединений,

обладающих

противоопухолевым действием и другими биологическими активностями. На
протяжении многих лет в научных лабораториях республики проводятся
систематические исследования по выделению и синтезу различных классов
соединений и изучению их фармакологической активности, часть соединений
протестированы на различные виды биологической активности, такие как
антиаритмическая, холинэстеразная, эстрогенная и противовоспалительная,
однако не изучена их цитотоксическая активность.

Скрининг цитотоксической активности химических соединений,

лекарственных препаратов, медицинских изделий

in vitro

на различных

культурах клеток является составной частью доклинических исследований по
международным требованиям GLP (Good Laboratory Practice). Методы
исследования веществ

in vitro

позволяют значительно удешевить и сократить

сроки предварительного исследования новых химических соединений.

Такие проблемы как дифференцировка, канцерогенез, клеточная

подвижность,

пролиферация,

передача

наследственной

информации,

регуляция экспрессии генов и другие решаются в мировой науке, в основном
с применением клеточных культур. Клеточные культуры имеют также
большое значение для решения прикладных задач медицины и сельского
хозяйства. В частности, к основным прикладным задачам следует отнести
массовое промышленное производство вакцин и физиологически активных
соединений, получение моноклональных антител методами гибридомной
технологии, лечение тяжелых заболеваний методами генотерапии и
клеточной заместительной терапии.

В связи с вышеизложенным выявление соединений, ингибирующих

рост опухолевых клеток с низкой токсичностью для нормальных клеток и
веществ, пролиферирующих рост нормальных клеток, но не раковых для
регенеративной медицины, а также получение гибридом, продуцирующих
моноклональные антитела к эритропоэтину является актуальной.

Данное диссертационное исследование в определенной степени служит

выполнению задач, предусмотренных в Постановлениях Президента
Республики Узбекистан от 28 ноября 2011 года № ПП-1652 «О мерах по
дальнейшему углублению реформирования системы здравоохранения» и
Кабинета Министров Республики Узбекистан от 29 марта 2012 г. № 91 «О
мерах по дальнейшему укреплению материально-технической базы и
совершенствованию организации деятельности медицинских учреждений», а
также другим нормативно-правовым документам.

Соответствие

исследования

приоритетным

направлениям

развития науки и технологий республики.

Данное исследование

выполнено в соответствии с приоритетным направлением развития науки и
технологии республики VI. «Медицина и фармакология».

35

Обзор зарубежных научных исследований по теме диссертации.


background image

Научные исследования, направленные на выявление высокоспецифичных для
каждого типа опухолевых клеток соединений, скрининга соединений на
цитотоксичность, проведения доклинических исследований химических
соединений и лекарственных препаратов методами

in vitro

, осуществляются в

ведущих научных центрах и высших образовательных учреждениях мира, в
том числе в Национальном институте здоровья (Мэриленд, США), в
Национальном институте рака (Роквилл, США), в Институте Патологии
(Сиэтл, США), в Университете Рокфеллеров (США), в Институте цитологии
(Россия), в Институте биоорганической химии (Узбекистан); в центрах по
изучению рака при ВОЗ (Бельгия), EURL ECVAM и EPAA (Европа), JaCVAM
(Япония), KoCVAM (Корея), Health Canada (Канада), ICATM

(США), Vitroscreen (Италия) и др.

В результате исследований, проведенных в мире по выявлению

соединений направленного действия методами

in vitro

на различных

культурах клеток, получен ряд научных результатов, в том числе: выявлены
новые ингибиторы роста раковых клеток, разработаны таргетные препараты
винтафолид (Merk&Co, США), эрлотиниб (Roche, Швейцария), афатиниб
(Boehringer ingelheim pharm. Inc., США), кризотиниб (Pfizer Inc., США) и
церитиниб (Novartis, США), вызывающие инактивацию мутантных белков в
опухолевых клетках, и бевацизумаб (Pfizer Inc., США),

ингибирующий

ангиогенез; получены моноклональные антитела к различным антигенам, в
том числе и к эритропоэтину («Roche», Швейцария, «Протеиновый контур»,
Россия).

В настоящее время в мире при скрининге методами

in vitro

химических

соединений и лекарственных препаратов по ряду приоритетных направлений
проводятся исследования, в том числе: выявление селективных ингибиторов
роста раковых клеток для онкологии; селективных пролифераторов роста
нормальных клеток для регенеративной медицины; определение общей и
специфических видов цитотоксичности

,

определение механизмов действия

соединений на клеточном уровне.

Степень изученности проблемы.

Исследования по изучению действия

соединений, ингибирующих рост опухолевых клеток методами

in vitro

,

стартовали в мире с конца 70-х годов (R.I.Freshney, Т.Mosmann,

K.Taylor,

G.Taju), использование культур клеток в регенеративной медицине – ещё
раньше

(P.B.Medawar,

J.Rheinwald,

Н.Green),

развитие

гибридомной

технологии с середины 80-х (Kohler и Milstein). В настоящее время данные
направления получили бурное развитие. Так, скрининг новых соединений в
автоматизированных

лабораториях,

например,

при

Университете

Рокфеллеров и Национальном институте здоровья в США, проводят уже не
только на 96-луночных планшетах, но и на 384, 1536 или 3456-луночных
планшетах по так называемому методу HTS (high-throughput screening),
исследуя при этом соединения со всего мира (J.Agrestia, X.Zhang, A.Florian).


background image

36

В СНГ успехов в области скрининга веществ на культурах клеток и

культивировании клеток человека и животных достигли М.Ю.Еропкин,
Г.Георгиев, Н.Р.Тафришьян, А.А.Алексеев, В.И.Шумаков, Е.В.Парфенова и
др.

В Узбекистане исследования на культурах клеток также начались с

конца прошлого века. В 70-80-х годах изучению рецепторных систем клеток
HeLa и нормальных клеток эмбриона человека посвящены работы
А.А.Абдукаримова,

А.А.Арипджанова,

Т.Г.Гулямовой,

Ш.С.Азимовой,

О.Петровой, С.Е.Мучника и других. В Институте химии растительных
веществ А.Х.Юлдашевым впервые были выделены такие противоопухолевые
соединения, как винкристин и винбластин, но их потенция ингибировать рост
опухолевых клеток была выявлена не в стенах института, а в Венгрии. В
2002-2003 гг. в лаборатории молекулярной генетики под руководством проф.
Ш.С.Азимовой

были

получены

гибридные

клетки,

продуцирующие

моноклональные антитела к поверхностным антигенам гепатита В. В 2005
году в Институте биоорганической химии Н.Н.Кузнецовой была получена и
запатентована новая линия клеток меланомы мышей. В этом же году в
лабораторию молекулярной генетики Института химии растительных
веществ были доставлены верифицированные линии раковых клеток (Hela,
HEp-2 и HBL-100). В настоящее время коллекции клеточных культур в
лабораториях Институтов химии растительных веществ и биоорганической
химии постоянно пополняются новыми линиями клеток, и ведутся
исследования на культурах клеток.

Связь темы диссертации с планами научно-исследовательских

работ научно-исследовательского учреждения, где выполнена
диссертация.

Диссертационное исследование выполнено в рамках

научно-исследовательских работ прикладных и фундаментальных проектов
ИХРВ, на темы № А-10-144 «Получения моноклональных антител к
эритропоэтину человека» (2006-2008 гг.), № ФА-Ф3-Т041 «Получение и
изучение фармако-токсикологических свойств биологически активных
соединений методами генно-клеточной биологии» (2007-2011 гг.), и №
ФА-Ф6-Т198 «Изучение влияния биологически активных веществ на
метаболизм клеток» (2012-2016 гг.).

Целью исследования

является поиск цитостатических соединений -

ингибиторов роста раковых клеток, низкотоксичных для нормальных клеток,
и соединений, ускоряющих рост нормальных клеток, но не рост раковых
клеток, а также получение гибридных клеток (гибридом), продуцирующих
моноклональные антитела к рекомбинантному эритропоэтину.

Задачи

исследования.

По поиску ингибиторов роста раковых клеток:
изучение действия экстрактов и индивидуальных соединений на


background image

культуры злокачественно трансформированных клеток (Hela – клеток рака
шейки матки, HEp-2 – рака гортани и HBL-100 – рака молочных желез);

получение культур нормальных клеток фибробластов человека и

гепатоцитов крыс для скрининга соединений;

изучение действия экстрактов и индивидуальных соединений на

культуры нормальных клеток (фибробластов и гепатоцитов).

37

По поиску пролифераторов роста нормальных клеток (для

регенеративной медицины:

получение культур клеток фибробластов и кератиноцитов, создание на

их основе тканеинженерной конструкции;

изучение действия флавоноидов и фитостероидов на культуры клеток

фибробластов человека и кролика;

изучение действия выявленных пролифераторов роста клеток и

тканеинженерной конструкции на процессы заживления ожоговых ран

in vivo

.

По получению гибридных клеток - продуцентов моноклональных антител к
эритропоэтину (МКАТ-ЭПО):

разработка схемы иммунизации мышей линии BALB/c

рекомбинантным эритропоэтином;

слияние клеток мышиной миеломы X63Ag8.653 со спленоцитами

мышей

линии

BALB/c,

иммунизированных

рекомбинантным

эритропоэтином. Селекция, скрининг и клонирование гибридом-продуцентов
МКАТ-ЭПО;

характеристика и отбор перспективных клонов для получения

препаративных количеств моноклональных антител к рекомбинантному
эритропоэтину, получение асцита;

выделение и очистка моноклональных антител к рекомбинантному

эритропоэтину;

выделение и очистка эритропоэтина из плацентарной крови методами

аффинной хроматографии на основе МКАТ-ЭПО.

Объектом исследования

являются культуры клеток фибробластов,

кератиноцитов и гепатоцитов, культуры раковых клеток Hela – клеток рака
шейки матки, HEp-2 – рака гортани и HBL-100 – рака молочных желез,
дермальный

эквивалент

кожи,

экстракты,

суммы

алкалоидов,

индивидуальные соединения (алкалоиды тропанового ряда, производные
фенил- и феноксиуксусных кислот, производные фенилгидразина и
норфлуорокурарина,

флавоноиды,

фитостероиды),

экспериментальные

животные с термическими ожогами IIIА степени, мыши линии BALB/c,
клетки перевиваемой мышиной миеломы Х-63 АГ8.653

Предмет исследования

- цитотоксическая, пролиферативная и

метаболическая активности, регенерация ожоговых ран, способность
гибридных клеток продуцировать моноклональные антитела к эритропоэтину
и возможность использования полученных моноклональных антител в
качестве иммуносорбента.


background image

Методы исследования.

При выполнении работы использовались

методы биоорганической химии (методы разделения белка, качественного и
количественного

определения

белка,

спектрофотометрические

и

электрофоретические методы), методы клеточной биологии и инженерии
(методы получения первичных культур клеток, гибридом), методы биохимии
(колориметрические методы – МТТ, нейтральный-красный, ЛДГ-тест),
иммунохимии (метод Оухтерлони, ИФА).

38

Научная новизна исследования

заключается в том, что впервые:

выявлена новая фармакологическая активность ряда соединений и
экстрактов;

доказано, что экстракты - из растений рода

Convolvulus

, растений

Vinca

major

и

Arundo donax,

а также грибов-эндофитов, паразитирующих на

растениях рода

Vinca,

обладают избирательной цитотоксической активностью

на культурах раковых клеток;

выявлен селективный ингибитор роста клеток рака гортани - N-бензил

конвольвин – производное алкалоида конвольвина, выделенного из активного
экстракта растения рода

Convolvulus

, который не ингибирует рост клеток

рака молочной железы, шейки матки и низкотоксичный для нормальных
клеток;

выявлены селективные ингибиторы роста раковых клеток - n-Cl

ацетилфенилуксусная кислота, n-Cl-феноксиуксусная кислота и йодметилат
фенилгидразона норфлуорокурарина;

установлено,

что

хлорсодержащие

алкалоиды,

в

частности

производные

конвольвина

и

винканина,

проявляют

высокую

цитотоксическую активность на культурах раковых клеток на уровне
препарата цисплатина;

разработан способ получения культур мезенхимальных клеток;

доказано, что фитостероид - экдистерон увеличивает пролиферацию
«нормальных» клеток кожи – фибробластов и кератиноцитов, и не вызывает
пролиферацию клеток рака гортани, рака молочной железы и шейки матки;
установлено, что экдистерон совместно с аллофибробластами способствует
увеличению пролиферации аутоэпидермоцитов и эпителизации ткани, что
может быть использовано в терапии ожоговых ран; получены гибридомы –
продуценты моноклональных антител к рекомбинантному эритропоэтину.

Практические результаты исследования

заключаются в следующем:

разработаны оптимальные методы получения культур мезенхимальных
клеток;

проведён скрининг экстрактов и индивидуальных соединений, из

которых выявлены ингибиторы роста раковых клеток с избирательной
активностью и пролифератор роста клеток кожи;

определены дозы биологической активности и токсичности

соединений;


background image

разработан эффективный способ лечения ожоговых ран IIIA степени;

получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к
эритропоэтину;

разработан способ выделения эритропоэтина, как природного, так и

рекомбинантного на основе полученных моноклональных антител к
эритропоэтину.

Достоверность

результатов

исследования.

Результаты

работы

подтверждены применением современных аналитических и статистических
методов. Подтверждением полученных результатов служат и экспертные

39

оценки специалистов, и практическая реализация результатов исследований,
обсуждение результатов исследований на республиканских и международных
научных конференциях, а также публикация результатов исследований в
рецензируемых научных изданиях и получение патентов.

Научная и практическая значимость результатов исследования.

Результаты исследований, представленные в работе, имеют несомненно, как
фундаментальное, так и прикладное значение. Отобранные из большого
количества экстрактов и индивидуальных соединений активные ингибиторы
и пролифераторы роста клеток открывают перспективу их углубленного
исследования в данных направлениях, выявления их механизма действия.

Налаженные

in vitro

методы доклинического скрининга биологически

активных

веществ,

лекарственных

препаратов

по

международным

принципам надлежащей лабораторной практики (GLP), позволяют быстро и
экономично проводить оценку цитотоксичности новых соединений и
препаратов.

Выявленные экстракты и индивидуальные соединения, ингибирующие

рост раковых клеток с низкой цитотоксичностью для нормальных клеток,
предложены для

in vivo

исследований на противоопухолевую активность

(заявки на патенты № IAP20130222, № IAP20130304, № IAP 20140170, №
IAP20140182).

Предложенные в работе способы получения культур клеток кожи и

тканеинженерных конструкций, и использование их в терапии ожоговых ран
значительно ускоряют эпителизацию глубоких повреждений кожи (заявка на
патент РУз. № IAP20120160).

Внедрение результатов исследования.

На основании полученных

данных по скринигу биологически активных соединений на цитотоксичность
и получению моноклональных антител:

получены два субклона гибридных клеток и получен патент на

изобретения Агентства по интеллектуальной собственности Республики
Узбекистан

(16.12.2002,

№

IAP

02943),

которые

продуцируют

моноклональные антитела к эритропоэтину. В результате исследования
полученные антитела использваны в качестве иммуносорбента для очистки
эритропоэтина;

выявлена новая биологическая активность алкалоида N-бензил


background image

конвольвина и защищены патентом изобретения РУз (16.02.2012г. № IAP
04965). В результате исследования полученное соединение предложено в
качестве селективного ингибитора роста клеток рака гортани при низкой
цитотоксичности для нормальных клеток.

Получена аккредитация от Узстандарта на проведение оценки

цитотоксичности

медицинских

изделий

и

лекарственных

средств,

поступающих

на

рынок

страны

(свидетельство

об

аккредитации

№UZ.AMT.07.MAI.220).

Утверждены Методические Рекомендации «Оценка цитотоксичности

лекарственных средств, изделий медицинского назначения, косметических

40

средств, химических соединений, пестицидов и средств для ветеринарии»

(начальником Главного управления науки и учебных заведений МЗ РУз,
№8Н-Р/18 от 02.03.16г.).

Апробация результатов исследования

. Результаты исследований по теме

диссертации изложены в виде докладов и прошли апробацию на 10

международных и республиканских научно-исследовательских кон

ференциях, в частности на конференциях молодых ученых (Ташкент, 2004,

2009, 2010, 2011, 2012), на международном съезде биотехнологов (Пущино,

Россия, 2006), на 7

th

и 10

th

International Symposium of Chemistry of Natural

Compounds (Tashkent, 2007, 2013), на 3

rd

International Symposium on Edible

Plant Resources and the Bioactive Ingredients (Urumqi, China, 2012), на 11th

International Symposium of Chemistry of Natural Compounds (Turkey, 2015).

Опубликованность результатов исследования.

По теме диссертации

опубликовано всего 28 научных работ, из них 2 патента РУз, 14 научных
статей, в том числе 11 в республиканских и 3 в международных журналах,
рекомендованных

Высшей

аттестационной

комиссией

Республики

Узбекистан для публикации основных научных результатов докторских
диссертаций.

Структура и объём диссертации.

Структура диссертации состоит из

введения, четырёх глав, заключения, списка использованной литературы.
Объем диссертации составляет 227 страниц.


background image

41

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во введении

обосновываются актуальность и востребованность

проведенного исследования, цель и задачи исследования, характеризуются
объект и предмет, показано соответствие исследования приоритетным
направлениям развития науки и технологий республики, излагаются научная
новизна и практические результаты исследования, раскрываются научная и
практическая значимость полученных результатов, внедрение в практику
результатов исследования, сведения по опубликованным работам и структуре
диссертации.

В первой главе диссертации

«Cовременные аспекты применения

культур клеток для решения научных и прикладных задач медицины,
биологии, химии»

приведён обзор литературы, включающий общие

сведения о культурах клеток, методах их культивирования и применения, о
цитотоксической активности экстрактов и индивидуальных соединений на
различных культурах клеток, о способах выявления ингибиторов и
пролифераторов

роста

клеток,

о

современных

противоопухолевых

препаратах. Кроме того, приведены данные и исследования по применению
культур клеток в регенеративной медицине. Отдельные подглавы посвящены
гибридомной технологии, а также гормону эритропоэтину и препаратам на


background image

его основе.

Во второй главе диссертации

«Материалы, условия и методы

биоорганической

химии,

биотехнологии

и

клеточной

биологии,

ипользованные в работе»

приведены материалы, использованные в работе, и

методы, в частности, методы биоорганической химии (гель-фильтрация,
иммунообменная

и

аффинная

хроматографии,

спектрофотометрия,

электрофорез и др. методы качественного и количественного определения
белка), методы клеточной биологии и инженерии (методы получения культур
клеток, гибридом и тканеинженерных конструкций), методы биохимии
(колориметрические методы – МТТ, нейтральный-красный, ЛДГ-тест) и

иммунохимии (метод Оухтерлони, ИФА).

В третьей главе диссертации

«Изучение цитотоксической и

пролиферативной

активности

экстрактов

и

индивидуальных

соединений»

обсуждаются результаты получения и культивирования

нормальных и злокачественно трансформированных клеток, результаты
проведения скрининга на данных культурах, как экстрактов, так и
индивидуальных соединений на цитотоксическую и пролиферативную
активности, а также исследования по применению культур клеток в
регенеративной медицине.

Для работы использованы культуры нормальных клеток фибробластов,

кератиноцитов и гепатоцитов, которые получали неферментативным методом
экспланта. При этом данный метод был оптимизирован нами путем
кондиционирования сред культивирования двумя процентами среды, снятой с
конфлюэнтной культуры фибробластов, богатой ростовыми факторами (EGF
- эпидермальный фактор роста, FGF - фактор роста фибробластов, KGF

42

- фактор роста кератиноцитов и др.) и матричными белками (коллагены I и III
типов, эластин и др.).

Основные преимущества оптимизированного нами способа получения

культур клеток заключаются в том, что получается пул «юных»

жизнеспособных и пролиферативно активных клеток, кроме того нет

необходимости в фидерном слое и в целом ряде коммерческих добавок.

Данный способ получения культур нормальных клеток экономичен и

высокопродуктивен, монослой образуется из клеток одного возраста, далёкого

от лимита Хейфлика, что важно для регенеративной медицины.

Таким образом, нами получены культуры клеток фибробластов - ККФ

человека, дермы кролика, мыши, крыс и эмбрионов крыс (рис. 1), получены
первичные культуры кератиноцитов кожи - ПКК человека и кролика, и
культуры клеток гепатоцитов крыс - ПКГ (рис. 2).


background image

A

B

C

D

E F

Рис. 1. Культура клеток фибробластов:

A

– эксплант дермы человека на

3 сутки культивирования; B – монослой фибробластов человека на 10 сутки; C –
монослой фибробластов кролика на 10 сутки; D – фибробласты дермы крыс на 10
сутки; E – фибробласты эмбриона крысы на 10 день культивирования; F -
фибробласты мыши на 10 день; ок. ×10, об. ×10.

A B


background image

Рис. 2. ПКК человека (A) на 20 день культивирования и ПКГ крыс

на 3 день культивирования (B), ок. ×10, об. ×40.

43

Морфологические исследования полученных культур показали, что

ПКК представлены эпителиоподобными клетками, ККФ -
фибробластоподобными клеткам (см. рис. 1,2), а клетки гепатоцитов
содержали 1-2 крупных ядра, что соответствует литературным данным.
Культуры клеток пригодны как для доклинического

in vitro

скрининга

химических соединений, лекарственных препаратов и медицинских изделий,
так и для регенеративной медицины.

Для скрининга экстрактов и индивидуальных соединений на

цитотоксическую и пролиферативную активности нами были использованы
верифицированные линии раковых клеток, полученные из банка клеточных
культур Института цитологии РАН, такие как HeLa – клетки карциномы
шейки матки, HBL-100 – клетки рака молочной железы и НEр-2 – клетки рака
гортани (в сотруд. с Хашимовой З.С., Терентьевой Е.О.).

Скрининг соединений осуществляли также и на нормальных культурах

клеток. ККФ использовали в работе на 5-7 пассажах, а ПКГ на 1 пассаже, при
достижении 80% конфлюэнтности. Скрининг метаболического состояния
клеток оценивали по следующим показателям: 1) снижению суммарной
активности

митохондриальных

дегидрогеназ

в

микротетразолиевом

колориметрическом тесте Мосмана – МТТ-тест; 2) уменьшению эндоцитоза
витального

красителя

нейтрального

красного,

коррелирующему

с

лизосомальной функцией - нейтральный-красный тест; 3) активности в среде
инкубации цитозольного фермента лактатдегидрогеназы, который может
быть использован как маркер нарушения целостности плазматической
мембраны (ЛДГ-тест). В качестве препарата сравнения использовали
противоопухолевый препарат «Цисплатин–Тева», (Phfarmachemie, B.V.,
Нидерланды). В качестве контроля служили интактные клетки.

Проведён скрининг на цитотоксичность экстрактов растений рода

Vinca

, полученных в ИХРВ АН РУз. Известно, что растения данного рода

содержат

винкаалкалоиды,

большая

часть

которых

проявляют

противоопухолевую активность (R.Berges, 2014, V.Rai, 2014). К примеру,
противоопухолевые препараты «Винкристин», «Винбластин» относятся к
винкаалкалоидам. В этой связи была исследована цитотоксическая
активность экстрактов из наземной и корневой частей растения

Vinca major

(табл. 1).

Таблица 1


background image

Цитотоксическая активность экстрактов

V. major

, % ингибирования роста клеток

(М ± м, n = 9)

Экстракты, мкг/мл

HeLa

HEp-2

ККФ

100

10

100

10

100

10

из наземн

. V. major

71±2,9*

30±2,2

77±3,04*

43±2,49

40±0,5*

19±0,1

из корней

V. major

73±5,61*

50±4,38*

67±4,09*

5±0,05

30,4±0,1

0

Цисплатин –Тева

97,5±2,4

70±2,31*

89±0,28*

51±1,2 *

100±9,5*

72±3,1*

Контроль

0

0

0

0

0

0

Примечание:

достоверное отличие от контроля Р<0,05; *-достоверное отличие от

контроля Р<0,01

44

Установлено (см. табл 1), что из изученных экстрактов наибольшую

цитотоксическую активность проявил экстракт из корней растения

Vinca

major.

Данный экстракт в концентрации 10 мкг/мл ингибировал рост клеток

рака шейки матки, не подавляя рост нормальных клеток и интересен для
дальнейших исследований методами

in vivo

.

Исходя из полученных данных, мы сочли интересным провести

скрининг экстрактов грибов эндофитов, паразитирующих на растениях рода

Vinca

. Так нами была изучена цитотоксическая активность восьми экстрактов

грибов штаммов

Solerotium sp, Alternaria sp, Penicillium sp, Acremonium sp

и

Aspergillius tureus

, паразитирующих на растениях

Vinca minor

и

Vinca erecta

,

выделенных в институте микробиологии АН РУз (под рук. Т.Г.Гулямовой).
Данные экстракты могут содержать винкаалкалоиды и подавлять рост
раковых клеток (табл. 2).

Таблица 2

Цитотоксическая активность экстрактов грибов эндофитов,

% ингибирования роста клеток (М ± м, n = 9)

Экстракты

мкг/мл

HeLa

НEр-2

HBL-100

ПКГ

100

10

1

100

10

1

100

10

1

10

1

Solerotium sp

Лист

V. minor

51±

6,2

20,5

±0,2

0±

0,1*

43±

1,8

30,5

±0,3

21±

0,6

73,5

±8,8

47±

1,6

29±

0,9

40±

4,9

12±

2,0

Penicillium sp

Стебель

V. мinor

24±

0,4

19,5

±2,1

6±

0,1*

64±

3,3

61±

6,8

28±

0,1

72±

7,6

43±

4,2

40±

2,5

32±

3,7

9±

0,9

Acremonium sp

Лист

V. minor

37,5

±1,5

6,0

±0,3

0

36±

1,2

5±

0,1*

3±

0,2*

53±

1,3

27±

1,0

25±

0,6

20±

3,2

8±

1,5

Alternaria sp

82±

6,5±

1±

36±

26±

11±

91±

47± 32±

76± 54±


background image

лист

V. minor

8,6

0,6

0,1*

0,9

1,9

0,1

7,5

3,8

3,2

9,5

6,2

Aspergillius
tureus

Корень

V.

erecta

51±

4,2

44±

3,6

9±

0,1*

53±

4,9

45,5

±3,1

32±

0,9

56±

3,1

54±

3,1

49±

3,0

34±

3,1

12±

2,2

Penicillium sp

корни

V. erecta

36±

2,5

6,0±

0,1*

0

27±

0,6

20±

0,9

8±0,

1*

54±

2,4

50±

5,3

32±

1,2

29±

4,5

13±

2,9

Penicillium sp

лист

V. erecta

72,5

±8,2

48

±

4,6

39

±

1,3

90±

9,7

39±

1,2

37,5

±1,2

79±

9,8

54±

4,7

45±

3,2

24±

3,8

16±

2,5

Alternaria sp

лист

V. erecta

54,5

±2,5

28,5

±2,2

13±

0,2

47,5

±2,8

27±

0,8

13±

0,1

66±

5,2

64±

5,1

48±

2,8

50±

5,7

19±

2,7

Цисплатин-Тева

99±

2,6

78±

1,9

32±

2,6

99,5

±1,8

60±

1,6

41±

0,9

93±

4,9

76±

2,9

49±

0,3

98±

5,9

49±

3,3

Контроль

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Примечание:

достоверное отличие от контроля Р<0,05; * Р<0,01.

Как видно из таблицы 2, в низких концентрациях 1-10 мкг/мл

наибольшую ингибирующую активность на раковых культурах клеток
проявили экстракты

Alternaria sp (

лист

V. erecta), Penicillium sp (

лист

V.

erecta) Aspergillius tureus (

корень

V. erecta)

и

Penicillium sp (

стебель

V. minor)

,

которые в сравнение с противоопухолевым препаратом проявили низкую
цитотоксическую активность на культуре нормальных клеток гепатоцитов.
Следует

отметить,

что

из

данных

экстрактов

избирательную

цитотоксическую активность проявил экстракт грибов

Alternaria sp лист (V.

45

erecta)

в концентрации 1 мкг/мл

,

так как в большей степени подавлял рост

клеток рака молочных желез - HBL-100. Экстракт грибов

Alternaria sp,

паразитирующих на листьях растения

Vinca erecta,

можно предложить для

углубленных исследований

in vivo

.

Далее был проведён скрининг на цитотоксичность сумм алкалоидов

(СА), полученных в ИХРВ АН РУз (под рук. С.Ф.Ариповой), из растений,
входящих в список Cragg – список растений канцеролитиков.

Была исследована цитотоксическая активность СА из растения

Convolvulus krauseanu,

СА из растения

Buxus Semperviren L.

и СА из корневой

части растения

Arundo donax

(табл. 3).

Таблица 3

Цитотоксическая активность сумм алкалоидов,

% ингибирования роста клеток (М ± м, n = 9)

Вещества

HeLa

HEp-2

ККФ


background image

мкг/мл

100

10

100

10

100

10

СА из корней

Arundo d.

100±3,54

43±2,35

* 100±6,72

55±2,53

39±1,5*

0

СА из

C. krauseanus

46,5±2,7

7±0,8*

60,8±3,9

43,6±0,5

100±9,3*

0

СА из

B.Sempervirens

99,4±5,5 17±1,05* 97,8±7,7

4,2±0,03 100±11,2 36±2,4*

Цисплатин –Тева

97,5±2,4 70±2,31* 89±0,28* 51±1,2 * 100±9,5* 72±3,1*

Контроль

0

0

0

0

0

0

Примечание:

достоверное отличие от контроля Р<0,05; * Р<0,01.

Установлено, что из изученных СА наибольшую цитотоксическую

активность проявили СА корней растения

Arundo donax

и СА из растения

C.

krauseanus

, ингибирующие рост раковых клеток и не подавляющие рост

нормальных клеток. При этом СА из растения рода

Convolvulus

в

концентрации 10 мкг/мл подавляла рост клеток рака гортани почти на 50%, не
ингибируя рост других исследуемых клеток. В этой связи перспективными
для дальнейших исследований методами

in vivo

на противоопухолевую

активность являются СА из растений рода

Convolvulus

и корней растения

Arundo donax

.

Из сумм алкалоидов растений рода

Convolvulus (C. subhirsutus, C.

krauseanus, C. pseudocanthabrica)

в ИХРВ АН РУз (под рук. С.Ф.Ариповой)

были

выделены

тропановые

алкалоиды,

получены

их

химические

производные. Данные соединения исследованы нами на цитотоксичность.

Четыре алкалоида - конвольвин (1), конволидин (2), конволинин (3) и

филлальбин (4) выделены из растений рода

Convolvulus

. N-бензил

конвольвин (5) и N-хлорацетил конвольвин (6) - являются синтетическими
аналогами конвольвина.

Все соединения по структуре имеют общий скелет тропана

(8-азабициклооктана), являются сложными эфирами аминоспирта тропина и
вератровой (конвольвин, конволинин) или ванилиновой (конволидин) кислот
и отличаются лишь заместителем при атоме азота:

46

NR

1

O C O

(1)

OR

2

OCH

3

1. R

1

= H, R

2

= CH

3

2. R

1

=

H, R

2

= OH

3. R

1

= CH

2

CH

2

-OH, R

2

=

CH

3

4. R

1

= CH

3,

R

2

= CH

3

5. R

1

= CH

2

-C

6

H

5

, R

2

= CH

3

6. R

1

= COCH

2

Cl, R

2

= CH

3


background image

Первоначальный скрининг алкалоидов был проведен при концентрации

100 мкг/мл на четырёх типах клеток – HeLa, НEр-2, ККФ и ПКГ (табл. 4).

Таблица 4

Цитотоксическая активность алкалоидов в концентрации

100 мкг/мл, % ингибирования роста клеток (М ± м, n = 9)

Вещества

HeLa

НEр-2

ККФ

ПКГ

Конвольвин

83,0±0,12

99,1±0,24

100±0,17

100±0,25

N-бензил конвольвин

90,3±0,22

100±0,23

100±0,28

100±0,71

Конволинин

35,0±0,12

79,0±0,32

65,5±0,31

89±4,2

Конволидин

27,0±0,35

20,0±0,12

100±0,41

98±2,5

N-хлорацетил конвольвин

100±0,24

98±0,11

100±0,13

100±2,4

Филлальбин

44±0,15

15±0,2

0

14±1,2

Цисплатин-Тева

100±0,2

100±1,5

100±0,5

100±2,5

Клетки без веществ

0

0

0

0

Примечание:

достоверное отличие от контроля Р<0,05.

Как видно из таблицы 4, высокую цитотоксическую активность по

отношению к раковым и нормальным клеткам показали алкалоид конвольвин
R

1

= H, R

2

= CH

3

(1) и его производные: N-бензил конвольвин R

1

= CH

2

-C

6

H

5

,

R

2

= CH

3

(5) и N-хлорацетил конвольвин R

1

= COCH

2

Cl, R

2

= CH

3

(6). В то

время как алкалоид филлальбин (4) R

1

= CH

3,

R

2

= CH

3

в концентрации 100

мкг/мл ингибировал в большей степени рост клеток рака шейки матки и был
в 2-4 раза

менее цитотоксичен для других клеток в эксперименте.

Следовательно, группировка - R

1

= CH

3,

R

2

= CH

3

в структуре соединений

предотвращает токсическое действие данного соединения на исследуемые
культуры клеток.

Наибольший интерес для практической медицины имеют вещества,

активные в низких и очень низких концентрациях. В наших экспериментах
мы также исследовали эти же соединения в концентрации 10 мкг/мл (табл. 5).


background image

47

Таблица 5

Цитотоксическая активность алкалоидов в концентрации

10 мкг/мл, % ингибирования роста клеток (М ± м, n = 9)

Вещества

HeLa

НEр-2

ККФ

ПКГ

Конвольвин

15,4±0,17

8,0±0,13

100±0,24

88±6,2

N-бензил конвольвин

35,0±0,25

81,6±0,28

39,0±0,22

42±3,1

Конволинин

0*

11,0±0,25

0*

8±0,02*

Конволидин

33,0±0,22

28,0±0,31

35,0±0,22

24±2,2

N-хлорацетил конвольвин

99,7±0,22

97±0,33

100±0,22

100±3,6

Филлальбин

0*

0*

Пролиф.*

0*

Цисплатин-Тева

88,6±1,2

91±0,5

78±0,4

82±1,6

Контроль

0

0

0

0

Примечание:

достоверное отличие от контроля Р<0,05; * - достоверное отличие от

контроля Р<0,01.

Установлено, что наибольшую активность на культурах раковых клеток

HeLa и НEр-2 в концентрации 10 мкг/мл или 26,3 мМ/л и 27,3мМ/л
соответственно, проявили алкалоиды N-бензил конвольвин (5) и N
хлорацетил конвольвин (6). Алкалоид N-хлорацетил конвольвин (6) показал
высокую цитотоксическую активность по отношению ко всем типам клеток в
эксперименте

и

был

более

цитотоксичен,

чем

коммерческий

противоопухолевый препарат цисплатины (летальная доза LD

50

цисплатина

для человека равна 2,2 мг/кг). Следовательно, группировка - R

1

= COCH

2

Cl,

R

2

= CH

3

в структуре соединений значительно повышает токсическое

действие соединения на исследуемые культуры клеток.

Алкалоид N-бензил конвольвин избирательно подавляет рост клеток

рака гортани IC

50

= 12,3 мМ/л (4,7 мкг/мл) и в 3 раза менее токсичен для

нормальных клеток. IC

50

N-бензил конвольвина для нормальных клеток

составляет 32,8 мМ/л (12,5 мкг/мл). LD

50

пересчитанная нами из показателя

IC

50

составляет 12,0-13,0 мг/кг при внутривенном введении, а

терапевтическая концентрация может находиться в пределах 4,4-5,0 мг/кг,


background image

при которой данное соединение способно угнетать рост карциномы гортани,
что необходимо исследовать

in vivo

.

Далее нами изучены индольные алкалоиды и их производные с

фенилгидразином (пиразолы). Так, известны синтетические производные
пиразолов, обладающие цитотоксической активностью по отношению к
клеткам рака ободочной кишки (патент RU 2305545, 2006) и производные
фенилгидразина ингибирующие рост клеток рака молочных желез и печени
(O.M.Hafez, 2014).

Профессором

А.Х.Юлдашевым

выделен

индольный

алкалоид

норфлуорокурарин C

19

H

20

N

2

O (винканин) из корней

Vinca erecta

и

синтезировано сложное соединение пиразола, которое образовалось в
результате реакции норфлуорокурарина с фенилгидразином – гидразон
норфлуорокурарина С

25

Н

26

N

4

. При взаимодействии данного соединения с

соляной кислотой образуется хлоргидрат фенилгидразона

48

норфлуорокурарина C

25

H

27

N

4

Cl, а с йодистым метилатом - йодметилат

фенилгидразона норфлуорокурарина С

26

Н

29

N

4

I (рис. 3).

Рис. 3. Производные пиразола:

1 - йодметилат фенилгидразона

норфлуорокурарина, 2 - хлоргидрат фенилгидразона норфлуорокурарина.

Данные соединения изучены на цитотоксическую активность. В

результате

установлено,

что

исходные

соединения

–

гидразон

норфлуорокурарина и фенилгидразин не проявили искомой активности в
отличие от их производных (табл. 6).

Таблица 6

Цитотоксическая активность производных фенилгидразина и

норфлуорокурарина, % ингибирования роста клеток (М ± м, n =

9)


background image

Вещества
Мкг/мл

HeLa

НEр-2

HBL-100

ККФ

100

10

1

100

10

1

100

10

1

100

10

1

C

25

H

27

N

4

Cl

83,5
±8,2

53

±3,9

38

±4,2

89

±12,2

45

±4,9

32

±1,6

91,6
±2,1

36,9
±0,2

27,8
±0,9

100

±6,0

41

±7,2

29

±0,9

С

26

Н

29

N

4

I

60

±6,7

45

±2,5

11

±1,3

72

±3,1

55

±8,8

31

±1,8

49

±0,1

40

±0,5

38,±

1,1

96,7
±5,2

0

0

С

25

Н

26

N

4

67±
5,4

30±

1,9

10±

0,6

24±
4,4

10,5
±0,9

9±0,9

39
±
3,2

27
±
2,1

14±1

,5

98
±
7,2

60
±
3,1

34
±
0,5

Фенилги
др азин

100±

15,5

99±
1
8

54±23

99±
21,5

82±

11

37±
5,9

78±5

,0

54
±
3,5

44
±
2,5

100±

22

85±1

3

74
±
9,5

Цисплат
ин –Тева

100

±7,1

72

±2,2

33

±1,9

100

±11,2

79

±4,4

23,5±

2,5

70±0

,3

60±0

,5

54±0

,1

100
±11

69

±7,5

34

±2,1

Контроль

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Примечание:

достоверное отличие от контроля Р<0,05.

Как

видно

из

таблицы

6,

хлоргидрат

фенилгидразона

норфлуорокурарина C

25

H

27

N

4

Cl в концентрации 24 мМ/л (10 мкг/мл)

подавляет рост раковых клеток всех изученных типов почти на 50% и
низкотоксичен для нормальных клеток, по сравнению с препаратом
Цисплатин. LD

50

C

25

H

27

N

4

Cl составляет 7,7-12,5 мг/кг. Йодметилат

фенилгидразона норфлуорокурарина С

26

Н

29

N

4

I в концентрации 19,1 мМ/л (10

49

мкг/мл) не токсичен для фибробластов, но подавляет рост всех раковых
клеток в эксперименте. LD

50

С

26

Н

29

N

4

I находится в пределах 48-52 мг/кг, а

ожидаемая терапевтическая доза - 10 мг/кг, при которой данное соединение
способно подавлять рост карциномы гортани на 50%, рост клеток рака
молочной железы и шейки матки почти на 40%.

Выявлено также, что более цитотоксически активное соединение

хлоргидрат фенилгидразона норфлуорокурарина не вызывало «утечки»
цитозольного фермента ЛДГ, т.е. повреждения мембран не наблюдалось, в то
время

как

другое

производное

йодметилат

фенилгидразона

норфлуорокурарина повреждало мембраны раковых клеток в концентрациях
1-10 мкг/мл, как и противоопухолевый препарат цисплатин.

Таким образом, наибольшей цитотоксической активностью, как по

отношению к культурам раковых клеток, так и по отношению к клеткам
фибробластам, обладает хлоргидрат фенилгидразона норфлуорокурарина, т.е.
абсолютно неизбирателен, в то время как йодметилат фенилгидразона
норфлуорокурарина

действует

более

избирательно,

в

частности

в


background image

концентрации 1-10 мкг/мл (1,91-19,1 мМ/л) он подавляет рост раковых клеток
и нетоксичен для нормальных клеток фибробластов. Оба производных могут
быть исследованы методами

in vivo,

как перспективные

компоненты

противоопухолевых препаратов.

Помимо

химических

соединений

природного

происхождения

перспективными в плане создания эффективных противоопухолевых
препаратов

являются

соединения

синтетического

происхождения.

В

литературе описан синтезированный смешанный ангидрид дихлоруксусной и
аминоуксусной

кислот,

обладающий

низкой

цитотоксичностью

по

отношению к нормальным клеткам, но при этом ингибирующий рост
карциномы молочной железы 755 (патент RU № 2429224, 2009г.). Также
синтезирован

ряд

производных

фенилуксусной

кислоты,

которые

предлагаются для лечения неоплазии, образующейся из эпителиальных
клеток (Б.С.Федоров, 2009г.).

В этой связи нами изучены на цитотоксическую активность

производные фенил- и феноксиуксусных кислот, синтезированные в
лаборатории орг. синтеза химфака НУУ (под рук. А.К.Абдушукурова). Так
изучены n-Cl-ацетилфенилуксусная кислота и n-Cl- феноксиуксусная кислота
(рис. 4., табл. 7.)

CH

2

COOH

ClCH

2

C=O

OCH

2

COOH

Cl

(1) (2)

Рис. 4. Производные фенил- и феноксиуксусных кислот - n-Cl

ацетилфенилук-сусная кислота (1) и n-Cl- феноксиуксусная кислота (2)

50

Таблица 7

Цитотоксическая активность производных фенокси- и фенилуксусной

кислот, % ингибирования роста клеток (М ± м, n = 9)

№

Вещества

мкг/мл

HeLa

HEp-2

HBL-100

ККФ

10

1

10

1

10

1

10

1

1

n-Cl-ацетилфенилук

сусная кислота

13,3±

2,0

41±

1,2

23±

1,2

53±

5,1

60,0

±1,5

60,0

±0,9

25±

1,0

16±

0,9

n-Cl- феноксиуксус

ная кислота

4,3±

0,9

0

57±

4,2

43,6±

0,5

33±

0,2

29

±2,0

15±

0,2

19±

1,1

3

Цисплатин –Тева

68,5±

3,4

35±

2,3

76±

1,3

44±

1,2

76±

4,5

49±

3,0

72±

3,2

45±

2,2

4

контроль

0

0

0

0

0

0

0

0


background image

Примечание:

достоверное отличие от контроля Р<0,05, где в качестве контроля –

интактные клетки.

Как видно из таблицы 7, n-Cl-ацетилфенилуксусная кислота

наибольшую цитотоксическую активность проявила только в очень низкой
концентрации - 1 мкг/мл, ингибируя рост всех исследованных раковых
клеток, при незначительной цитотоксической активности на нормальных
культурах клеток фибробластов по сравнению с препаратом Цисплатин.
Производное - n-Cl-феноксиуксусная кислота подавляло рост клеток рака
гортани в концентрациях 1-10 мкг/мл и при этом обладало меньшей
цитотоксичностью по отношению к культурам клеток рака молочной железы
и шейки матки, а также к культурам нормальных клеток фибробластов.
Кроме того, данные соединения в концентрациях 1 мкг/мл вызывали
повреждения

плазматических

мембран

раковых

клеток,

о

чём

свидетельствовало появление цитозольного фермента лактатдегидрогеназы в
культуральных жидкостях при постановке ЛДГ-теста.

Таким образом, n-Cl-ацетилфенилуксусная кислота ингибирует рост

клеток рака гортани, рака шейки матки и молочной железы в низкой
концентрации 4,7 мМ/л (1 мкг/мл) почти на 50%. LD

50

по нашим расчётам

составляет 18-22 мг/кг, а терапевтическая концентрация - в пределах 1-10
мг/кг. IC

50

n-Cl-феноксиуксусной кислоты для клеток рака гортани равна 52

мМ/л (10 мкг/мл), LD

50

по нашим расчётам составляет 81-92 мг/кг, а

терапевтическая доза - 1-10 мг/кг, при которой данное соединение способно
подавлять рост карциномы гортани.

В результате выполнения поставленных задач по первому блоку

исследований –

поиску ингибиторов роста раковых клеток

, было

выявлено, что суммы алкалоидов из надземной части растения

Сonvolvulus

krauseanus

и из корней

Arundo donax

ингибируют рост клеток рака гортани и

низкоцитотоксичны для нормальных клеток; сумма алкалоидов из корней

Vinca major

ингибирует рост клеток рака шейки матки, и не подавляет рост

других клеток, в том числе нормальных. Из экстрактов грибов эндофитов,
паразитирующих на растениях рода

Vinca

отобраны экстракты с низкой

токсичностью для нормальных клеток и высокой токсичностью для раковых
клеток - экстракты штаммов грибов

Alternaria sp

(листья

V. erecta

),

51

Penicillium sp

(листья

V. erecta

, стебель

V. мinor

) и

Aspergillius tureus

(корень

V.

erecta

). Из индивидуальных соединений отобраны два низкотоксичных для

нормальных клеток селективных ингибитора роста клеток карциномы
гортани - N-бензил конвольвин и n-Cl-феноксиуксусная кислота, и два
неселективных ингибитора роста клеток рака гортани, рака шейки матки и
молочных желез - n-Cl-ацетилфенилуксусная кислота и йодметилат
фенилгидразона норфлуорокурарина. Из исследованных индивидуальных
соединений два хлорсодержащих соединения - хлоргидрат фенилгидразона
норфлуорокурарина

и

N-хлорацетил

конвольвин,

показали

схожую


background image

цитотоксическую активность с известным противоопухолевым препаратом
цисплатин и также могут быть изучены на противоопухлевую активность
методами

in vivo.

Далее нами решались задачи по второму блоку исследований –

поиску

пролифераторов

роста

нормальных

клеток

для

регенеративной

медицины.

Известно, что флавоноиды и фитостероиды способны индуцировать

биосинтез белка и могут быть хорошими пролифераторами роста нормальных
клеток. В этой связи интересно исследовать пролиферативную активность
фитостероидов и их суммы (экдистерона и туркестерона, а также аюстана -
суммы фитостероидов, иридоидов и других соединений, выделенных из
растения

Ajuga turkestanica

), флавоноидов (панаферола из

корня

Ferula

tenusecta

, пиносембрина, глабронина и пурнетина из надземной

части

Glyssiriza glabra

, цинарозида из надземной части

Ferula varia

),

выделенных в ИХРВ АН РУз (под рук. А.У.Маматханова). Исследования
проводили на 5-7 пассажах ККФ. Все исследованные флавоноиды и препарат
«Аюстан» в концентрациях 0,3-100 мкг/мл не проявили значимой
пролиферативной

активности,

исключение

составили

фитостероиды

туркестерон и экдистерон (табл. 8).

Таблица 8

Пролиферативная активность флавоноидов и фитостероидов на

культуре клеток фибробластов, % живых клеток (М ± м, n = 3)

Вещества

мкг/мл

100

50

25

12,5

6,25

3,12

1,6

0,8

Аюстан

67±0,1

62±0,22

78±0,3

64±0,11

89±0,22

72±0,21

94±0,23

106±0,3

Туркестерон

125±4,3

130±6,0

142±5,1

178±2,5

159±5,2

130±7,2

100±4,5 100±7,3

Экдистеро
н

91±8,7

90±3,5

101±4,2

180±9,2

130±5,3

134±9,5

146±7,3 100±5,3

Паноферол

0±0,02*

0±0,2

0±0,1

0±0,05*

0±0,1

0±0,2

48,9±2,3

74±3,3

Пиносембрин

0±0,1*

0±0,05*

0±0,02*

14±0,6

105±8,3

119±4,3

106±9,2

99±4,3

Цинарозид

58±11,2

93±9,3

75±2,1

79±9,7

91,5±6

91,4±6

81,8±6,1

84±7,1

Глабронин

23±4,2

72,9±8

76,3±5

112±1,2

113±9,3

108±11

107±7,2 105±4,5

Пурнетин

0±0,1*

0±0,02*

0±0,01*

47±2,2

135±9,5

122±11

97±7,7

110±5,5

Контроль

100%

Примечание:

*-достоверное отличие от контроля Р<0,01; достоверное отличие от

контроля Р<0,05; где в качестве контроля – интактные клетки.

Как видно из таблицы 8, пик пролиферативной активности

туркестерона и экдистерона приходится на концентрацию 12,5 мкг/мл, когда


background image

52

пролиферация клеток составляет 180%, при этом наблюдается некое плато
активности с уменьшением концентрации туркестерона до 10 мкг/мл. В связи
с большим количеством противоречивых данных по активностям
фитостероидов и учитывая широкий спектр их использования в медицине,
спорте и косметологии, нами были проведены исследования пролиферативно
активного и широко используемого в медицине фитотстероида –
экдистерона, на культурах раковых клеток, с целью выяснения степени его
безопасности (табл.9).

Таблица 9

Пролиферативная активность экдистерона на культурах

раковых клеток, % живых клеток, (М ± м, n = 9, Р<0,05)

Мкг/мл

HeLa

HEp-2

HBL-100

100

25

12,
5

3,12

100

25

12,
5

3,1
2

100

25

12,
5

3,12

Экди
стерон

54
±2,
3

62±

5,9

62±
4,2

65±
2,3

72±
5,3

80±

4,8

87±
2,7

74±
3,2

100±

16,
4

100±

13,
9

97±
5,8

69±
9,4

Цисп
лат
ин

0

0

2,8
±
0,2

32±
2,4

0

0

3±
0,2

48±
3,1

0

0

0

30±
2,9

Конт
роль

100

Установлено (см. табл. 9), что экдистерон в исследованных

концентрациях 3,12-100 мкг/мл не вызывает пролиферацию раковых клеток и
проявляет невысокую цитотоксическую активность на исследованных
культурах раковых клеток.

Таким образом, наиболее часто используемый в медицине и спорте

фитостероид экдистерон в концентрациях 3,12-100 мкг/мл не вызывает
пролиферацию раковых клеток, а потому его можно считать безопасным
анаболиком и пролифератором роста нормальных клеток.

Данный

пролифератор

был

использован нами в дальнейших

исследованиях. Оптимизированным нами способом были получены культуры
клеток фибробластов и кератиноцитов кожи кролика, выделен коллаген IV
типа и сконструированы тканеинженерные конструкции следующих типов: 1)
на коллагеновом геле культивировались только фибробласты –
дермальный эквивалент (ДЭ); 2) на коллагеновом геле культивировали
совместно фибробласты и кератиноциты (ДЭ+ПКК); 3) в первую
конструкцию ДЭ, в среду культивирования фибробластов добавляли
экдистерон в концентрации 12,5 мкг/мл (ДЭ+экдистерон). Все конструкции
были нанесены на ожоговые раны с целью выявления наиболее подходящей


background image

для регенеративной медицины конструкции и подтверждения пригодности
наших культур клеток для данных целей.

Для этого на выбритую холку усыплённым медицинским эфиром

тринадцати кроликам с помощью специального электрического прибора
наносили термические ожоги IIIА степени площадью 3 см

2

, по 4 ожога

каждому животному. После очистки ран от омертвевших тканей и обработки
антисептическим раствором на раны были имплантированы

тканеинженерные конструкции. При этом на одну из четырёх ран каждому

53

животному наносили только ДЭ, на вторую – ДЭ+экдистерон, на третью -
ДЭ+ПКК. На последнюю рану ничего не наносили – контроль. Трём
кроликам с такими же ранами, обработку ран осуществляли раствором
экдистерона (12,5 мкг/мл) в среде ДМЕМ/F12.

Результаты эксперимента по регенерации ожоговых ран представлены в

таблице 10.

Таблица 10

Влияние ДЭ и фитоэкдистероида на изменение площади ран и

сроков заживления (М ± м, n = 10, Р < 0,05)

Условия
опыта

Средняя площадь раны, см

2

Срок регенерации ран

5-е сутки 10-е сутки 15-е сутки 20-е сутки

сутки

ДЭ

2,3±0,09

1,3±0,11

0,9±0,08

0,6±0,06

22,9±1,1

ДЭ+экдист.

2,2±0,13

1,2±0,07

0,7±0,06

0,2±0,09

20,1±0,2

ДЭ + ПКК

2,2±0,11

1,2±0,12

0,6±0,09

0,1±0,09

19,9±0,2

Экдистерон

2,7±0,5

1,9±0,2

1,6±0,05

1,1±0,03

33±0,1

Контроль

2,9±0,14

2,2±0,16

1,9±0,02

1,5±0,07

38,9±0,6

Примечание:

сроки заживления указаны до полной эпителизации ран.

Как видно из таблицы 10, не обработанные контрольные раны зажили в

среднем за 38,3-39,5 дней, в то время, как раны с тканеинженерными
конструкциями зажили в 2 раза быстрее. При этом сложная конструкция,
состоящая из коллагена, фибробластов и кератиноцитов (ДЭ+ПКК)
способствовала регенерации ткани за схожие сроки (на 18,4 – 19,4 суток
раньше контрольных) с конструкцией, состоящей только из коллагена и
фибробластов, но с добавлением в среду культивирования экдистерона
(ДЭ+экдистерон). В то время как по отдельности ДЭ и экдистерон
действовали менее эффетивно на процесс регенерации. Раны, обработанные
только ДЭ, зажили на 15,5 – 16,5 суток раньше ран, ничем не обработанных
(контрольных), раны, обработанные экдистероном, зажили на 5,4 – 6,4 суток
раньше контрольных.


background image

Таким образом, опыт

in vivo

показал, что использование в

регенеративной медицине тканеинженерных конструкций совместно с
экдистероном,

активно

стимулирует регенераторные процессы кожи

реципиента, раны заживают в 2 раза быстрее необработанных ран, и
полученные нами культуры клеток кожи пригодны для регенеративной
медицины. Кроме того, использование для данных целей упрощённой
конструкции, состоящей только из фибробластов на коллагеновой подложке,
но культивированных в среде с экдистероном (ДЭ+экдистерон) по
эффективности сопоставимо с использованием более дорогостоящей и
трудоёмкой конструкции с кератиноцитами - ДЭ+ПКК. В этой связи
использование для лечения ожоговых ран и других долгонезаживающих ран
тканеинженерной

конструкции

из

коллагена

и

фибробластов,

культивированных в среде с экдистероном, считаем наиболее оптимальным.

В четвёртой главе диссертации

«Получение моноклональных

антител к рекомбинантному эритропоэтину и их применение»

приведены

54

результаты

получения моноклональных антител к рекомбинантному

эритропоэтину, создания на основе полученных антител иммуносорбента и
выделения природного ЭПО человека.

Гемопоэтический фактор роста - ЭПО, участвует в регуляции

продукции эритроцитов. Препараты на основе ЭПО по рекомендации ВОЗ
входит

в

стандарт

лечения

онкобольных,

проходящих

химио-

и

радиотерапию, и для лечения анемий другой этиологии. МКАТ-ЭПО

применяют для создания диагностических тест-систем, выявляющих
содержание ЭПО в биологических жидкостях.

В связи с широким спектром использования рЭПО и антител к нему,

мы сочли актуальным получить МКАТ-ЭПО методом гибридомной
технологии, с целью применения их как для создания тест-систем к ЭПО, так
и для использования их в качестве биосорбента для очистки в дальнейшем
рЭПО.

Известно, что гибридомы получают путем слияния нормальных

лимфоцитов иммунизированных животных с клетками миеломных штаммов.
В этой связи первостепенной задачей является подготовка агентов для
слияния. Учитывая, что ЭПО вырабатывается всеми млекопитающими,
достаточно сложно подобрать схему иммунизации животных.

Нами отработана оптимальная схема иммунизации мышей линии

BALB/c рекомбинантным эритропоэтином, дающая наибольший титр
антител к эритропоэтину. Так мышам массой 15-20 г трехнедельного возраста
мы внутрибрюшинно вводили 0,5 мл суспензии рЭПО «Recormon» (Roche,
Швейцария), содержащей 4 мкг белка с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ),
через неделю процедуру иммунизации повторяли с неполным адъювантом
Фрейнда (НАФ). Через два цикла иммунизации, мышей иммунизировали
рЭПО, адсорбированным на полиакриламидном геле в присутствии 15%
додецилсульфата натрия (гель-рЭПО). Затем через неделю мышам бустерно


background image

вводили 0,1 мл (9,8 мкг) рЭПО в хвостовую вену и тестировали. Параллельно
иммунизировали мышей линии BALB/c рЭПО по стандартной схеме, при
которой внутрибрюшинно вводили поочерёдно суспензии рЭПО с ПАФ и
НАФ, затем бустерно вводили 9,8 мкг рЭПО и тестировали. После каждого
цикла и по окончании иммунизации отбирали

сыворотку крови

иммунизированных животных и определяли титр антител к ЭПО методом
Оухтерлони (двойная диффузия в геле). Конечный титр антител составил
1:512 при модифицированной нами схеме иммунизации, в то время как при
стандартной схеме иммунизации титр ниже в 4 раза (1: 128).

Далее были получены гибридомы путем слияния в присутствии

полиэтиленгликоля (ПЭГ) клеток мышиной миеломы X Ag 8.653 со
спленоцитами мышей линии BALB/c, иммунизированных рЭПО по
отработанной схеме.

После окончания процедуры слияния осадок клеток ресуспендировали

в селективной среде ГАТ (гипоксантин, амидоптерин, тимидин), в которой
неслившиеся с лимфоцитами клетки миеломы погибают. Суспензию клеток
рассеивали в 96-луночные культуральные планшеты, на которые за сутки до

55

слияния высаживали макрофаги сингенных мышей (фидерный слой), и
культивировали в СО

2

-инкубаторе. Клоны гибридных клеток появлялись

через неделю. Из 192 рассеянных лунок в 45 наблюдали образование
гибридом (рис.5).

Рис. 5. Образование колоний гибридных клеток (3-5 день после

слияния клеток мышиной миеломы X Ag 8.653 со спленоцитами мышей
линии BALB/c, иммунизированных рЭПО), ок. ×10, об. ×40

Через 3 недели после слияния ГАТ-среду заменяли на ростовую среду

без селективных добавок, а на 14-ый день после слияния выявляли клоны
продуценты антител к рЭПО методом твердофазного иммуноферментного
анализа

(ИФА)

на

полистироловых

планшетах

для

ИФА

с

иммобилизованным рЭПО. Образование комплекса антиген – антитело
выявляли с помощью меченных пероксидазой анти-IgG мыши. Результат
измерения считали положительным, если значение оптической плотности
(ОП) образца в два и более раз превышало значение ОП отрицательного


background image

контроля. После тестирования выявлено 12- гибридом - продуцентов МКАТ
ЭПО. Из 12 лунок, содержащих гибридомы-продуценты, рассевали

гибридные клетки в концентрации 3-5 клеток в лунку (в лунки
предварительно высаживали макрофаги). Через 7-10 дней проводили
скрининг аликвот культуральных жидкостей образовавшихся клонов на
наличие МКАТ-ЭПО методом ИФА. Выявленные клоны-продуценты
реклонировали методом лимитирующего разведения в концентрации 1 клетка
в лунку. Затем еще раз проводили выявление клонов-продуцентов методом
ИФА.

Клоны-продуценты реклонировали и далее, путем серийных пассажей,

продуктивные

клоны

выводили

в

массовую

культуру.

Для

этого

размножившиеся

клетки

из

96-луночного

культурального

планшета

переносили в 24-луночный, затем в 4-луночный, после чего стабильные
гибридомы пересевали в культуральные флаконы по 25 – 50 мл.

Для проверки стабильности клонов, клоны были заморожены и

разморожены, далее рекультивированы и реклонированы. После чего в
результате скрининга и селекции нами были отобраны 2 субклона гибридом
Е10 (ОП = 2.8) и С9 (ОП = 3.0), продуцирующие МКАТ-ЭПО. Продуктивный
штамм обозначили ЭЕ10С9. Полученный штамм гибридных клеток

56

задепонирован в банке клеточных культур Института микробиологии РУз под

регистрационным номером № СКБ 169.

Для наработки больших количеств МКАТ-ЭПО гибридомы - продуценты в

количестве 1х10

6

клеток на мышь вводили внутрибрюшинно мышам линии

BALB/c. За сутки до этого животным делали инъекции НАФ по 0,5 мл. на

мышь. Через неделю у мышей образовывался асцит (до 6 мл асцита с одной

мыши). Концентрация антител в среднем составляла 6 мг/мл.

Полученные асцитные жидкости были протестированы нами на

наличие МКАТ-ЭПО и на наличие перекрёстного взаимодействия данных
антител с рЭПО, природным ЭПО (сыворотка крови) и двумя препаратами
фирмы «Roche» (Швейцария) - рекомбинантным интерфероном альфа-2а
«Roferon» и гемопоэтическим фактором роста нейтрофилов «Neupogen»
(табл. 11).

Таблица 11

ИФА перекрёстного взаимодействия МКАТ-ЭПО в асцитных жидкостях

с другими препаратами, указана оптическая плотность

Разведения

асцит. жидк.

Оптическая плотность

рЭПО

Сывор. плац. крови

Roferon

Neupogen

цельная

1,888

0,740

0,233

0,223

в 2 раза

1,602

0,746

0,253

0,266

в 4 раза

1,455

1,085

0,234

0,246


background image

в 8 раз

1,454

1,082

0,201

О,205

в 16 раз

0,745

0,905

0,232

0,216

в 32 раза

0,495

0,495

0,233

0,253

в 64 раза

3000

0,403

0,228

0,213

в 128 раз

3000

0,213

- К

2,346

+ К

0,086

Фон

Примечание:

- К

– отрицательный контроль (1

х

PBS),

+ К

– положит. контроль

МКАТ-ЭПО из набора «EPO-ELISA» («Roche», Швейцария).

Как видно из таблицы 11, асцитные жидкости содержат МКАТ-ЭПО,

которые взаимодействуют, как с природным ЭПО из сыворотки крови, так и с
рЭПО и не взаимодействует с другими белками крови - интерфероном и
фактором роста нейтрофилов.

Выделение и очистку антител осуществляли в несколько этапов.

МКАТ-ЭПО получали из культуральной и асцитной жидкостей путем
двукратного осаждения насыщенным раствором сульфата аммония. Затем
проводили обессоливание на сефадексе G-25 и доочистку на колонке с
подготовленной ДЭAЭ-целлюлозой, уравновешенной 5 мМ натрий

фосфатным буфером, рН 8,0 в градиенте от 0 до 0.25 М NaCl (рис. 6).

57

Рис. 6. Профиль элюции МКАТ-ЭПО при разделении на колонке с

ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 5 мМ натрий-фосфатным буфером,
рН 8,0 в градиенте NaCl

В результате, нами были получены и лиофильно высушены

высокоочищенных МКАТ-ЭПО.


background image

Методом

электрофореза

в

восстанавливающих условиях нами

установлено, что легкие цепи полученных нами моноклональных антител
имеют молекулярную массу 23,000 Да, а тяжёлые 52,000 Да, что
свидетельствует о принадлежности данных антител к классу G (рис.7).

Рис. 7. Электрофореграмма препарата МКАТ к ЭПО в 12% ПААГ

SDS (меркаптоэтанол)

:

первая полоса – маркеры (миозин - 250 кДа, фосфорилаза

- 98 кДа, глютамин дегидрогеназа - 64 кДа, алкоголь дегидрогеназа - 50 кДа,
карбоангидраза - 36 кДа, миоглобин - 30 кДа, лизозим - 16 кДа); вторая и третья
полосы - очищенные МКАТ-ЭПО двух субклонов.

Для выяснения специфичности взаимодействия МКАТ с антигенными

детерминантами ЭПО проводили прямой ИФА. Для этого в качестве
антигенов (АГ) сорбировали на пластик 96 луночного планшета по 60 мкг/мл
рЭПО «Roche» (Швейцария), природного ЭПО «Протеиновый контур»

(Россия) и сыворотку плацентарной крови. В качестве антител (АТ) служили
полученные нами МКАТ-ЭПО, за исключением лунок с положительным
контролем, где для сравнения использовали МКАТ-ЭПО «EPO-ELISA»
(«Roche», Швейцария) (табл. 12).

58

Таблица 12

Определение специфичности МКАТ-ЭПО методом ИФА

МКАТ
ЭПО,
мкг/мл

Антигены, сорбированные на пластик для постановки ИФА

рЭПО,

«Roche»

Нативный ЭПО,

«Протеиновый контур»

Сыворотка
плацентарной крови

К+

К

20

3,000

3,000

1,120

3,00
0

0,110

15

1,980

2,800

0,770

3,00
0

0,100

10

1,900

1,890

0,430

2,790

0,110


background image

5

1,290

1,500

0,200

1,850

0,150

2,5

0,950

1,150

0,150

1,340

0,110

1,7

0,430

0,860

0,120

0,85
0

Фон 0,09

Примечание:

Положительный контроль «

К+»

– рЭПО с МКАТ-ЭПО

«EPO

ELISA»

(«Roche», Швейцария), отрицательный контроль «

К-»

- фосфатно солевой буфер

(1*PBS).

Как видно из таблицы 12, полученные нами МКАТ-ЭПО, специфично

взаимодействуют как с природным ЭПО «Протеиновый контур», так и с
рЭПО и по активности не уступают МКАТ-ЭПО «EPO-ELISA».

Титр антител также исследовали методом ИФА. Титр антител в

культуральной жидкости составлял 2х10

4

, в асцитной - 1х10

7

. Высокий титр 4

х 10

7

показала суммарная очищенная фракция МКАТ-ЭПО.

Таким образом, были наработаны, выделены, очищены и

охарактеризованы МКАТ-ЭПО.

С целью проверки эффективности полученных нами МКАТ-ЭПО, в

качестве иммуносорбента для препаративного получения и очистки ЭПО из
плацентарной крови методом аффинной хроматографией, нами синтезирован
иммунносорбент на основе полученных МКАТ-ЭПО (BrCN-сефароза 4В –
МКАТ-ЭПО). Иммуносорбент готовили путем конъюгации антител с BrCN
сефарозой 4В. Для этого к 1г сефарозы 4В, активированной BrCN и

набухшей в 1мМ HCl, добавляли 3 мл (15 мг/мл), полученных МКАТ-ЭПО и
инкубировали 12 часов. Антитела предварительно были переведены путем
диализа в 0,1М натрий-карбонатный буфер, 0,5M NaCl (рН 8,3). После
адсорбции антител суспензию с сефарозой отмывали 0,1М натрий

карбонатным буфером (рН 8,3), а затем добавляли 1М раствор этаноламина,

рН 9. После чего, сорбент последовательно промывали растворами 0,1М
натрий-карбонатного буфера с 1M NaCl (рН 8), 0,1М натрий-ацетатного
буфера с 1М NaCl (рН 4) и далее 0,1М натрий-боратного буфера с 1M NaCl,
(рН 8,5). Колонку 1x10 см заполняли гелем, содержащим 30 мг антител к
эритропоэтину.

ЭПО выделяли из плацентарной крови, удаляли форменные элементы крови,

диализовали против 25мМ фосфатного буфера, рН 4,5. Затем удаляли

балластные белки на ДЭАЭ целлюлозе-52. Элюцию ЭПО с ДЭАЭ целлюлозы

проводили 0,1М натрий фосфатным буфером, рН 4,5. Элюат диализовали

против воды и лиофильно высушивали. Лиофильно высушенные фракции,

растворяли в 0,1М натрий-боратном буфере с 0,5М NaCl, рН 8,5 и наносили 5

мл белка (3 мг/мл) на колонку с биосорбентом BrCN-сефарозой 4В – МКАТ-

59

ЭПО. Несвязавшиеся белки удаляли тем же буфером. Далее элюцию белка


background image

последовательно проводили 0,1М натрий-ацетатным буфером, 0,5М NaCl, рН
3,2 и 0,5М натрий ацетатным буфером, 1MNaCl, рН 3,2. Измерение
оптической плотности фракций проводили при 280 нм (рис.8).

Рис. 8. Профиль элюции при аффинной хроматографии природного

ЭПО на колонке с МКАТ к ЭПО - BrCN - сефарозой.

Колонка размером

1х10 см уравновешена 0,1 М Na-боратным буфером, рН 8,5.

Получили 3 фракции белка. Методом ИФА было установлено содержание

ЭПО во второй фракции белка (ОП=0,979

)

. Третья фракция также содержала

ЭПО по ИФА тесту (ОП=0,507

)

, что свидетельствует о различной

аффинности фракций ЭПО. Фракции II и III объединяли в одну, диализовали

против дистиллированной воды и лиофильно высушивали.

Гомогенность объединенной фракции определяли методом гель

электрофореза по методу Laemmli (рис.9)

Рис. 9. Электрофореграмма фракции эритропоэтина в 12% ПААГ

SDS в присутствии β-меркаптоэтанола

: 1 - смесь маркерных белков

(фосфорилаза В – 96 кДа, бычий сывороточный альбумин - 67 кДа, овалбумин – 43
кДа, ингибитор трипсина из сои - 24 кДа.), 2 - фракция ЭПО, после аффинной
хроматографии, 3 - исходная фракция ЭПО, до аффинной хроматографии.

60


background image

Молекулярная масса полученного ЭПО находится в пределах 32-36

кДа, что соответствует литературным данным и связанно с различной
степенью гликозилированности ЭПО.

Таким образом, полученные нами МКАТ-ЭПО пригодны для

выделения природного и рекомбинантного ЭПО методом аффинной
хроматографии и будут очень полезны не только как компоненты
диагностических тест-систем, но и как биосорбенты для промышленного
выделения рЭПО.

ВЫВОДЫ

1. Изучена цитотоксическая активность экстрактов растений рода

Vinca

и грибов эндофитов, паразитирующих на растениях рода

Vinca

на культурах

клеток рака гортани - HEp-2, рака шейки матки – HeLa, рака молочной
железы- HBL-100 и на нормальных клетках фибробластов, гепатоцитов.
Установлено, что экстракты как растений, так и грибов обладают
цитотоксической активностью. При этом экстракт из корней

Vinca major

проявляет большую специфичность к клеткам HeLa, а экстракт грибов
эндофитов

Alternaria sp.

, паразитирующих на листьях

Vinca erecta

обладает

большей специфичностью к клеткам HBL-100 при низкой цитотоксичности
для нормальных клеток.

2. Изучена цитотоксическая активность суммарных фракций

алкалоидов из растений родов

Сonvolvulus, Arundo

и

Buxus

. Установленно,

что алкалоиды из надземной части растения

Сonvolvulus krauseanus

ингибируют рост клеток HEp-2, а из корней

Arundo donax

ингибируют рост

клеток HEp-2 и HeLa, при низкой токсичности для фибробластов.

3. Изучена цитотоксическая активность тропановых алкалоидов из

растений

рода

Сonvolvulus

и

их

производных.

Установлено,

что

цитотоксическая активность зависит от природы радикала при атоме азота
тропанового остатка. Наибольшей специфичностью обладает N-бензил
конвольвин, ингибируя рост клеток HEp-2 (IC

50

= 12,3 мМ/л) с низкой

токсичностью для клеток фибробластов (IC

50

= 32,8 мМ/л).

4. Изучена цитотоксическая активность норфлуорокурарина - алкалоида

из растения

Vinca erecta

и его синтетических производных. Установлено, что

наибольшей избирательностью обладает йодметилат

фенилгидразона

норфлуорокурарина, ингибируя рост клеток HEp-2, HeLa и HBL-100 (IC

50

=

19,1 мМ/л для всех раковых клеток) при низкой токсичности

для

фибробластов (IC

50

= 95,5 мМ/л).

5. Изучена цитотоксическая активность производных фенил- и

феноксиуксусных кислот. Выявлен селективный ингибитор роста клеток рака
гортани

-

n-Cl-феноксиуксусная

кислота

(IC

50

=

5,2-52

мМ/л),

низкотоксичный для нормальных клеток (IC

50

= 442 мМ/л). n-Cl

ацетилфенилуксусная кислота ингибирует рост клеток Hep-2, HeLa и HBL
100 (IC

50

= 4,7-5 мМ/л) и низкотоксичен для нормальных клеток (IC

50

= 94

мМ/л).


background image

61

6.

Изучена

цитотоксическая

и

пролиферативная

активность

фитостероидов. Установлено, что фитостероид - экдистерон подавляет рост
клеток Hep-2, HeLa и HBL-100 на 15% и при этом вызывает пролиферацию
роста нормальных клеток фибробластов на 80%.

7. Оптимизирован способ получения тканеинженерной конструкции

кожи, состоящей из клеток фибробластов на коллагеновой подложке, для
лечения ожоговых ран. Показано, что использование экдистерона совместно
с тканеинженерной конструкцией, в 2 раза ускоряет эпителизацию ожоговых
ран.

8. Получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к

рекомбинантному эритропоэтину. Отобраны два наиболее перспективных
субклона

гибридных

клеток-продуцентов,

которые

в

дальнейшем

использованы для получения препаративных количеств моноклональных
антител к рекомбинантному эритропоэтину.

9. Выделены из асцитной жидкости, очищены и охарактеризованы

моноклональные антитела к рекомбинантному эритропоэтину. Установлено,
что

моноклональные

антитела

к

рекомбинантному

эритропоэтину

перекрёстно взаимодействуют как с плазменным эритропоэтином, так и с
рекомбинантным, и относятся к классу IgG. Титр антител в асцитной
жидкости составил 1 х 10

7

, в культуральной - 2 х 10

4

. Высокий титр 4 х 10

7

показала суммарная очищенная фракция МКАТ-ЭПО.

10. Разработан метод выделения эритропоэтина из плацентарной крови

человека с использованием иммуносорбента, синтезированного на основе
моноклональных антител к эритропоэтину человека.

11. Разработаны и утверждены Методические Рекомендации «Оценка

цитотоксичности лекарственных средств, изделий медицинского назначения,
косметических средств, химических соединений, пестицидов и средств для
ветеринарии» (8Н-Р/18 от 02.03.2016г.).


background image

62

SCIENTIFIC COUNCIL ON AWARD OF SCIENTIFIC DEGREE OF

DOCTOR OF SCIENCES 16.07.2013.K/B/T.13.01 AT THE INSTITUTE OF

BIOORGANIC CHEMISTRY AND THE NATIONAL UNIVERSITY OF

UZBEKISTAN

INSTITUTE OF THE CHEMISTRY OF PLANT SUBSTANCES

TSEOMASHKO NATALYA YEVGENEVNA

UZING CELL CULTURES (NORMAL AND TRANSFORMED

MALIGNANTLY) FOR SCREENING BIOLOGICALLY ACTIVE

SUBSTANCES AND OBTAINING THE MONOCLONAL ANTIBODIES

02.00.10 – Bioorganic chemistry

(biological sciences)


background image

ABSTRACT OF DOCTORAL DISSERTATION

TASHKENT - 2016

63

The subject of doctoral dissertation is registered by the Supreme Attestation

Commission at the Cabinet of Ministers of Republic of Uzbekistan under number
30.09.2014/В2014.5.В69

Doctoral dissertation is carried out at the Institute of the Chemistry of Plant Substances of

Academy of Sciences of Republic of Uzbekistan.

The full text of doctoral dissertation is placed on web page of Scientific council

16.07.2013.K/B/T.13.01 of the Institute of Bioorganic Chemistry and the National University of
Uzbekistan to the address http://ss.biochem.uz

Abstract of dissertation in three languages (Uzbek, Russian, English) is placed on web

page to address http://ss.biochem.uz and on Information-educational portal “ZiyoNet” to address
www.ziyonet.uz

Scientific Consultant: Azimova Shahnoz Sadikovna

doctor of sciences in biology, professor

Official opponents: Akhuniv Ali Akhunovich

doctor of sciences in biology, professor

Dalimova Surayo Nugmanovna

doctor of sciences in biology, professor

Saitmuratova Ogiljon Khudaybergenovna

doctor of sciences in biology, docent

Lead organization: Tashkent Pharmaceutical Institute

Defense will take place on «___»_____________2016 at ___at the meeting of the

Scientific council 16.07.2013.K.B.T.13.01 of the Institute of Bioorganic Chemistry and the


background image

National University of Uzbekistan at the following address: 100 125, Tashkent, 83 M.Ulugbek
street. Phon: 262 35 40, Fax: (99871) 262 70 63; e-mail: asrarov54@mail.ru

Doctoral dissertation is registered in library at the Institute of Bioorganic Chemistry, it is

possible to review it in library (100125, Tashkent, 83 M.Ulugbek street. Phone: 262 35 40, Fax:
(99871) 262 70 63)

Abstract of dissertation sent out on «____»______________2016 year

(mailing report_______on «___»___________2016 year)

A.S. Turaev

Chairman of Scientific council on award of scientific degree

of doctor of sciences, D. ch. Sc., Professor

M.I. Asrarov

Scientific secretary of Scientific council on award of

scientific degree of doctor of sciences, D. b. Sc.

D.A. Kadirova,

Chairman of Scientific seminar under Scientific council on award

of scientific degree of doctor of sciences, D. b. Sc.

64

INTRODUCTION (abstract of doctoral dissertation)

Topicality and relevance of the theme of the dissertation.

One of the

urgent tasks of bioorganic chemistry, cell biology and pharmacology is the
identification of novel compounds having antitumor property and other biological
mechanisms. For many years in the republic’s scientific laboratories systematic
research conducted on the isolation and synthesis of various classes of compounds
and the study of their pharmacological activity, some of the compounds tested on
various biological activities such as anti-arrhythmic, cholinesterase, estrogenic and
anti-inflammatory, however their cytotoxic activity has not be studied.

Screening of cytotoxic activity of chemical compounds, pharmaceuticals,

in

vitro

medical devices on different cell cultures is an integral part of pre-clinical

studies according to international standards GLP (Good Laboratory Practice).
Methods of

in vitro

studies allow significantly reducing the cost and reducing the

time of the preliminary study of new chemical compounds.

Such problems as the differentiation, tumorigenesis, cell motility,

proliferation, transfer of genetic information, regulation of gene expression and
others settled in the world of science, mainly with the use of cell cultures. Cell
cultures are also of great importance for the solution of applied problems of
medicine and agriculture. In particular, the main problems of application should
include the massive industrial production of vaccines and physiologically active
compounds, the preparation of monoclonal antibodies by hybridoma technology,
and the treatment of serious diseases using gene therapy and cell replacement
therapy.


background image

In connection with the above identification of compounds which inhibit the

growth of tumor cells with low toxicity for normal cells and substances of
proliferating the growth of normal cells, but not the cancerous for regenerative
medicine, as well as preparation of hybridomas producing monoclonal antibodies
to erythropoietin is relevant.

This research work to a certain degree corresponds to the tasks provided in

the Resolution of the President of the Republic of Uzbekistan dated November 28,
2011 № PP-1652 "On measures to further deepen the reform of the health system"
and the Cabinet of Ministers of March 29, 2012 № 91 "on measures to further
strengthen the material-technical base and improvement of the organization of
medical institutions," and other legal documents.

Relevance of the research to the priority areas of science and technology

development of the republic.

This study was performed in accordance with the

priority areas of science and technology of the Republic VI. "Medicine and
Pharmacology."

Review of international research on the topic of the dissertation.

Research, such as those aimed at identifying highly specific for each type of tumor
cell connections, screening compounds for cytotoxicity, preclinical studies of
chemical compounds and drugs with the help of

in vitro

methods, are carried out in

the leading research centers and higher educational institutions of the world,
including the National Institutes of Health (Maryland, USA), the National cancer
Institute

65

(Rockville, USA), at the Institute of Pathology (Seattle, USA), Rockefeller

University (USA), the Institute of Cytology (Russia), in the Institute of Bioorganic
chemistry (Uzbekistan); in Cancer Research at the WHO Centre (Belgium), EURL
ECVAM and the EPAA (Europe), JaCVAM (Japan), KoCVAM (Korea), Health
Canada (Canada), ICATM (USA), Vitroscreen (Italy) and others.

As a result the research carried out in the world on identification of

compounds involved in directed action using

in vitro

methods on different cell

cultures, obtained a series of research results, including: identified new inhibitors
of the growth of cancer cells, developed targeted therapies vintafolid (Merk & Co,
USA), erlotinib (Roche, Switzerland) afatinib (Boehringer ingelheim pharm. Inc.,
USA), krizotinib (Pfizer

Inc., USA) and tseritinib (Novartis, USA), causing

inactivation of the mutant protein in tumor cells, and bevacizumab (Pfizer Inc.,
USA) which inhibits angiogenesis; obtained monoclonal antibodies to various
antigens, including erythropoietin and («Roche», Switzerland, "Protein contour",
Russia).

Currently, in the world with present screening methods

in vitro

chemical

compounds and drugs in the order of priority areas of research are carried out,
including the identification of selective cancer cell growth inhibitors for cancer;
proliferators selective growth of normal cells for regenerative medicine;
determination

of total and specific types of cytotoxicity, identification of

mechanisms of action of the compounds at the cellular level.


background image

The degree of study of the problem.

Studies on the effect of compounds

that inhibit the growth of tumor cells using

in vitro

methods started in the world

since the late '70s (R.I.Freshney, T.Mosmann, K.Taylor, G.Taju), even earlier the
use of cell culture in regenerative medicine (P.B.Medawar, J.Rheinwald, N.Green),
the development of hybridoma technology to the mid-80s (Kohler and Milstein).
Currently these areas have a rapid development. Thus, screening of new
compounds in automated laboratories, for example, at Rockefeller University and
the National Institutes of Health in the US, carried out not only on the 96-well
plates, but also on the 384, 1536 or 3456 well plates for the so-called method of
HTS (high-throughput screening), while exploring the connections with the world
(J.Agrestia, X.Zhang, A.Florian).

In the CIG, progress in the field of screening substances on cultures of cells

and cultured human and animal cells were achieved by M.Y.Eropkin, G.Georgiev,
N.R.Tafrishyan, A.A.Alekseev, V.I.Shumakov, E.V.Parfenov and etc.

In Uzbekistan, the research on cell cultures also began at the end of the last

century. In the 70-80-ies the study of HeLa cell receptor systems and normal human
fetal cells were works of A.A.Abdukarimov, A.A.Aripdzhanov, T.G.Gulyamova,
Sh.S.Azimova, O.Petrova, S.E.Muchnik and others. At the Institute of the
chemistry of plant substances prof. A.H.Yuldashev for the first time antineoplastic
compounds such as vinblastine and vincristine were isolated, but their potency to
inhibit the growth of tumor cells was not detected at the Institute, instead it has
been identified in Hungary. In 2002-2003 in the laboratory of molecular genetics,
led by prof. Azimova Sh.S., hybrid cells producing the monoclonal antibodies to
the surface antigens of hepatitis B have been obtained. In 2005, the Institute of
Bioorganic Chemistry, N.N.Kuznetsova received and patented a new line of mouse
melanoma cells. In the

66

same year, the verified cancer cell lines (Hela, HEp-2 and HBL-100) were taken to

the laboratory of the molecular genetics in the Institute of the chemistry of plant
substances. Currently, the collection of cell cultures in the laboratory of the Institute
of the chemistry of plant substances and Institute of bioorganic chemistry are
constantly replenished with new cell lines, and the research on cell cultures is being
carried out.

Connection of dissertation work to the state programs or plans of

scientific-research works of the institution.

The dissertation research is carried

out within the framework of research projects of basic and applied projects of ICPS
on topics number A-10-144 "Production of monoclonal antibodies to
erythropoietin man" (2006-2008), number of FА-F3-Т041 "Preparation and study
of pharmacological toxicological properties of biologically active compounds by
genetic cell biology" (2007-2011), and the number of FА-F6-Т198 "The study of
the influence of biologically active substances on the metabolism of the cells"
(2012-2016).

The aims of the research work

are finding the cytostatic compounds -

inhibitors of growth of cancer cells with low toxicity for normal cells and


background image

compounds accelerating the growth of normal cells without the growth of
cancerous cells, and obtaining of hybrid cells (hybridomas) producing monoclonal
antibodies to recombinant erythropoietin.

The tasks of the research work.

By finding inhibitors of cancer cell growth:

study of the effects of individual compounds and extracts for malignantly

transformed cells culture (Hela - cervical cancer cells, HEp-2 - laryngeal cancer
and HBL-100 - breast cancer);

obtaining cell cultures of normal human fibroblasts and rat hepatocytes for

screening compounds;

study of the effects of extracts and of individual compounds on culture

normal cells (fibroblasts and hepatocytes).

For the search of proliferators’ growth of normal cells (for regenerative

medicine):

obtaining cell cultures of fibroblasts and keratinocytes, creating their tissue

based structures;

study of the effects of flavonoids and phytosteroids on the culture of human

fibroblasts;

study of the effect of identified proliferators cell growth and tissue

engineering design of the processes of healing of burn wounds

in vivo

. Upon

receipt of hybrid cells - producers of monoclonal antibodies to erythropoietin
(MAbs-EPO):

developing immunization scheme of mice line BALB/c with recombinant

erythropoietin;

fusion X63Ag8.653 mouse myeloma cells with splenocytes of mice BALB/c

line immunized with recombinant erythropoietin. Selection, Screening and cloning
of hybridomas-producing MAbs-EPO;

67

characterization and selection of promising clones for preparative amounts

of monoclonal antibodies to recombinant erythropoietin, obtaining ascites;
isolation and purification of monoclonal antibodies to recombinant erythropoietin;

isolation and purification of erythropoietin from placental blood by affinity

chromatography based on MAbs-EPO.

The objects of the research

were cells cultures of fibroblasts, keratinocytes,

and hepatocytes, cultures of cancer cells (Hela - cervical cancer cells, HEp-2 -
laryngeal cancer cells and HBL-100 - breast cancer cells), equivalent of dermal,
extracts, and individual compounds (tropane alkaloids, derivatives of phenyl and
phenoxyacetic acids, derivatives of phenylhydrazine with norfluorocurarin,
flavonoids, phytosteroids), the experimental animals with thermal burns IIIA,

mouse line BALB/c, myeloma cells X-63 AG8.653.

The subject of the research

- cytotoxic, metabolic and proliferative

activity, recovery of burn wounds, the ability of hybrid cells producing monoclonal
antidiv to erythropoietin and the use of the obtained monoclonal antibodies as


background image

immunosorbent.

The methods of the research work.

In the study methods of bioorganic

chemistry (methods of separation of protein, qualitative and quantitative
determination of protein, spectrophotometric and electrophoretic methods),
methods of cell biology and engineering (methods of obtaining primary cell
cultures and hybridomas), biochemical methods (colorimetric methods - MTT,
neutral red LDH-test), and immunochemistry (Ouhterlony method, ELISA) were
used.

Scientific novelty of the dissertation work

is that the first time: new

pharmacological activity of a number of compounds and extracts is identified;

It proved that extracts - from the genus

Convolvulus

,

Vinca major

plant and

Arundo donax

, and endophyte fungi, parasites of the plants of genus

Vinca

have

selective cytotoxic activity on tumor cell cultures;

revealed a selective inhibitor of growth of larynx cancer cells - N-benzyl

сonvolvin – derivative of alkaloid convolvin, which isolated from active extract of
plants of the genus

Convolvulus

, does not inhibit the growth of breast cancer cells,

cervical and normal cells;

identified selective inhibitors of growth of cancer cells - n-Cl-phenylacetic

acid, n-Cl-phenoxyacetic acid and iodmethylat of phenylhydrazone of
norfluorokurarin;

It found that chlorinated alkaloids including derivatives of сonvolvin and

vinkanin, exhibit high cytotoxic activity on cancer cell cultures at a level of the
drug Cisplatin;

a method of producing cultures of mesenchymal cells;
It proved that ecdysterone increases proliferation of normal skin cells -

fibroblasts and keratinocytes, and not increases proliferation of cells of larynx
cancer, breast cancer and cervical cancer;

68

It found that used allofibroblasts together with ecdysterone increases

proliferation autoepidermocyts and epithelialization tissue, which can be used in
the treatment of burn wounds;

received hybridoma - producers of monoclonal antibodies to recombinant

erythropoietin.

Practical results of the research

are as follows

:

developed best practices for producing crops mesenchymal cells; conducted

screening of individual compounds and extracts from which inhibitors revealed the
growth of cancer cells with selective activity and growth of skin cells proliferator;

defined the dose of biological activity and toxicity of the compounds; It

developed an effective method for the treatment of burn wounds IIIA degree;
prepared hybridomas producing monoclonal antibodies to erythropoietin; It
developed a method for isolating erythropoietin, both natural and recombinant
produced based on monoclonal antidiv to erythropoietin.

The reliability of the

results.

The results were confirmed using modern analytical and statistical


background image

methods. Confirmation of these results serve and expertise, and practical
implementation of research results, discussion of the results of research at national
and international conferences, and the publication of research results in
peer-reviewed scientific publications and patents.

The scientific and practical

significance of the research results.

The research results presented in the

dissertation, have without a doubt, both fundamental and practical importance.
Selected from a large number of extracts and active individual compounds
inhibitors of cell growth and proliferators open the prospect of in-depth research in
these areas, identifying their mechanism of action.

Well-established

in vitro

methods for the preclinical screening of

biologically active substances, medicines according to international principles of
Good Laboratory Practice (GLP), allow you to quickly and efficiently assess the
cytotoxicity of new compounds and devices.

Identified individual extracts and compounds inhibiting the growth of cancer

cells with low cytotoxicity for normal cells, proposed for

in vivo

studies on

antitumor activity (patent applications № IAP20130222, № IAP20130304, № IAP
20140170, № IAP20140182).

Proposed methods of obtaining cultures of skin cells and tissue-engineering

structures, and programs included in their treatment of burn wounds significantly
accelerates epithelialization of deep skin lesions (patent № IAP20120160).

Implementation of the research results.

Based on the data obtained by the

screening of biologically active compounds for cytotoxicity and production of
monoclonal antibodies:

Obtained two subclones’ hybrid cells and a patent for the invention of

Intellectual Property Agency of the Republic of Uzbekistan (16.12.2002, № IAP
02943) which produce monoclonal antibodies to erythropoietin. The study
produced antibodies that deployed as an immunosorbent for the purification of
erythropoietin;

69

identified a new biological activity of the alkaloid N-benzyl convolvin and

protected by the patent invention of Uzbekistan (16.02.2012, № IAP 04965). The
compound in the study suggested as a selective inhibitor of the growth of cancer
cells of larynx under low cytotoxicity to normal cells.

Accreditation by “Uzstandard” to assess the cytotoxicity of medical devices

and drugs entering the market of the country (the accreditation certificate
№UZ.AMT.07.MAI.220).

The guidelines were accredited "Evaluation of the cytotoxicity of drugs,

medical devices, cosmetics, chemicals, pesticides and veterinary funds" (Chief of
the Science and Education Ministry of Health of the Republic of Uzbekistan,
№8N-P/18 of 02.03 .2016).

Approbation of the research results.

The research results on the theme of

the dissertation were presented in the form of reports and have been tested by 10
international and national research conferences, particularly at conferences of
young scientists (Tashkent, 2004, 2009, 2010, 2011, 2012), at the International


background image

Congress Biotechnology (Pushchino , Russia, 2006), on the 7th and the 10th
International Symposium of Chemistry of Natural Compounds (Tashkent, 2007,
2013), at the 3rd International Symposium on Edible Plant Resources and the
Bioactive Ingredients (Urumqi, China, 2012), at the 11th International Symposium
of Chemistry of Natural Compounds (Turkey, 2015).

Publication of the research results.

On the theme of the dissertation a total

of 28 scientific papers were published, including 2 patents RUz, 14 scientific
articles were published in the journals recommended by the Supreme Attestation
Commission of the Republic of Uzbekistan for publication of basic scientific

results of doctoral dissertations, including 11 national and 3 international journals.

The volume and structure of the dissertation.

The dissertation consists of the

introduction, four chapters, conclusions and a list of references and appendices.
The size of the dissertation is 227 pages.

70

THE MAIN CONTENT OF THE RESEARCH PAPER

In the introduction

of the dissertation, the topicality and relevance of the

research are substantiated, the aim and objectives of the research, its object and
subject are formulated, its conformity with the priorities of development of science
and technology of the Republic of Uzbekistan is shown, the scientific novelty and
practical results of the study are described, the theoretical and practical
significance of the obtained results are revealed, a list of introducing the research
results into practice, published works and information on the structure of the
dissertation are provided.

In the first chapter of the thesis

"Modern aspects of cell cultures to solve

scientific and applied problems of medicine, biology, chemistry

," gives an

overview of the literature, including an overview of cell cultures, methods of
cultivation and use of the cytotoxic activity of the extracts and the individual


background image

compounds on different cell cultures, on how to identify inhibitors and
proliferators of cell growth of modern anticancer drugs. Furthermore, data and
studies are presented on the application of the cell culture in regenerative medicine.
Individual sub-chapters are devoted to the hybridoma technology, as well as the
hormone erythropoietin, and drugs based on it.

In the second chapter of the thesis "

The materials, conditions and

techniques of bioorganic chemistry, biotechnology and cell biology used at
work

" shows examples of materials used in the work and methods, in particular -

the methods of Bioorganic Chemistry (gel filtration, immune-interchangeable and
affinity chromatography, spectrophotometry, electrophoresis and other methods in
the form of qualitative and quantitative determination of protein), methods of
engineering and cell biology (methods for producing cell cultures, hybridoma
tissue-engineering and construction), biochemistry techniques (colorimetric
methods - MTT, neutral red, a test-LDH) and immunochemistry (Ouchterlony
method, ELISA).

The third chapter of the thesis "

Study of cytotoxic and proliferative

activity of extracts and individual compounds

," discusses the results of

obtaining and culturing normal and malignantly transformed cells, and the results
of the screening for these cultures as extracts, as well as individual compounds for
cytotoxic and proliferative activity, as well as research cell cultures for use in
regenerative medicine.

Here, cultures of normal fibroblasts, keratinocytes, and hepatocytes, which

obtained by non-enzymatic explant, were used. However, this method has been
optimize by conditioning environments culturing with two percent of medium,
removed from confluent cultures of fibroblasts rich in growth factors (EGF -
epidermal growth factor, FGF - fibroblast growth factor, etc.) Moreover, matrix
proteins (collagens type I and III, elastin, etc.).

The main advantages of the optimized process for producing cell cultures

lies in the fact that it results in obtainment of a "young" pool and proliferative
activity of viable cells in one stage of differentiation, moreover, a feeder layer or a
whole row, is no longer necessary from commercial additives. This method of

71

obtaining cultures of normal cells is economical and highly productive, a
monolayer of cells formed from the same age, far from the “Hayflick limit,” which
is important in the regenerative medicine.

Thus, we have obtained a culture of fibroblasts cells (FCC) - human, dermal

rabbit, mice, rats and their embryos (Fig. 1), obtained primary cultures of skin
keratinocytes - PCK, and culture hepatocytes of rats – PCH (Fig. 2).


background image

A

B

C

D

E F

Fig. 1. Culture fibroblast cells:

A - explant of human dermis on the 3 day of

cultivation; B - human fibroblast monolayer on the 10 day; C - rabbit fibroblast monolayer
for 10 day; D - fibroblasts of rats on the 10 day; E – rat’s embryo fibroblasts on the 10 day;
F - fibroblasts of mouse on the 10 day (× 10 × 10).

A

B


background image

Fig. 2. The PCK of human on the 20th day of cultivation (A) and PCH

of rats on 3 day of cultivation (B),

(× 10, × 40).

Morphological studies of the obtained cultures showed that the PCK

presented epithelial-cells, FCC - fibroblast-like cells (Fig. 1, 2), and hepatocyte
cells contained 1-2 large nucleus, which corresponds to the literature data.

Cell cultures are useful for preclinical

in vitro

screening of chemical

compounds, drugs and medical devices, and for regenerative medicine. For the
screening of extracts and individual compounds for cytotoxic and proliferative
activity were used verified cancer cell line, which derived from the

72

Bank of Cell Cultures of the Institute of Cytology, such as HeLa - cervical

carcinoma cells, HBL-100 - breast cancer cells and Hep- 2 - laryngeal cancer cells.
Studies in cancer cell cultures held together with Khashimova Z., Terentyeva E.

Screening compounds were also performed on cultures of normal cells. FCC

used in the 5-7 passages and PCH in the 1 passage, when its reaches 80%
confluence. Screening of the metabolic state of the cells was assessed by the
following indicators: 1) reduce the overall activity of mitochondrial
dehydrogenases in colorimetric test Mosman - MTT test; 2) a decrease in
endocytosis of the vital dye neutral red, is correlated with lysosomal function -
neutral red test; 3) Incubation medium activity in the cytosolic enzyme lactate
dehydrogenase, which can be used as a marker of plasma membrane integrity
disorders (LDH-test). As a comparison drug cytotoxicity used anticancer drug -
"Cisplatin-Teva" (Phfarmachemie, B.V., Netherlands). Served as the control intact
cells, which contributes only culture medium.

Carried out screening on the cytotoxicity of extracts of plant genus

Vinca

,

obtained in ICPS AS RUz (under the lead. S.F.Aripova). It is known that plants of
this kind include vincaalkaloids, many of which exhibit anti-tumor activity
(R.Berges, 2014, V.Rai, 2014). For example, the well-known anticancer drugs
"Vincristine" and "Vinblastine" refer to vincaalkaloids.

In this regard, cytotoxic activity of the extracts was studied of the ground

part of the plant

Vinca major

and from the root of the plant

Vinca major

(Table. 1).

Table 1

Cytotoxic activity of the extracts, % inhibitions

the growth of cells (М ± м, n = 9)

Extracts

HeLa

HEp-2

CCF


background image

µg/ml

100

10

100

10

100

10

of ground part of

V. major

71±2,9*

30±2,2

77±3,04*

43±2,49

40±0,5* 19±0,1

from roots of

V. major

73±5,61*

50±4,38*

67±4,09*

5±0,05

30,4±0,1

0

Cisplatin-Teva

97,5±2,4 70±2,31* 89±0,28* 51±1,2 * 100±9,5* 72±3,1

Control

0

0

0

0

0

0

Note: significant difference from controls P <0.05; * P <0.01

It is found (see. Table 1) that from the extracts examined, the highest

cytotoxic activity was from the roots of the plant extract

Vinca major

. This extract

at a concentration of 10 µg/ml inhibited the growth of cervical cancer cells,
without inhibiting the growth of normal cells and its interest for further
investigations

in vivo

.

Based on the data, we found it interesting to carry out a screening of extracts

of fungi endophytes plant parasitic genus

Vinca.

So we studied the cytotoxic

activity of the extracts of eight fungi strains

Solerotium sp, Alternaria sp,

Penicillium sp, Acremonium sp

and

Aspergillius tureus

, parasitic plants

Vinca

minor

and

Vinca erecta

, allocated at the Institute of microbiology (under the lead.

T.G.Gulyamova). Extracts may include vincaalkaloids and inhibit the growth of
cancer cells (Table 2).

73

Table 2

Cytotoxic activity of the extracts of fungi endophytes,

% inhibition the growth of cells

(М ± м, n = 9)

Extracts

µg/ml

HeLa

НEр-2

HBL-100

PCH

10

0

10

1

100

10

1

100

10

1

10

1

Solerotium sp

V. minor

51±

6,2

20,5

±0,2

0±

0,1*

43±

1,8

30,5

±0,3

21±

0,6

73,5

±8,8

47±

1,6

29±

0,9

40±

4,9

12±

2,0

Penicillium sp

V. мinor

24±

0,4

19,5

±2,1

6±

0,1*

64±

3,3

61±

6,8

28±

0,1

72±

7,6

43±

4,2

40±

2,5

32±

3,7

9±

0,9

Acremonium sp

V. minor

37,5

±1,5

6,0

±0,3

0

36±

1,2

5±

0,1*

3±

0,2*

53±

1,3

27±

1,0

25±

0,6

20±

3,2

8±

1,5

Alternaria sp

V.

minor

82±

8,6

6,5±

0,6

1±

0,1*

36±

0,9

26±

1,9

11±

0,1

91±

7,5

47±

3,8

32±

3,2

76±

9,5

54±

6,2

Aspergillius tureus

V. erecta

51±

4,2

44±

3,6

9±

0,1*

53±

4,9

45,5

±3,1

32±

0,9

56±

3,1

54±

3,1

49±

3,0

34±

3,1

12±

2,2


background image

Penicillium sp

roots

V. erecta

36±

2,5

6,0±

0,1*

0

27±

0,6

20±

0,9

8±

0,1*

54±

2,4

50±

5,3

32±

1,2

29±

4,5

13±

2,9

Penicillium sp

V. erecta

72,5

±8,2

48

±

4,6

39

±

1,3

90±

9,7

39±

1,2

37,5

±1,2

79±

9,8

54±

4,7

45±

3,2

24±

3,8

16±

2,5

Alternaria sp

V. erecta

54,5

±2,5

28,5

±2,2

13±

0,2

47,5

±2,8

27±

0,8

13±

0,1

66±

5,2

64±

5,1

48±

2,8

50±

5,7

19±

2,7

Cisplatin-Teva

99±

2,6

78±

1,9

32±

2,6

99,5

±1,8

60±

1,6

41±

0,9

93±

4,9

76±

2,9

49±

0,3

98±

5,9

49±

3,3

Control

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Note: significant difference from controls P <0,05; * P <0,01.

As can be seen from Table 2, in low concentrations of 1-10 µg/ml the

highest inhibitory activity on cancer cell culture extracts showed

Alternaria sp

(liaves of

V. erecta

),

Penicillium sp

(liaves of

V. erecta

)

Aspergillius tureus

(root of

V. erecta

) and

Penicillium sp

(stem of

V. minor

), which in comparison with the

antineoplastic drug showed lowest cytotoxic activity on normal hepatocytes cell
culture. Note that out of the described extracts the selective cytotoxic activity was
only observed in the extract of fungi

Alternaria sp

(liaves of

V. erecta

) and only at

a concentration of 1 µg/ml, since greater suppressed the growth of breast cancer
cells glands - HBL-100. We propose that the extract fungi

Alternaria sp

, parasitic

on the liaves of

Vinca erecta

interesting in further in-depth studies

in vivo

.

Further screening for cytotoxicity was held amounts of alkaloids (AA),

obtained in ICPS AS RUz (under the lead. S.F.Aripova), from plants belonging to
the Cragg list - a list of plants as a source of anticancer agents.

Then was investigate cytotoxic activity of AA from plant

Convolvulus

krauseanu

, AA from plants

Buxus Semperviren L

. and AA of roots of

Arundo

donax

(Table. 3).

74

Table 3

Cytotoxic activity of the amounts of alkaloids,

% inhibition the growth of cells (М ± м, n = 9)

Amounts of

Alkaloids µg/ml

HeLa

HEp-2

CCF

100

10

100

10

100

10

AA from roots of Arundo

100±3,54

43±2,35

* 100±6,72

55±2,53

39±1,5*

0


background image

AA from C. krauseanus

46,5±2,7

7±0,8*

60,8±3,9

43,6±0,5

100±9,3*

0

AA from B.Sempervirens

99,4±5,5 17±1,05* 97,8±7,7

4,2±0,03 100±11,2 36±2,4

Cisplatin-Teva

97,5±2,4 70±2,31* 89±0,28* 51±1,2 * 100±9,5* 72±3,1

Control

0

0

0

0

0

0

Note: significant difference from controls P <0.05; * P <0.01

It was find of the studied AA that the most cytotoxic activity was show by

the AA roots of the plant

Arundo dona

x and AA from the plant

C. krauseanus

,

inhibiting the growth of cancer cells and not suppress the growth of normal cells.
AA from plants of the genus

Convolvulus

at the concentration of 10 µg/ml

inhibited growth of larynx cancer cells by about 50% without inhibiting the growth
of other test cells. In this connection it is interesting for further research on
methods of

in vivo

on anti-tumor activity are the AA from the genus

Convolvulus

and roots of the plant

Arundo donax

.

From amounts alkaloids of plants of genus

Convolvulus

(

C. subhirsutus, C.

krauseanus, C. pseudocanthabrica

) were allocated tropane alkaloids, obtained

their chemical derivatives, and studied by us for cytotoxicity.

Four alkaloids - convolvin (1) convolidin (2) convolinin (3) and fillalbin (4)

isolated from the plant genus

Convolvulus

. N-benzyl convolvin (5) and N

chloroacetyl convolvin (6) - are chemical derivatives of convolvin (under the lead.
S.F.Aripova).

All the compounds of the structure have a common skeleton tropane (8

azabitsiclooktan) are esters of an amino alcohol and veratric tropane (convolvin,
convolinin) or vanillin (convolidin) acids, and differ only in the substituent at the
nitrogen atom:

NR

1

O C O

OR

2

OCH

3

(1)

1. R

1

= H, R

2

= CH

3

2. R

1

= H, R

2

= OH

3. R

1

= CH

2

CH

2

-OH, R

2

= CH

3

4. R

1

= CH

3,

R

2

= CH

3

5. R

1

= CH

2

-C

6

H

5

, R

2

= CH

3

6. R

1

= COCH

2

Cl, R

2

= CH

3

Initial screening was conducted alkaloids at a concentration of 100 µg/ml in

four cell types - HeLa, HEp-2, PCH and CCF (Table 4.).

75

Table 4


background image

Cytotoxic activity of alkaloids in a concentration of 100

µg/ml, % inhibition the growth of cells (М ± м, n = 9, P <0.05)

Substances

HeLa

НEр-2

CCF

PCH

Convolvin

83,0±0,12

99,1±0,24

100±0,17

100±0,25

N-benzyl convolvin

90,3±0,22

100±0,23

100±0,28

100±0,71

Convolinin

35,0±0,12

79,0±0,32

65,5±0,31

89±4,2

Convolidin

27,0±0,35

20,0±0,12

100±0,41

98±2,5

N-chloroacetyl convolvin

100±0,24

98±0,11

100±0,13

100±2,4

Fillalbin

44±0,15

15±0,2

0

14±1,2

Cisplatin-Teva

100±0,2

100±1,5

100±0,5

100±2,5

Control

0

0

0

0

As shown in Table 4, high cytotoxic activity toward cancerous and normal

cells showed alkaloid convolvin R1 = H, R2 = CH3 (1) and its derivatives: N
benzyl convolvin R1 = CH2-C6H5, R2 = CH3 (5) and N-chloroacetyl convolvin
R1 = COCH2Cl, R2 = CH3 (6). While alkaloid fillalbin (4) R1 = CH3, R2 = CH3
at a concentration of 100 µg/ml inhibited more growth of cervical cancer cells and
was 2-4 times less cytotoxic to other cells in the experiment. Consequently, the
grouping - R1 = CH3, R2 = CH3 in structure of compound prevents the toxic effect
of the investigated compound on cell culture.

The greatest interest for practical medicine are substances that are active in

the low and very low concentrations. In our experiments, we also tested the same
compounds in a concentration of 10 µg/ml (Table 5).

Table 5

Cytotoxic activity of alkaloids in a concentration of 10

µg/ml, % inhibition the growth of cells (М ± м, n = 9, P

<0.05)

Substances

HeLa

НEр-2

CCF

PCH

Convolvin

15,4±0,17

8,0±0,13

100±0,24

88±6,2

N-benzyl convolvin

35,0±0,25

81,6±0,28

39,0±0,22

42±3,1

Convolinin

0

11,0±0,25

0

8±0,02

Convolidin

33,0±0,22

28,0±0,31

35,0±0,22

24±2,2

N-chloroacetyl convolvin

99,7±0,22

97±0,33

100±0,22

100±3,6

Fillalbin

0

0

0

0


background image

Cisplatin-Teva

88,6±1,2

91±0,5

78±0,4

82±1,6

Control

0

0

0

0

It was established that the greatest activity on cultures of cancer cells and

HeLa, HEp-2 at a concentration of 10 µg/ml or 26.3 mM/l and 27,3 mM/l,
respectively, showed alkaloids convolvin N-benzyl (5) and N-chloroacetyl
konvolvin (6). Alkaloid N-chloroacetyl convolvin (6) showed high cytotoxic
activity against all cell types in the experiment and was more cytotoxic than the
commercial anti-cancer drug cisplatin (LD

50

lethal dose of cisplatin to humans is

2.2 mg/kg). Consequently, the grouping - R1 = COCH

2

Cl, R2 = CH

3

in structure of

compound significantly increases the toxic effect of the investigated compound on

76

cell culture. N-benzyl convolvin selectively inhibits growth of larynx cancer cell

with IC

50

= 12,3 mM/l (4.7 µg/ml) and 3 times less toxic to normal cells. IC

50

N

benzyl convolvina to normal cells is 32.8 mM/l (12.5 µg/ml). LD

50

pereschitanaya

us of IC

50

values of 12,0-13,0 mg/kg by intravenous administration and the

expected therapeutic concentration may be within 4,4-5,0 mg/kg at which the
compound is able to inhibit the growth of laryngeal carcinoma, it is necessary to
investigate

in vivo

. In addition to chemical compounds of natural origin promising

in terms of creating effective anticancer drugs are compounds based on organic
synthesis.

Next, we have studied indole alkaloids and their derivatives with

phenylhydrazine (pyrazoles). Thus, the known synthetic derivatives of pyrazoles
possessing cytotoxic activity against colon cancer cultures (patent RU 2305545,
2006) and phenylhydrazine derivatives inhibit cell growth of the mammary glands
and cancer of the liver (Hafez O.M., 2014).

In the ICPS AS RUz isolated indole alkaloid norfluorokurarin C

19

H

20

N

2O

(vinkanin) from the roots of

Vinca erecta

(under the lead. A.H.Yuldashev) and

synthesized a complex compound pyrazole, which was formed by reaction with
phenylhydrazine - hydrazone norfluorokurarin C

25

N

26

N

4

. The interaction of the

compound with hydrochloric acid is formed - hydrochloride of phenylhydrazone of
norfluorocurarin

C

25

H

27

N

4

Cl, and iodide methylate - iodmethylate of

phenylhydrazone of norfluorocurarin C

26

N

29

N

4

I (Fig. 3).


background image

Fig. 3. Pyrazole derivatives: 1 – iodmethylate of phenylhydrazone of

norfluorocurarin, 2 - hydrochloride of phenylhydrazone of norfluorocurarin.

Based on the literature data on the antitumor activity of a series of pyrazole

derivatives and phenylhydrazine, we found it relevant to assess the cytotoxicity of
the compounds described above. As a result, it found that the starting compounds –
phenylhydrazine and hydrazone norfluorokurarin did not show the desired activity
unlike their derivatives (Tab. 6.).

77

Table 6

Cytotoxic activity of the derivatives of norfluorocurarin,

% inhibition the growth of cells (М ± м, n = 9)

Substances
µg/ml

HeLa

НEр-2

HBL-100

CCF

100

10

1

100

10

1

100

10

1

100

10

1

C

25

H

27

N

4

Cl

83,5
±8,2

53

±3,9

38

±4,2

89

±12,2

45

±4,9

32

±1,6

91,6
±2,1

36,9
±0,2

27,8
±0,9

100

±6,0

41

±7,2

29

±0,9

С

26

Н

29

N

4

I

60

±6,7

45

±2,5

11

±1,3

72

±3,1

55

±8,8

31

±1,8

49

±0,1

40

±0,5

38,6
±1,1

96,7
±5,2

0

0

C

25

N

26

N

4

67±
5,4

30±1,

9

10±0,

6

24±4,

4

10,5±

0,9

9±0,

9

39±3

,2

27±2

,1

14±1

,5

98±7

,2

60±3

,1

34±0

,5

Phenylhydraz.

100±

15,5

99±
1
8

54±23

99±2

1,5

82±1

1

37±

5,9

78±5

,0

54±3

,5

44±2

,5

100±

22

85±1

3

74±9

,5

Cisplatin-Teva

100

±7,1

72

±2,2

33

±1,9

100

±11,2

79

±4,4

23,5
±2,5

70±0

,3

60±0

,5

54±0

,1

100
±11

69
±7

34

±2,1

Control

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0


background image

Note: significant difference from controls P <0.05

Thus, it was found that C

25

H

27

N

4

Cl at a concentration of 24 mM/l (10 µg/ml)

inhibits the growth of cancer cells of all studied types nearly 50% with less
cytotoxic to normal cells than cisplatin. LD

50

of C

25

H

27

N

4

Cl is 7,7-12,5 mg/kg.

C

26

N

29

N

4

I at a concentration of 19.1 mM/l (10 mM/l) is not toxic to fibroblasts, but

inhibits the growth of cancer cells. LD

50

of C

26

N

29

N

4

I is 48-52 mg/kg, and the

expected therapeutic dose - 10 mg kg then this compound is able to inhibit 50% the
growth of carcinoma of the larynx, breast and cervical cancer cell. It also revealed
that a cytotoxic active compound C

25

H

27

N

4

Cl was not observed "leakage" of the

cytosolic enzyme LDH – marker damage of cell’s membrane, and while another
derivative - C

26

N

29

N

4

I damaged the membrane of cancer cells at concentrations of

1-10 µg/ml as the anticancer drug cisplatin.

Thus, the greatest cytotoxic activity, both in relation to cultures of cancer

cells, and on cells of fibroblast has hydrochloride of phenylhydrazone of
norfluorocurarin,

i.e. not completely selective, while iodmethylate of

phenylhydrazone of norfluorocurarin acts more selectively, particularly, at a
concentration of 10 µg/ml (19.1 mM/l) it inhibits the growth of cancer cells and
damaging their membrane, and this compound is not toxic to normal cells
fibroblasts. Both derivatives can be study

in vivo

, as a promising component of

anticancer drugs.

Other synthetic compounds, we studied the potency to inhibit the growth of

tumor cells and become phenyl derivatives of phenoxyacetic acid, as the literature
is evidence of cytotoxic activity of phenylacetic acid and its salts. We studied the
compound (Fig. 4) synthesized in National University of Uzbekistan (under the
lead. Abdushukurov A.K.), their ability to suppress the growth of cells is presented
in Table 7.

78

CH

2

COOH

ClCH

2

C=O

OCH

2

COOH

Cl

(1) (2)

Fig. 4. The derivatives of phenyl- и phenoxyacetic acids - n-Cl
acethylphenylacetic acid (1) и n-Cl- phenoxyacetic acid (2).

Table 7


background image

Cytotoxic activity of the derivatives of acetic acid,

% inhibition the growth of cells (М ± м, n = 9)

Substances

µg/ml

HeLa

HEp-2

HBL-100

CCF

10

1

10

1

10

1

10

1

n-Cl-acethylphenylacetic acid

13,3±

2,0

41±

1,2

23±

1,2

53±

5,1

60,0

±1,5

60,0

±0,9

25±

1,0

16±

0,9

n-Cl- phenoxyacetic acid

4,3±

0,9

0

57±

4,2

43,6

±

0,5

33±

0,2

29

±2,0

15±

0,2

19±

1,1

Cisplatin-Teva

68,5±

3,4

35±

2,3

76±

1,3

44±

1,2

76±

4,5

49±

3,0

72±

3,2

45±

2,2

Control

0

0

0

0

0

0

0

0

Note: significant difference from control p <0.05.

It is found that the n-Cl-acethylphenylacetic acid showed the highest

cytotoxic activity in low concentrations - 1 µg/ml to inhibit the growth of all tested
cancer cells, with small cytotoxic activity on normal fibroblast cell cultures as
compared with cisplatin. Derivative - n-Cl-phenoxyacetic acid most suppressed
growth of cancer cell of larynx in concentrations of 1-10 µg/ml and thus possess
less cytotoxic to cultures of breast cancer cells and cervical cancer, as well as the
normal fibroblast cell cultures. Furthermore, the compounds induced in
concentrations of 1 µg/ml damage of plasma membrane of cancer cells, indicating
what the appearance of the cytosolic enzyme lactate dehydrogenase in the culture
fluids at staged LDH assay.

Thus, n-Cl-acethylphenylacetic acid, inhibits growth cancer’s cells of larynx,

cervix, and breast cancer in a low concentration of 4.7 mM/l (1 µg/ml) almost
50%. LD

50

is 18-22 mg/kg, and the expected therapeutic concentration - 1-10

mg/kg. IC

50

n-Cl-phenoxyacetic acid for larynx cancer cells is 52 mM/l (10 µg/ml),

LD

50

of 81-92 mg/kg, and the expected therapeutic dose is 1-10 mg/kg dose which

the compound is able to inhibit the growth of laryngeal carcinoma.

As a result of the implementation of tasks in the first block of research - the

search for cancer cell growth inhibitors, it has been revealed that the total alkaloids
from aboveground part of plant of

Convolvulus krauseanus

and from roots of

Arundo donax

inhibits the growth of cancer cells of larynx and small toxity to

normal cells; sum of alkaloids from roots of

Vinca major

inhibits the growth of

79

cervical cancer cells and suppress the growth of other cells, including normal.

From extracts of fungi endophytes, parasitic on plants of genus of

Vinca

was

selecte extracts with low toxicity to normal cells and highly toxic to cancer cells -


background image

extracts of fungi strains of Alternaria sp (leaves

V. erecta

), Penicillium sp (leaves

V.

erecta

, stem

V. minor

) and Aspergillius tureus (root

V. erecta

). Selected two

individual compounds with low toxicity for normal cell and selective inhibitors of
growth of cells of laryngeal carcinoma - N-benzyl convolvin and n-Cl
phenoxyacetic acid, and two non-selective inhibitors of growth of cancer cells of
the larynx, cervix, and breast cancer - n-Cl-acethilphenilacetic acid and
iodmethylat of phenylhydrazone of norfluorocurarin. Another two individual
compounds - hydrochloride of phenylhydrazone of norfluorocurarin and N

chloroacetyl convolvin showed similar cytotoxic activity to the known anticancer
drug cisplatin and can be study on the anticancer activity

in vivo

.

Next, we meet the challenges of the second block of studies - search

proliferators growth of normal cells for regenerative medicine. It is known that
flavonoids and fitosteroids capable of inducing biosynthesis of proteins and may
be good proliferator growth of healthy cells.

In this regard, we considered relevant to investigate the proliferative activity

of fitosteroids (ecdysterone, turkesteron and ayustan - amounts of fitosteroids,
iridoids and other compounds, isolated from

Ajuga turkestanica

), flavonoids

(panaferol from the root of

Ferula tenusecta

, pinosembrin, glabronin and purnetin

of the aerial part of

Glyssiriza glabra

, cinarozid of the aerial part of

Ferula varia

),

dedicated to ICPS of Uzbek Academy of Sciences (under the lead.
A.U.Mamatkhanov) Research was carried out on 5-7 passages FCC. All the
investigated flavonoids and preparation "Ayustan" in concentrations of 0.3-100
µg/ml showed no significant proliferative activity, exception made fitosteroidy
turkesteron and ecdysterone (tab. 8).

Table 8

Proliferative activity of phytosteroids and flavonoids,

% of living cells (М ± м, n = 3)

Substances

µg/ml

Percentage of living cells of fibroblast

100

50

25

12,5

6,25

3,12

1,6

0,8

Ayustan

67±0,11

62±0,22

78±0,3

64±0,11

89±0,22

72±0,21

94±0,23

106±0,3

Turkesteron

125±4,3

130±6,0

142±5,1

178±2,5

159±5,2 130±7,2

100±4,5

100±7,3

Ecdysterone

91±8,7

90±3,5

101±4,2

180±9,2

130±5,3 134±9,5

146±7,3

100±5,3

Panaferol

0±0,02*

0±0,2

0±0,1

0±0,05*

0±0,1

0±0,2

48,9±2,3

74±3,3

Pinosembrin

0±0,1*

0±0,05*

0±0,02*

14±0,6

105±8,3

119±4,3

106±9,2

99±4,3

Cinarozid

58±11,2

93±9,3

75±2,1

79±9,7

91,5±6

91,4±6

81,8±6,1

84±7,1

Glabronin

23±4,2

72,9±8

76,3±5

112±1,2

113±9,3

108±11

107±7,2

105±4,5

Purnetin

0±0,1*

0±0,02*

0±0,01*

47±2,2

135±9,5

122±11

97±7,7

110±5,5

Control

100%


background image

Note: significant difference from controls P <0.05, *P <0.01, a control - intact cells.

As shown in table 8, the peak of proliferative activity of ecdysteron and

turkesteron accounts for the concentration of 12.5 µg/ml, when cell proliferation is

80

Библиографические ссылки

Цеомашко Н.Е., Азимова Ш.С. Влияние фитоэкдистероидов и дермального эквивалента на процессы регенерации термических ожогов кожи И Фарм. журнал Узбекистана. - Ташкент, 2012. - № 3. -С. 71-74. (03.00.00, №2)

Tseomashko N.E., Terent’eva Е.О., Kodirova D.B., Okhunov 1.1., Aripova S.F., Khashimova Z.S., Azimova Sh.S. Synthesis of convolininc and cytotoxic activity of alkaloids of the genus Convolvulus and their derivatives // Chemistry of Natural Compounds. -New York, 2013. -№6 (48). -P. 1039-1041. (03.00.00, №1)

Цеомашко H.E., Азимова Ш.С., Терентьева E.O., Хашимова З.С. Скрининг фитостероидов на культурах раковых клеток и нормальных клеток фибробластов // Журнал теорет. и клин, медицины. - Ташкент, 2013. -№3. -С. 36-39. (03.00.00, №4)

Цеомашко Н.Е., Азимова Ш.С. Получение первичных культур клеток кожи - фибробластов и кератиноцитов // Мед. журнал Узбекистана. -Ташкент, 2013.-№ 4. -С. 108 - 111. (01.07.11, №3)

Цеомашко Н.Е., Азимова Ш.С., Цай Е.А., Сыров В.Н. Получение дермального эквивалента кожи изучение регенеративныхпроцессов in vivo. // Мед. журнал Узбекистана. - Ташкент, 2013. - № 4. -С. 97 - 100. (01.07.11, №3)

Цеомашко Н.Е., Чориев А.У., Терентьева Е.О., ХашимоваЗ.С., Азимова Ш.С. Цитотоксическая активность производных уксусной кислоты// Журнал теорет. и клин, медицины. - Ташкент, 2014. -№4. -С. 15-17. (03.00.00, №4)

Цеомашко Н.Е., Терентьева Е.О., ХашимоваЗ.С., Арипова С.Ф., Юлдашев А.Х., Азимова Ш.С. Скрининг влияния растительных экстрактов на противоопухолевую активность in vitro // Журнал Теорет. и клин, медицины. - Ташкент, 2014. -№5. -С. 22-26. (03.00.00, №4)

Цеомашко Н.Е., Цай Е., Азимова Ш.С. Получение первичных культур клеток гепатоцитов для in vitro исследований // Узбекский биологический журнал, № 2, 2015г., с.40-42 (03.00.00, №3)

Хамидова У.Б., Терентьева Е.О., Цеомашко Н.Е., Хашимова З.С., Умарова Г.Б., Азимова Ш.С. Изучение цитотоксической активности йодметилата фенилгидразона норфлуорокурарина // Журнал теоретической и клинической медицины, №3, 2015г., с. 21-22 (03.00.00, №4)

Abdulmyanova L.L, Tseomashko N., Tercnteva E.O., Ruzieva D.M., Sattarova, Azimova Sh.S., Gulyamova T.G. Cytotoxic activity of fungal endophytes from Vinca // Int. Journal of current microbiology and applied sciences. -India, 2015. - № 7(4), -P. 321-329 (№5, Global Impact Factor, IF -0,654).

Патент РУз № IAP 02943. Штамм гибридных культивируемых клеток животного Mus Musculus L.-продуцент моноклональных антител к эритропоэтину / Юсупова Э.Г., Долгушина Н.Е., Хашимова З.С., Абдукаримов А.А., Салихов Ш.И., Азимова Ш.С. // Расмий ахборотнома. -2005. - № 6.

Патент РУз № IAP 04965. Средство, проявляющее избирательную цитотоксическую активность по отношению к клеткам рака гортани / Хашимова З.С., Арипова С.Ф., Цеомашко Н.Е., Терентьева Е.О, Охунов И.И., Кадирова Д.Б., Азимова Ш.С. // Расмий ахборотнома. - 2012. - № 6.

Цеомашко Н.Е., Юсупова Э.Г., Хашимова З.С., Азимова Ш.С. Получение моноклональных антител к эритропоэтину и их применение // Мед. журнал Узбекистана. - Ташкент, 2014. - № 1. -С. 97 - 100.

Цеомашко Н.Е., Чориев А.У., Цай Е.А., Терентьева Е.О., Хашимова З.С., Азимова Ш.С. Скрининг производных фенил- и феноксиуксусной кислот на противоопухолевую активность in vitro // Мед. журнал Узбекистана. - Ташкент, 2014. -№ 2. -С. 153 - 156.

Цеомашко Н.Е., Цай Е.А., Азимова Ш.С. Скрининг ряда флавоноидов на цитотоксическую и пролиферативную активности in vitro // Вестник республ. научн. журнал Южно-Казахстанской гос. фарм. академии. -Алма-ата, 2014. - № 3(68), Том IV, -С. 35-37.

Цеомашко Н.Е., Чориев А.У., Хашимова З.С., Азимова Ш.С. Получение производных уксусной кислоты и их биологическая активность // Вестник республ. научн. журнал Южно-Казахстанской гос. фарм. академии. -Алма-ата, 2014. - № 3(68), Том IV, -С. 31-35.

Долгушина Н.Е., Юсупова Э.Г., Хашимова З.С., Азимова Ш.С. Иммуногенная активность рекомбинантного эритропоэтина // Тез.докл.конф.молодых ученых, посвящённых памяти акад. С.Ю. Юнусова. -Ташкент, 2004. - С. 24.

Цеомашко Н.Е., Хашимова З.С., Юсупова Э.Г., Азимова Ш.С. Гибридомы - продуценты моноклональных антител к эритропоэтину // 4 Международный Съезд биотехнологов России. -Пущино, 2006. - С. 67-68.

Tseomashko N.E., Yusupova E.G., Khashimova Z.S., Makhmudova A.D., Azimova Sh.S. Developing of monoclonal antibodies to erythropoietin // 7th International Symposium on the Chemistry of Natural Compounds. - Tashkent, 2007.-C. 34.

Цеомашко Н.Е., Хашимова З.С., Юсупова Э.Г., Азимова Ш.С. Выделение и характеристика моноклональных антител к эритропоэтину // тез. докл конф. «Актуальные проблемы химии природных соединений». -Ташкент, 2009. -С. 193.

Цеомашко Н.Е., Сайдаминова К.С., Азимова Ш.С. Оптимизация метода получения культур клеток фибробластов, для дальнейшего применения их в комбустиологии // Тез. уст. докл. на Респ. науч. конф. молодых ученых «Взгляд молодых ученых на актуальные проблемы науки», посвященной году гармонично развитого поколения. - Ташкент, 2010. -С. 41.

Цеомашко Н.Е., Сайдаминова К.С., Азимова Ш.С. Изучение цитотоксичности биологически активных веществ на культурах клеток фибробластов // Тез. уст. докл. на Респ. науч. конф, молодых ученых «Взгляд молодых ученых на актуальные проблемы науки», посвященной году гармонично развитого поколения. - Ташкент, 2010. -С. 42.

Цеомашко Н.Е., Мамадалиева Н.З., Маматханова М.А., Азимова Ш.С. Изучение влияния флавоноидов на культуры клеток фибробластов // Тез. докл. Конф, молодых ученых, посвященной памяти акад. С.Ю. Юнусова. - Ташкент, 2011. -С. 57.

Цеомашко Н.Е., Терентьева Е.О., Хашимова З.С., Азимова Ш.С. Скрининг ряда алкалоидов на цитотоксичность // Тез. докл. Конф, молодых ученых, посвященной памяти акад. С.Ю. Юнусова. - Ташкент, 2012. -С. 6.

Tseomashko N.E., Azimova Sh.S., Terentyeva E.O., Kodirova D.B., Ohunov I.I., Aripova S.F., Khashimova Z.S. Investigation of cytotoxic activity of alkaloids of the genus Convolvulus and their derivatives // 3rd International Symposium on Edible Plant Resources and the Bioactive Ingredients. - Urumqi China, 2012.-P. 103.

Tseomashko N.E., Terentyeva E.O., Khashimova Z.S. Azimova Sh.S. Screening of cytotoxic activity of natural compounds from local plants of Uzbekistan // Thesis oral dokl on 10Th International Symposium of Chemistry of Natural compounds. - Tashkent, 2013. - P. 103.

Арипова С.Ф., Гаппаров A.M., Охунов И.И., Кодирова Д.Б., Цеомашко Н.Е., Набиев А., Хужаев В.У., Азимова Ш.С. Синтез и биологическая активность алкалоидов растений рода Convolvulus и их производных // “Химия гетероциклических соединений. Современные аспекты.” Серия монографий INTERBIOSCREEN под. ред. д.х.н., акад. В.Г.Карцева, ICSPFpress, том 1, -С. 80-83.

Azimova Sh.S., Tseomashko N.E., Terenteva E.O., Khashimova Z.S. Cytotoxic activity of biological active substances // 11th Intern. Symposium on the Chemistry of Natural Compounds, Antaya, Turkey, 1-4 October 2015, p. 180.

inLibrary — это научная электронная библиотека, построенная на парадигме открытой науки (Open Science), основными задачами которой является популяризация науки и научной деятельности, общественный контроль качества научных публикаций, развитие междисциплинарных исследований, современного института научной рецензии, повышение цитируемости узбекской науки и построение инфраструктуры знаний.

КОНТАКТЫ:

Республика Узбекистан, г. Ташкент, ул.Паркент 51, этаж 2

(+998) 99-006-61-10

info@inscience.uz

НАВИГАЦИЯ:

Журналы
Конференции
Организации
Авторы
Блог
Контакты
© Copyright 2025 in Science All Rights Reserved | Developed by in Science | Site create by in Designer