БИООРГАНИК КИМЁ ИНСТИТУТИ ВА ЎЗБЕКИСТОН МИЛЛИЙ
УНИВЕРСИТЕТИ ҲУЗУРИДАГИ ФАН ДОКТОРИ ИЛМИЙ
ДАРАЖАСИНИ БЕРУВЧИ 14.07.2016.К/В/Т.13.01
РАҚАМЛИ ИЛМИЙ КЕНГАШ АСОСИДАГИ
БИР МАРТАЛИК ИЛМИЙ КЕНГАШ
БИООРГАНИК КИМЁ ИНСТИТУТИ
ИБРАГИМОВ ФАЗИЛ АХМЕДОВИЧ
ОНКОЛОГИК КАСАЛЛИКЛАРНИ ДАВОЛАШДА СОЯДАН
ОЛИНГАН ОҚСИЛ ПРЕПАРАТИНИНГ БИОЛОГИК ФАОЛЛИГИ
02.00.10 – Биоорганик кимё
(биология фанлари)
ДОКТОРЛИК ДИССЕРТАЦИЯСИ АВТОРЕФЕРАТИ
ТОШКЕНТ – 2016
УДК 616.988.23.6:543.865-547.963.3
Докорлик диссертацияси автореферати мунтарижаси
Оглавление автореферата докторской диссертации
Content of the abstract of doctoral dissertation
Ибрагимов Фазил Ахмедович
Соядан олинган оқсил препаратининг онкологик касалликларни
даволашдаги биологик фаоллиги ………………………….…..5
Ибрагимов Фазил Ахмедович
Биологическая активность белкового препарата из сои в лечении
онкологических заболеваний ……………………………………….…31
Ibragimov Fazil Aymedovich
Biological activity of protein preparation from soybean in treatment of
oncological diseases 59
Эълон қилинган ишлар рўйхати
Список опубликованных работ
List of published works 85
2
БИООРГАНИК КИМЁ ИНСТИТУТИ ВА ЎЗБЕКИСТОН МИЛЛИЙ
УНИВЕРСИТЕТИ ҲУЗУРИДАГИ ФАН ДОКТОРИ ИЛМИЙ
ДАРАЖАСИНИ БЕРУВЧИ 14.07.2016.К/В/Т.13.01
РАҚАМЛИ ИЛМИЙ КЕНГАШ АСОСИДАГИ
БИР МАРТАЛИК ИЛМИЙ КЕНГАШ
БИООРГАНИК КИМЁ ИНСТИТУТИ
ИБРАГИМОВ ФАЗИЛ АХМЕДОВИЧ
ОНКОЛОГИК КАСАЛЛИКЛАРНИ ДАВОЛАШДА СОЯДАН
ОЛИНГАН ОҚСИЛ ПРЕПАРАТИНИНГ БИОЛОГИК ФАОЛЛИГИ
02.00.10 – Биоорганик кимё
(биология фанлари)
ДОКТОРЛИК ДИССЕРТАЦИЯСИ АВТОРЕФЕРАТИ
ТОШКЕНТ – 2016
3
Докторлик диссертацияси мавзуси Ўзбекистон Республикаси Вазирлар Маҳкамаси
ҳузуридаги Олий аттестация комиссиясида 30.09.2014/В2014.5.В68 рақам билан
рўйхатга олинган.
Докторлик диссертацияси Биоорганик кимё институтида бажарилган. Диссертация
автореферати уч тилда (ўзбек, рус, инглиз) Илмий кенгаш веб саҳифасига
(http;//ss.biochem.uz) ва «ZiyoNet» таълим ахборот тармоғида (www. ziyonet.uz)
жойлаштирилган.
Илмий маслахатчи: Кадирова Дильбар Абдуллаевна
биология
фанлари доктори
Расмий оппонентлар: Саитмуратова Огульджан Худайбергеновна
биология
фанлари доктори, доцент
Бугланов Анатолий Аюшевич
биология фанлари доктори, профессор
Гафур-Ахунов Мирза Али
тиббиёт фанлари доктори, профессор
Етакчи ташкилот: Республика иммунология илмий маркази
Диссертация ҳимояси Биоорганик кимё институти ва Ўзбекистон Миллий
университети ҳузуридаги 14.07.2016.К/В/Т.13.01 рақамли Илмий кенгаш асосидаги бир
марталик Илмий кенгашнинг 2016 йил «__» декабрда соат ___ даги мажлисида бўлиб
ўтади. (Манзил: 100125, Тошкент ш., Мирзо Улуғбек кўч., 83. Тел.: (99871) 262 35 40,
факс: (99871) 262 70 63).
Докторлик диссертацияси билан Биоорганик кимё институти Ахборот-ресурс
марказида танишиш мумкин (100125, Тошкент ш., Мирзо Улуғбек кўч., 83. Тел.: (99871)
262 35 40, факс: (99871) 262 70 63), e-mail: asrarov54@mail.ru).
Диссертация автореферати 2016 йил «___» ноябрда тарқатилди.
(2016 йил «____» ______________ даги № _____ рақамли реестр баённомаси).
А.С. Тураев
Фан доктори илмий даражасини берувчи бир
марталик Илмий кенгаш раиси, к.ф.д., профессор
М.И. Асраров
Фан доктори илмий даражасини берувчи бир
марталик Илмий кенгаш илмий котиби,б.ф.д., профессор
Р.З.Сабиров
Фан доктори илмий даражасини берувчи бир
марталик Илмий кенгаш ҳузуридаги бир
марталик илмий семинар раиси, б.ф.д., профессор
4
КИРИШ (Докторлик диссертациясининг аннотацияси)
Диссертация мавзусининг долзарблиги ва зарурати
. Бугунги кунда
дунёда онкологик касалликлар профилактикаси ва даволаш долзарб
бўлганлиги сабабли ўсимлик ва ҳайвон хом ашёсидан олинадиган табиатан
биологик бўлган янги доривор воситалар яратилмоқда. Жаҳон соғлиқни
сақлаш ташкилоти статистик маълумотларига кўра онкологик касалликлар
билан касалланиш яқин 20 йилда ўртача икки баробарга кўпаяди
1
.
Республикамиз мустақилликка эришгандан буён маҳаллий ўсимликлар
хомашёси асосида онокологик касалликлар терапиясида қўлланиладиган
юқори самарали препаратлар яратиш ва аҳолини сифатли дори воситалари
билан таъминлаш йўналишларида кенг қамровли чора-тадбирлар амалга
оширилди ва муайян натижалар қўлга киритилди. Саратон касаллигини
профилактика қилиш, хавфли ўсмаларни эрта аниқлаш ва ўсмага қарши янги
доривор воситаларни яратиш бўйича изланишларни алоҳида таъкидлаш
мумкин.
Бугунги
кунда
дунёда
ўсма
касалликлари
этиологияси ва
патогенезининг механизмларини аниқлаш, ўсмага қарши қўлланиладиган
кимёвий ва нурли терапиядан келиб чиқадиган оғир оқибатларни бартараф
этувчи янги препаратларни ишлаб чиқиш масаласи долзарб бўлиб қолмоқда.
Биологик фаол бирикмалар асосида онкологик патологияларни профилактика
қилиш ва даволаш учун янги дори воситаларини яратиш, ўсмага қарши фаол
бирикмаларнинг таъсир механизмларини исботлаш, антиметастатик самара
берувчи оқсил табиатли препаратларни ишлаб чиқиш, ўсмага қарши
таъсирни кучайтирадиган ҳамда апоптозни чақирувчи омилларни аниқлаш,
эндоген
ҳимоя
механизмларини
фаоллаштирадиган
ва
даволаш
натижаларини яхшилайдиган ўсмага қарши табиий препаратларни ишлаб
чиқиш кабилар долзарб масалалалардан ҳисобланади.
Ўзбекистон Республикаси Президентининг 2011 йил 28 ноябрдаги
ПҚ-1652-сон «Соғлиқни сақлаш тизимини ислоҳ қилишни янада
чуқурлаштириш чоралари тўғрисида» Қарори ва Ўзбекистон Республикаси
Вазирлар Маҳкамасининг 2012 йил 29 мартдаги 91-сон «Тиббиёт
муассасаларининг моддий-техника базасини янада мустаҳкамлаш ва
фаолиятини ташкил этишни такомиллаштириш чора-тадбирлари
тўғрисида»ги қарори ҳамда мазкур фаолиятга тегишли бошқа меъёрий
ҳуқуқий ҳужжатларда белгиланган вазифаларни амалга оширишга ушбу
диссертация тадқиқоти муайян даражада хизмат қилади.
Тадқиқотнинг республика фан ва технологиялари ривожлани
шининг устувор йўналишларига боғлиқлиги
.
Мазкур тадқиқот республика
фан ва технологиялари ривожланишининг VI. «Тиббиёт ва фармакология
»
устувор йўналишига мувофиқ бажарилган.
Диссертация мавзуси бўйича ҳорижий илмий-тадқиқотлар шарҳи
.
2
_____________
1
http://www.cancer.org/downloads/STT
5
Онкологик касалликларни даволашда оқсил ва пептидлар асосидаги
биологик препаратларни яратишга йўналтирилган илмий изланишлар
жаҳоннинг етакчи илмий марказлари ва олий таълим
муассасалари,жумладан, Саратон Миллий институти (АҚШ), Андонг миллий
университети (Корея), Москва давлат университети, Физик-кимёвий тиббиёт
илмий-тадқиқот институти, Республика онкология илмий маркази (Россия),
Онкология институти (Украина), Онкология илмий-тадқиқот маркази
(Грузия), шунингдек, Ўсимлик моддалари кимёси институти ҳамда
Биоорганик кимё институтида (Ўзбекистон) амалга оширилади.
Онкологик касалликларни даволашда ўсимликлар моддалари асосидаги
биологик препаратларни яратишга оид жаҳонда олиб борилган тадқиқотлар
натижасида қатор, жумладан, қуйидаги илмий натижалар олинган: соя ва
баъзи бошоқли экинлар донидан хавфли ўсмага қарши луназид пептиди,
метастазлар профилактикаси учун Бауман-Бирк протеазалар ингибитори
ажратилган (Саратон Миллий институти, АҚШ);
Polgonatum varticillatum
тоғ
купенаси ўсимлиги асосида антиканцероген хоссали Immucor GA-40
иммуномодулятор ишлаб чиқилган (Онкология илмий-тадқиқот маркази,
Грузия); антиканцероген хоссага эга бўлган «Инсол» биологик фаол қўшимча
яратилган (Москва давлат университети, Россия); ўсма ҳужайралари
ўсишини ингибирлаш хоссасига эга бир қатор биологик фаол бирикмалар ва
экстрактларнинг янги фармакологик фаолликлари аниқланган (Ўсимлик
моддалари кимёси институти, Ўзбекистон);
Testudo horsfieldi
тошбақа
қонидаги нейтрал олигопептидлар йиғиндисидан бўлган, радио- ҳамда
кимётерапия полифункционал таъсирга эга иммунокорректор Тортезин
препарати ишлаб чиқилган (Биоорганик кимё институти, Ўзбекистон).
Дунёда саратон касаллиги билан оғриган беморларни даволашда
қўлланиладиган дори воситаларини яратиш бўйича қатор, жумладан,
қуйидаги устувор йўналишларда тадқиқотлар олиб борилмоқда: кимё- ва
радиотерапиядан
юзага
келадиган
иммунологик
ва
гематологик
бузилишларни коррекцияловчи воситалар ишлаб чиқиш; оғир оператив
аралашувдан кейин қўлланиладиган иммунокорректорларни яратиш;
ўсманинг
иммунодепрессив
таъсири
оқибатида
юзага
келадиган
иммунологик
бузилишларни
коррекциялаш;
ўсмага
қарши
фаол
бирикмаларнинг молекуляр ва ҳужайра даражасида таъсир механизмларини
аниқлаш; антиметастатик самара берувчи, оқсил табиатли препаратларни
ишлаб чиқиш.
Муаммонинг ўрганилганлик даражаси.
Онкологиянинг энг янги
йўналишларидан бири саратонни биопрепаратлар - ўсма ҳужайраларини
нобуд қиладиган ва соғлом тўқималар, шунингдек, бутун организмга зарарли
_________________
2
Диссертациянинг мавзуси бўйича хорижий илмий-тадқиқотлар шарҳи http://www.lib.uiowa.edu
/harding/md/ej.html; http://www.cancer.gov/search/cancer_literature/;http://www.scirp.org/journal/jct
ва бошқа манбалар асосида ишлаб чиқилган.
6
таъсир кўрсатмайдиган ноёб воситалар билан даволаш ҳисобланади. Ушбу
йўналишда хорижий олимлар Nagase H., Medawar P.B., Xiao C.W., Rheinwald
J., Green Н., Jackman K.A. томонидан саратон касаллигини замонавий
диагностика усуллари ишлаб чиқилган ва даволаш учун янги биологик
доривор воситалар яратилган. Соя оқсилидаги лецитиннинг юқори даражаси
қондаги қанд миқдорининг пасайишига, қон томирлари деворининг
атеросклеротик тиқилмалардан тозалашга, алмашинув жараёнларининг
яхшиланишига ёрдам бериши аниқланган. Соядан ажратиб олинадиган
протеазаларнинг ингибиторлари одам ҳужайраларининг рентген нурлари
таъсирида саратон ҳужайраларига ўзгариши эҳтимоллигини 5-10 мартага
пасайтирган [Jackman, 2007].
МДҲ давлатларида онкологик касалликларни ўсимликлар асосидаги
доривор воситалар билан даволаш бўйича тадқиқотларни Крутяков В.М.,
Казачкина Н.И., Корсун Е.В., Тимошенко А.В., Кадагидзе З.Г., Немцова Е.Р.
олиб бормоқдалар. Маълум бўлишича, ингибиторлар жигар, ўпка, ошқозон,
ҳиқилдоқ, сичқонлар, каламушлар, хомяклар бриктирувчи тўқимасининг
турли ўсма касалликларида (аденокарцинома, ангиосаркома, меланома ва
бошқалар.) ёрдам беради. Тоза ва қисман тозаланган протеаза ингибиторлари
бир хилда таъсир кўрсатади, ушбу хосса препаратлар таннархини
камайтириш имконини берган [Крутяков, 2001].
Ўзбекистонда онкологик касалликларни ўсимликлар асосидаги доривор
воситалар билан даволаш тадқиқотлари билан профессорлар Еникеева З.М.,
Юлдашев А.Х. шуғулланадилар, улар томонидан ўсмага қарши бирикмалар
колхицин ҳосилалари, винкристин и винбластин ажратиб олинган. Соядан
оқсил комплексининг стандартлаштирилган комплексини олиш ва олинган
препаратнинг
in vitro
ва
in vivo
шароитида биологик ва ўсмага қарши
фаоллигини аниқлаш, шунингдек, унинг фармакология ва токсикологияси
йўналишида тадқиқотларни амалга ошириш долзарб, илмий-амалий
аҳамиятга эга ҳисобланади.
Диссертация мавзусининг диссертация бажарилган илмий–
тадқиқот муассасининг илмий-тадқиқот ишлари билан боғлиқлиги.
Диссертация тадқиқоти Биоорганик кимё институтининг илмий-тадқиқот
ишлари режасининг ФА-А11-Т174 «Соя кунжарасидан ўсмага қарши оқсил
препарати ва маҳаллий хом ашёдан тоза ферментларни ажратиб олишни
ишлаб чиқиш» (2009-2011 йй.), Украина илмий-техника марказининг 3501-
рақамли «Соя оқсилини организм ҳужайрасининг хавфли янги ҳосилаларини
даволашда тадқиқоти» (2006-2009 йй.) мавзуидаги лойиҳалар доирасида
бажарилган.
Тадқиқотнинг мақсади
соядан оқсил комплекси ажратиш, унинг
физик-кимёвий, фармако-токсикологик тавсифлари, саратонга қарши
фаоллигини ўсманинг ҳар хил турларида
in vivo
, биопсия материалида кўкрак
бези, эндометрия ва йўғон ичак саратонини
in vitro
аниқлашдан иборат.
7
Тадқиқотнинг вазифалари:
соядан оқсил комплексини ажратиб олиш усулини ишлаб чиқиш;
оқсиллар комплексини ажратиш ва физик-кимёвий тавсифлаш;
оқсил комплексининг протеаза фаоллигини аниқлаш;
тадқиқот моделларида
in vivo
экспериментларида моно- ва комплекс
терапияда биологик активлигини аниқлаш;
оқсиллар комплексининг
in vitro
экспериментларида анъанавий
терапияга резистент бўлган кўкрак бези, эндометрия ва йўғон ичак саратони
ҳужайраларида ўсмага қарши фаоллигини аниқлаш;
препарат субстанцияси ва дори шаклининг фармако-токсикологияси
бўйича клиникагача бўлган тадқиқотлар олиб бориш;
«Биокор-0,2г» препаратининг дори шаклини ишлаб чиқиш.
Тадқиқотнинг объекти
сифатида «Генетик-1» соя навидан (
Glycine max (L.)
Mtrr.
) олинган оқсиллар комплекси, онкологик касалликлар, йўғон ичак
саратони, АКАТОЛ, АКАТОН, Меланома В-16 ва Саркома 180 каби
пайвандланган ўсма штаммлари олинган.
Тадқиқотнинг предмети
оқсиллар комплексининг
(
«Биокор-0,2г»
препарати субстанцияси) физик-кимёвий ва ўсмага қарши хоссалари, унинг
АКАТОЛ, АКАТОН, Меланома В-16 ва Саркома 180 каби пайвандланган
ўсма штаммларида, резистент бўлган эндометрия саратони, йўғон ичак
саратони хавфли трансформациянинг барча босқичларида
in vitro
пролиферациясини ингибирлаши, фармако-токсикологиясини тавсифлашдан
иборат.
Тадқиқотнинг усуллари.
Диссертация ишида колонкали
хроматография, электрофорез тадқиқот усуллари, оқсилнинг аминокислота
таркибини аниқлаш, иммуногистокимёвий таҳлил, микроскопия, масс
спектрометрия, иммунофермент таҳлили ва фармакологик ҳамда
токсикологик усуллардан фойдаланилган.
Тадқиқотнинг илмий янгилиги
қуйидагилардан иборат:
соядан оқсил комплекси ажратиб олинган ва унинг физик-кимёвий,
фармакологик ҳамда токсикологик хоссалари аниқланган;
оқсил 12,7-79,0 кДа молекуляр массага эга полипептидлар
комплексидан таркиб топганлиги,pI -4,1; 4,2; 4,5 ва 4,7 лардаги изоэлектрик
нуқтага эгалиги исботланган;
масс-спектрометрия усули билан оқсил комплексида протеазалар
Кунитц ингибитори аниқланган;
оқсил комплексининг
in vitro
ва
in vivo
шароитларида хафвли ўсмага,
шамоллашга қарши фаоллиги ҳамда иммунмодулловчи ва антиканцероген
хоссалари аниқланган;
соя дуккакларидан олинган полипептидлар комплекси асосида
«Биокор-0,2г» препарати яратилган ва унинг таблетка кўринишидаги дори
шакли ишлаб чиқилган.
Тадқиқотнинг амалий натижаси
қуйидагилардан иборат:
8
клиникагача бўлган фармакологик ва токсикологик тадқиқотлар олиб
борилган ва уларга кўра, «Биокор-0,2г» препарати заҳарсиз бирикмаларнинг
V синфига кираиши ҳамда кумулятив хоссаларга эга эмаслиги аниқланган.
Тадқиқот
натижаларининг
ишончлилиги
экспериментал
маълумотлар замонавий юқори аниқликка эга бўлган тадқиқот усулларини
қўллашда олинганлиги, натижаларнинг амалиётга кўлланилиши ҳамда
хулосалар замонавий математик статистикадан фойдаланилган ҳолда ишлаб
чиқилгани билан изоҳланади.
Тадқиқот натижаларининг илмий ва амалий аҳамияти.
Тадқиқот
натижаларининг илмий аҳамияти соя дуккакларидан оқсил комплексининг
ажратилиши бўлиб, бу республикада янги илмий йўналишга асос бўлган.
Экспериментал
ҳайвонлар
организмига
«Биокор-0,2г»
препарати
таъсирининг
механизми
аниқланган,
бу
эса
хавфли
ўсмалар
ривожланишининг этиологияси ва хусусиятлари тўғрисида янги маълумотлар
олиш билан изоҳланади.
Тадқиқотнинг амалий аҳамияти соядан олинган оқсил комплекси
асосида «Биокор-0,2г» - онкологик касалликларни комплекс даволаш учун
таблетка кўринишидаги препаратнинг дори шакли яратилгани, препарат
даволашнинг бошқа турлари (кимёвий- ва нурли терапия) заҳарли таъсирини
камайтиргани, иммун тизимини нормаллаштиргани, қоннинг гематологик ва
морфологик кўрсаткичларини яхшилагани ва метастазларнинг олдини олиши
билан изоҳланади.
Тадқиқот натижаларининг жорий қилиниши.
Маҳаллий ўсимлик
хомашёси асосида саратонга қарши дори воситаларини яратиш бўйича
олинган илмий натижалар асосида:
соя кунжарасидан саратонга қарши фаолликка эга оқсил ва уни
ажратиш
усулига
Ўзбекистон
Республикаси
Интеллектуал
мулк
агентлигининг ихтирога патенти олинган (IAP 04501, 2012). Илмий тадқиқот
натижасида онкологик касалликларни даволаш учун «Биокор-0,2г» таблетка
дори шакли ишлаб чиқиш имконини берди;
соядан ажратилган ўсмага қарши фаолликка эга оқсил комлекси бўйича
натижалар
EMBL
маълумотлар
базасида
рўйхатдан
ўтказилган
(http://www.ebi.ac.uk).
«Биокор-0,2г» препарати АКАТОЛ, АКАТОН,
меланома В-16 ва Саркома 180 каби пайвандланган ўсма штаммларида
ўсмага қарши фаоллик намоён қилган ва саратон тўқимасининг ўсишини
секинлаштирган. «Биокор-0,2г» препарати 5-фторурацил берилган ўсма
ташувчи ҳайвонлар иммун тизимининг қайта тикланишига ёрдам бериши,
ўсмага қарши препаратларнинг даволовчи таъсирини яхшилаши ва ўсма
ташувчи ҳайвонлар иммунитетини ошириши тасдиқланган. Тадқиқот
натижалари ўсимлик оқсиллари асосида онкологик касалликларни даволашда
янги йўналишга ва самарали доривор воситалар яратиш имконини беради.
Тадқиқот натижаларининг апробацияси
. Мавзу бўйича Тадқиқот
натижалари 23 та республика ва халқаро илмий-амалий анжуманларда,
9
жумладан, Закавказье давлатлари онкологларининг III конгресси (Ереван,
2004 «Врачларни дипломдан кейинги тайёрлашнинг долзарб муаммолари ва
тиббиётнинг янги уфқлари» конференцияси (Тошкент, 2007); XI Россия
онкология конгресси (Москва, 2007 й); «Физик-кимёвий биология ва
биотехнология истиқболлари» илмий-амалий конференция материаллари
(Андижон, 2007); МДҲ онкологлари ва радиологларининг V-съезди (Тошкент,
2008); «Табиий бирикмалар кимёсининг долзарб муаммолари» (Тошкент,
2009, 2010, 2011, 2012), «Биотехнология – ҳолати ва ривожланиш
истиқболлари» Халқаро конгресси (Москва, 2009); «Биологик фаол
моддалар: олиш ва қўллашнинг фундаментал ва амалий масалалари» илмий
амалий анжумани (Украина, 2009, 2011); «Ҳозирги замон онкологияси:
ютуқлар ва ривожланиш истиқболлари» Россия илмий-амалий анжумани
(Томск, 2009); Фундаментал онкология бўйича 6-Россия анжумани (Санкт
Петербург, 2010), 14-, 15-Халқаро Пущино мактаби – ёш олимлар анжумани
«Биология – XXI аср фани» (Москва, 2010 й, 2011); «Биоорганик кимё
ривожланишининг долзарб муаммолари» (Ташкент, 2010) конференцияси; X,
XI «Ўсмага қарши маҳаллий препаратлар» Бутунроссия илмий-амалий
анжумани (Москва, 2011й., 2012); «Фундаментал онкология – Петров
ўқишлари» еттинчи конференцияси (Санкт-Петербург, 2011); Ўзбекистон
онкологлари II Конгресси (Тошкент, 2011.); «Петров ўқишлари» 8-
конференцияси (Москва, 2012); Беларусь-Россия «Ўсмага қарши маҳаллий
препаратлар» (Минск, 2013) мавзуларидаги республика ва халқаро илмий
амалий конференцияларда маъруза кўринишида баён этилган ҳамда
апробациядан ўтказилган.
Тадқиқот натижаларининг эълон қилиниши.
Диссертация мавзуси
бўйича жами 48 та илмий иши чоп этилган, улардан 13 та илмий мақола,
жумладан, 9 таси маҳаллий ва 4 таси Ўзбекистон Республикаси Олий
аттестация комиссияси томонидан докторлик диссертациялари асосий илмий
натижаларини чоп этишга тавсия этилган чет эл илмий журналларида нашр
этилган, ихтирога патент олинган.
Диссертациянинг ҳажми ва тузилиши.
Диссертациянинг тузилиши
кириш, бешта боб, хулоса, адабиётлар рўйхатидан иборат. Диссертациянинг
ҳажми 195 бетни ташкил этган.
ДИССЕРТАЦИЯНИНГ АСОСИЙ МАЗМУНИ
Кириш
қисмида ўтказилган тадқиқотларнинг долзарблиги ва зарурати
асосланган, тадқиқотнинг мақсади ва вазифалари, объект ва предметлари
тавсифланган, республика фан ва технологиялари ривожланишининг устувор
йўналишларига мослиги кўрсатилган, тадқиқотнинг илмий янгилиги ва
амалий натижалари баён қилинган, олинган натижаларнинг илмий ва амалий
аҳамияти очиб берилган, тадқиқот натижаларини амалиётга жорий қилиш,
нашр этилган ишлар ва диссертация тузилиши бўйича маълумотлар
келтирилган.
10
Диссертациянинг «
Соя дуккаклари: тавсифи ва турли касалликлар
профилактикаси ҳамда даволашдаги аҳамияти»
деб номланган биринчи
бобида ўсмалар биотерапиясидаги оқсиллар ва пептидлар тадқиқоти,
онкологик беморларни даволашда иммуномодуляторларни қўллаш, турли
касалликлар терапиясида соя ҳосилалари асосидаги дори воситаларига
бағишланган батафсил адабиётлар шарҳи берилган.
Диссертациянинг
«Биокор препарати оқсил комплекси тадқиқоти
материали, шароити ва усуллари»
деб номланган иккинчи бобида соя
дуккакларидан оқсил комплексини ажратиш усули батафсил берилган,
электрофорез,
радиометрия,
масс-спектрометрия,
иммунология,
экспериментал ўсма штаммларида оқсил препаратининг биологик
фаоллигини аниқлаш, фармакология ва токсикология, шунингдек, гистология
усуллари баён этилган.
Диссертациянинг
«Оқсил комплексининг физик-кимёвий тавсифи
ва унинг биологик фаоллиги»
деб номланган учинчи бобида Биокор
препаратининг
физик-кимёвий
тавсифи
ва
экспериментал
ўсма
штаммларидаги биологик фаоллигининг тадқиқоти натижалари келтирилган.
Оқсиллар хроматографияси ва оқсилларнинг физик-кимёвий тавсифи.
Ҳозирда дунёда соя ва таркибий қисмининг канцерогенезга таъсирини
аниқлаш бўйича кўпгина тадқиқотлар олиб борилмоқда [Крутяков, 2001;
Немцова ва бошқ., 2002]. Ўтказилган тадқиқотларга кўра, соянинг таркибий
қисми ўсма ҳужайралари пролиферациясини ингибирлаш,
трансформацияланган ҳужайраларда апоптозни чақириш хусусиятига эга
бўлиб, ўсма ҳужайларига таъсири натижасида организм нормал
тўқималарига нисбатан заҳарлилиги кам даражада бўлади [Залеток ва бошқ.,
2006; Казачкина ва бошқ., 2006]. Шунга кўра, соядан оқсил комплексини,
унинг ўсмага қарши фаоллигининг тадқиқоти учун ажратиш долзарб
ҳисобланади. Соя дуккакларидан оқсиллар натрий хлорнинг 0,06М эритмаси
ва pH 7,4 бўлган 0,05М Трис буфери билан экстрация қилишнинг икки хил
усули билан ажратилди.
Оқсиллар ўсмага қарши фаоллигини тестдан ўтказиш учун КМЛ –
сичқонлар меланома штамми В-16 [Кузнецова ва бошқ., 2005] in vitro
сичқонлар меланомаси ҳужайра линиясида ўсмага қарши моддаларни танлаш
тест-тизими модели қўлланилди. Гельфильтрация учун самарали ажратиш
имконини берувчи G-75 ва G-50 сефадекслари-ташувчилар танлаб олинди
[Остерман, 1983]. Оқсиллар гельфильтрация хроматограммаси 1 ва 2
расмларда келтирилган.
11
D
2
80
2,5
2
1
2
1,5
1
0,5
3
0
0 200 400 600 800 1000 1200
Объем элюции, мл
Элюция ҳажми, мл
1.4
D
2
80
1.2
1
0.8
0.6
1-расм.Соя оқсилининг G
75сефадексли (80 x 2,6),
0,05М Трис -HCl буфер pH
7,4 колонкасидаги
гельфильтрацияси
2-расм. Соя оқсилининг G
50 сефадексли (80 x 2,6),
0,05М Трис -HCl буфер pH
7,4 колонкасидаги
0.4 0.2 0
1
2
3
гельфильтрацияси
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
-0.2
Объем элюции
Элюция ҳажми, мл
Иккала ташувчида учтадан фракция элюирланган.
14
С-тимидин
киритмаси бўйича фракциялар фаоллигини аниқлаш 100 мкг/мл дозадаги
64,0±1,9% ли G-75 сефадексли колонкадаги гельфильтрациядан сўнг биринчи
фракциянинг катта фаолликка эга эканлигини кўрсатди. Гельфильтрациядан
сўнг ўтказилган оқсил фракцияларининг электрофорез тадқиқотлари G-75
сефадексдаги оқсиллар ажралиши энг самарали эканлигини кўрсатди.
Биринчи фракциянинг таркибий қисми 12,7, 13,0, 15,0, 67,0, 79,0 кДа
молекула массали аниқ кўринишга эга бўлган полипептидлардан иборат. G 50
сефадексли колонкада ўтказилган гельфильтрацияда оқсиллар ажралиши
самарасиз бўлди, учта фракцияда ҳам оқсиллар спектри бир хилда бўлди.
Сўнгра оқсил фаол фракциясининг изоэлектрофокусланиши ўтказилди.
pI -4,1, 4,2, 4,5 ва 4,7 қисмларда тўртта изонуқта мавжудлиги кузатилди (3-
расм).
1 2I/M _
9,45
3.расм.G-75 колонкасидаги
гельфильтрациядан сўнг оқсил фаол
фракциясининг
изоэлекторофокусланиши
4,7
4,5
4,2
4,1
+
pH 3,5-10диапазонидаги амфолинлар
1- I Фракция
2-изофокусланиш белгилари.
3,50
12
Лаборатория
намуналарининг
бешта
сериясида
ҳам
стандартлаштирилган оқсилнинг фаол фракциясига Биокор препарати номи
берилди. (4-расм).
кДа_ 1 2 3 4 5 6 _
4-расм. Биокор субстанциясининг ДСН
67,0
25,0
12,5
+
иштирокидаги 10% ПААГдаги
электрофорези:
1-маркер-оқсиллар аралашмаси (БСА-67
кДа, Химотрипсиноген-25 кДа, Цитохром
С-12,5кДа), 2–РСО, 3-7 – препарат тажриба
намуналарининг бешта серияси.
Фаол оқсил фракциясининг аминокислота таркиби аниқланди (1-жадвал).
1-жадвал
.
Фаол оқсил фракциясининг аминокислота таркиби
Аминокислоталар
Фоизли таркиби
Аминокислоталар
Фоизли таркиби
Ala
5,30
Leu
9,04
Arg
10,08
Lys
4,90
Asp
11,09
Met
1,40
Val
5,06
Pro
5,19
His
3,57
Ser
4,85
Glu
16,03
Tyr
3,09
Gly
4,05
Thr
4,90
Ile
3,01
Phe
4,05
Σ 95,99%
Биокор препаратининг антитрипсин фаоллигини аниқлаш.
Ўсма ўсишида, фаол марказида серин (трипсин, химотрипсин,
калликреин, плазмин, тромбин) тутувчи серинли протеазалар ва фаол
марказида Zn
2+
тутувчи металлопротеиназалар муҳим аҳамиятга эга [Nagase et
al, 1994]. Шунга кўра, Биокор препаратининг антитрипсин фаоллигини
аниқлаш бўйича тажриба ўтказилди (2-расм). Жадвалда келтирилган
маълумотларда Биокорнинг 24,1±0,1дан 34,7±0,1гача серин протеазаларига
нисбатан юқори ингибирлаш фаоллигига эга эканлигини кўриш мумкин, бу
эса препаратнинг ўсмага қарши хусусиятлари мавжудлигини тахмин қилиш
имконини беради.
13
2-жадвал.
Серинли протеазалар протеаза фаоллигининг Биокор томонидан
ингибирланиши
Серинли протеазалар
Серинли протеазалар фаоллигининг ингибирланиши
Протеолитик фаолликнинг
шартли бирликлари, ютилиши λ
280
ингибирланиш%
Трипсин
0,145±0,002
34,7±0,1
Химотрипсин
0,156±0,003
29,4±0,2
Плазмин.
0,167±0,002
24,1±0,1
Назорат*
0,220±0,002
0
* pH 7,6 ли 0,05М фосфат буферида протеазалар 3,0 мкгни ташкил этади; субстрати -
казеин 300,0 мкг, (
*
- p<0,05).
Биокор препарати субстанцияси пептидларининг масс-спектрометрия
таҳлили
Икки ўлчамли гель-электрофорези ва масс-спектрометрия усули билан
биргаликда Биокор препарати таркибига кирувчи оқсиллар аниқланди.
Препарат таркибида протеазалар ингибитори – Kunitz trypsin protease inhibitor
нинг мавжудлиги тасдиқланди. Маълумотлар 3-жадвалда келтирилган.
3-жадвал
Биокор препаратининг масс-спектрометрия таҳлили
Идентификацияланган
оқсиллар
ID
Mr(Da)
Score
Sequence
Coverag %
Kunitz trypsin protease inhibitor
Glycin emax
22676,1
339,17
50
Beta- conglycinin alpha subunit
Glycin emax
72475,7
375,39
43
Beta-amylase
Glycin emax
57000,0
205,59
52
2,4-D inducible glutathione
S transferase
Glycin emax
49000,0
78,66
23
PR10-like protein
Glycin emax
3865,99
55,42
29
24 kDa protein SC24
Glycin emax
24569,7
52,27
17
Илова: ID –NCBI базаси маълумотларига мос оқсиллар номланишининг аббревиатураси;
Mr – оқсилларнинг молекула массаси; Score-10xlgP, бунда Р – масс спектр маълумотлари
базасидан қиёсланган оқсилнинг мос келмаганлиги эҳтимоллиги.
Экспериментал
канцерогенезда
йўғон
ичак
аденокарциномаси
(АКАТОЛ), ингичка ичак аденокарциномаси (АКАТОН), меланома В-16 ва
саркома
180
кўчириб
ўтказилган
ўсма
штаммларида
Биокор
субстанциясининг ўсмага қарши фаоллигининг тадқиқоти. Ўсма ўсишини
оғирлик ва ҳажм бўйича секинлаштириш.
Биокорни киритиш дозалари йўғон ичак аденокарциномаси (АКАТОЛ)
штаммида ишлаб чиқилди.
Экспериментал ҳайвонлар 4та тажриба гуруҳларига бўлинди: I гуруҳ –
ҳайвонларга 10 кун давомида бир мартадан 125 мг/кг дозадаги Биокор peros
киритилди; II гуруҳ – ҳайвонларга 10 кун давомида бир мартадан 150 мг/кг
дозадаги Биокор peros киритилди; III гуруҳ - ҳайвонларга 10 кун давомида
бир мартадан 250 мг/кг дозадаги Биокор peros киритилди; IV назорат гуруҳи
14
– ҳайвонларга 10 кун давомида бир мартадан NaCl физиологик эритма peros
киритилди.
150 мг/кг дозадаги Биокор билан perosни қўллаш катта самарадорликни
кўрсатди ва АКАТОЛ ўсма ўсишини оғирлиги бўйича 71,9% га
ингибирлаган, таъсир дозаси 125 мг/кг гача камайтирилганида, ўсма
ўсишининг ингибирланиши оғирлиги бўйича 57,68% гача камайган.
Киритилиш дозаси 250 мг/кг гача оширилганда, ингибирланишнинг ўсма
оғирлиги бўйича ошишига олиб келмади ва 69,8% ни ташкил этди.
Биокор киритилган ҳайвонлар тажриба гуруҳларида ўсма ҳажмининг
сезиларли даражада ишончли камайиши кузатилади, буни протеиннинг
инейтрофил инвазия экссудацияси жараёнларига ижобий таъсири билан
тушунтириш мумкин. Энг сезиларли ўсмага қарши самара II ва III гуруҳ
ҳайвонларида кузатилади - 88,46%. I гуруҳда ўсма тўқимаси ҳажми
ўсишининг ингибирланиши 61,4% ни ташкил этди.
Олинган натижалар, Биокорнинг оптимал киритилиш дозаси 150 мг/кг
эканлигини кўрсатди.
Биокор таъсирини аниқлаш бўйича кейинги тадқиқотлар ингичка ичак
аденокарциномаси (АКАТОН), меланома В-16 ва саркома 180 штаммларида
ўтказилди.
5-расм. Турли штаммларда 150
мг/кг дозадаги субстанция
киритилгандан сўнг тажриба
якунида экспериментал
ҳайвонлар ўсмаси оғирлиги ва
ҳажмининг ўзгариши
(* - p<0,05).
5-расмда тўртта штаммнинг барчасида ўсма ўсишининг секинлашиши
натижалари келтирилган.
Биокор субстанцияси монотерапияда ўрганилаётган ўсмалар ўсишини
оғирлиги ва ҳажми жиҳатидан 70%га секинлаштиради.
Биокор киритилгандан сўнг ўсма тўқимасида митотик ва апоптотик
индексларни ҳисоблаш.
Ўсма оғирлиги ва ҳажмини ифодаловчи ўлчовлар ҳар доимҳам ўсма
тўқимасида кечаётган прогрессия ва регресия жараёнларини етарлича акс
эттира олмайди. Ўсма ҳужайраларининг пролифератив фаоллиги тўғрисида
холисона баҳони ўсма тўқимасидаги митозлар сонини ҳисоблаш – унинг
митотик индекси (МИ) бериши мумкин. Ўсма ҳужайраларининг нобуд бўлиш
жараёнларини акс эттирувчи кўрсаткич апоптотик индекс (АИ) ҳисобланади.
Апоптотик индекснинг (АИ) митотик индексга (МИ) нисбати (АИ/МИ)
ўсма тўқимасидаги регрессия ёки прогрессия даражасини кўрсатади. АИ/МИ
нисбати бирдан катта бўлса, ўсма регрессияси кузатилади.
15
АКАТОЛ штаммидаги тажриба гуруҳида ўсма тўқимасининг юқори
регрессияси кузатилди. АИ/МИ нисбати тажрибада - 2,08, назорат гуруҳида
эса –0,89ни ташкил этди. Меланома В-16 штаммида АИ/МИ нисбати
тажрибада -15,18, назорат гуруҳида – 0,74ни ташкил этди. АКАТОН
штаммида АИ/МИ нисбати тажрибада - 1,75, назорат гуруҳида – 0,81ни
ташкил этди. Саркома 180 штаммида эса АИ/МИ нисбати тажрибада - 3,6,
назорат гуруҳида – 0,86ни ташкил этди.
Берилган натижаларга кўра, барча тажриба гуруҳларида ўсма
тўқимасининг ишончли регрессияси кузатилади, яъни апоптозга учраган
ҳужайралар сони митоз йўли билан кўпайган саратон ҳужайралари сонидан
кўп бўлади, экспериментал ҳайвонлар назорат гуруҳида эса АИ/МИ нисбати
1,0 дан кам бўлади.
Биокорнинг экспериментал канцерогенез шароитидақизил илик
ҳужайраларига ингибирловчи таъсирининг тадқиқоти.
Ўсма ҳужайраларига нисбатан цитотоксик самарага эга бўлган исталган
терапевтик модданинг қўлланилиши, организмнинг юқори пролиферацияли
нормал
ҳужайраларида
пролиферацияни
камайтириши
мумкин.
Препаратларнинг бундай таъсирига биринчи навбатдаги нишонлардан бири
қизил илик кўмиги ҳужайраларидир, улардаги пролиферациянинг бузилиши
гемопоэз жараёнлари ва иммун тизимининг самарали фаолиятида жиддий
негатив оқибатларга олиб келади [Васильев, 1997].
Илик кўмиги ҳужайраларининг пролифератив фаоллигини аниқлаш учун
Фитцжералъд бўйича хромосома таҳлили учун ҳужайраларни соатли
культуралаш тўғри усули қўлланилди. Биокорнинг ўсмага қарши
хоссаларининг тадқиқотида экспериментал канцерогенез шароитида
АКАТОЛ, АКАТОН, Меланома В-16 ва Саркома 180 ўсма моделларида бу
оқсилнинг қизил илик ҳужайралари пролиферациясига ингибирловчи
таъсири аниқланли. 6-расмда экспериментал ҳайвонлар қизил илигида МИни
ҳисоблаш натижалари келтирилган. Маълумотлар диаграммасига кўра,
Биокор қизил илик ҳужайралари пролиферациясини ингибирламаган.
6-расм. Ўсма имплантация
қилинган экспериментал
ҳайвонлар қизил илиги
ҳужайраларининг сояли
биокорни киритгандан сўнг
эксперимент якунидаги
митотик индекси (МИ)
(* - p<0,05).
16
Биокор препаратининг Саркома 180 ўсма экспериментал модели бўлган
сичқонлар қони гематологик кўрсаткичлари ва морфологик манзарасига
таъсири.
Тадқиқот сичқонлар қонида ўтказилди. Ҳайвонлар қуйидаги гуруҳларга
ажратилди: интакт ҳайвонлар, назорат гуруҳи (имплантация қилинган ўсма
модели) ва 150 мг/кг дозадаги peros препарати берилган ҳайвонлар гуруҳи.
Препаратни киритиш ўсма кўчириб ўтказилгандан сўнг 10-куни бошланди ва
ҳар куни 10 кун давомида давом эттирилди.
Шунингдек, қоннинг гематологик ва морфологик кўрсаткичларининг
(лейкоцитлар
фоиз
кўрсаткичининг
нормаллашуви,
гранулоцитлар,
гемоглобин
даражасининг
ва
эритроцитлар
сонининг
ошиши)
яхшиланганлиги ҳам кузатилади.
4-жадвал
Биокор препаратининг Саркома 180 ўсма экспериментал модели бўлган
сичқонлар қони гематологик кўрсаткичлари ва морфологиясига
таъсири.
Тадқиқотнинг номи
Ҳайвонлар гуруҳи
Интакт гуруҳ
Назорат гуруҳи
Даволанганлар
Лейкоцитлар
7,95±0,61
20,4±3,64*
11,2±2,48**
Лимфоцитлар
5,1±0,16
3,5±0,46*
4,0±0,15
Ўрта ўлчамли ҳужайралар
1,45±0,12
1,7±0,5
1,2±0,1
Гранулоцитлар
1,9±0,08
3,03±0,2*
2,97±0,26*
Лимфоцитлар фоизи
57,0±2,45
38,3±0,66*
45,3±1,2**
Ўрта ўлчамли ҳужайралар, %
17,6±1,06
14,2±1,09
13,1±2,0
Гранулоцитла, %
22,4±1,31
44,8±1,13*
47,2±4,19*
Таёқсимон ядроли , %
1,5±0,4
7,3±2,91*
5,0±2,08*
Бўлинган ядроли , %
34,0±1,63
48,0±2,31*
50,7±3,84*
Гемоглобин
130,3±8,89
122,5±5,31
141,0±7,58**
Эритроцитлар
7,98±0,71
7,98±0,26
9,06±0,48
Илова: *Р≤0,05 интакт ҳайвонлар билан қиёслашда, ** Р≤0,05 назорат гуруҳи билан
қиёслашда
Полипептидларнинг стандартлаштирилган комбинацияси яққол кўринадиган
ўсмага қарши самарага эга бўлиши билан бирга, организм иммун тизимининг
тикланишида қатнашади, қоннинг гематологик кўрсаткичларини яхшилайди.
Биокорнинг ўсмага қарши фаоллигининг кўчириб ўтказилган штаммли
экспериментал ҳайвонларда препаратни кеч киритишдаги тадқиқоти.
Ҳайвонлар ҳаёти давомийлигини аниқлашга оид экспериментлар юқорида
номи келтирилган препарат таъсирида ўсма ўсишини оғирлиги ва ҳажми
бўйича секинлаштиришни аниқлаш ҳолатига ўхшаш ҳолда олиб борилди.
Препаратни киритиш ўсма кўчириб ўтказилишининг 10-кунида амалга
оширилди.
17
5-жадвал
Биокорнинг ўсмага қарши фаоллигини уни кеч (ўсма кўчириб
ўтказилганининг 10-куни) киритишда ўсма ўсишини секинлаштириш
кўрсаткичлари ва ҳайвонлар ҳаёти давомийлигининг узайиши бўйича
изланишлар
Эксперимен
тал штаммлар
Ҳажм бўйича
ЎЎТ %
Масса бўйича ЎЎТ%
ҲДУ
%
АКАТОЛ
91,40
66,35
38,34
АКАТОН
60,95
47,17
49,83
Меланома В-16
56,35
60,06
30,59
Саркома 180
63,84
61,63
35,90
Соядан олинган Биокорнинг АКАТОЛ, АКАТОН, Меланома В-16 ва
Саркома 180 кўчириб ўтказилган штаммларида ўсмага қарши фаоллигини
аниқлашга оид олиб борилган тадқиқотларга кўра, ушбу оқсил ўсма кўчириб
ўтказилгандан сўнг, 10-куни киритилганида, ўсма ўсишини секинлаштириш
(ЎЎС) самадорлиги ва экспериментал ҳайвонларнинг ҳаёт давомийлигини
узайтириши (ҲДУ) кўрсаткичлари бўйича тегишли равишда 60% ва 30%
ижобий таъсирга эга бўлган (5-жадвал).
Экспериментал ҳайвонларнинг ҳаёт давомийлигини узайтиришини
аниқлаш экспериментларида ички органларни текшириш ўсма кўчириб
ўтказилгандан сўнг 10-куни киритилганида кам сонли метастаз ҳолатлари
мавжудлигини кўрсатди. Биокор оқсил комплекси таркибидаги протеазалар
ингибиторлари метастазланиш ҳолатларини камайтиришга ёрдам беради.
Биокор ўсмага қарши фаоллигини 5-фторурацил билан киритишда
сичқонларнинг кўчириб ўтказилган ўсмаларида олиб борилган изланишлар.
5-фторурацил (5-ФУ) препарати 228 мг/кг дозада ҳайвонларга ўсма
трансплантацияси ўтказилгандан сўнг 3, 5 ва 9 кунлари қорин бўшлиғидан
киритилди, Биокор 150 мг/кг дозада ўсма трансплантацияси ўтказилгандан
сўнг иккинчи кундан бошлаб, 10 кун давомида перорал киритилди. Шундан
кейин ҳайвонлар табиий нобуд бўлгандан сўнг барча гуруҳларда ЎЎС, ўртача
ҳаёт давомийлиги кўрсаткичлари ҳисобланди ва булар асосида назорат
гуруҳи билан қиёслаб, ҳаёт давомийлигининг узайиши аниқланди.
Оқсил препаратининг 5-фторурацил билан бирга сичқонлар кўчириб
ўтказиладиган ўсмаларидаги эрта муддатларда киритилишида ўсмага қарши
фаоллигини аниқланди. Препарат цитостатик даражасидаги юқори ўсмага
қарши фаолликни кўрсатди. Соя оқсилини 5-фторурацил билан комплекс
терапияда киритилиши ўсмага қарши таъсирни 10дан 25%гача кучайтиради
(6-жадвал).
Ўсмага қарши цитостатик ва биокорни комплекс қўллаш самараси
янада сезиларли бўлди, тажриба ҳайвонларининг ҳаётчанлиги ўсма
гистогенезига боғлиқ ҳолда 30%дан 60%га кўтарилди (7-жадвал).
18
6-жадвал
Сичқонлар кўчириб ўтказиладиган ўсмаларида оқсил препаратини
5-фторурацил билан бирга киритилишда ўсмага қарши фаоллигини
аниқлаш
Ўсма тури Препарат
Дозаси
Киритилишл
ар сони
Ўсмани
нг
ўртача
массаси (г)
Масса
бўйича
ЎЎС%
АКАТОН
Назорат
5-ФУ
5-ФУ+БП
БП
228 мг/кг
228мг/кг+150мг
/кг 150 мг/кг
3
3+10
10
1,24±0,48
0,32±0,1
8*
0,09±0,0
6*
0,36±0,2
3*
74,2
92,7
71,0
АКАТОЛ
Назорат
5-ФУ
5-ФУ+БП
БП
228 мг/кг
228
мг/кг+150мг/кг
150 мг/кг
3
3+10
10
0,87±0,31
0,12±0,0
3*
0,07±0,0
1*
0,25±0,1
9*
86,2
91,9
71,3
Саркома
180
Назорат
5-ФУ
5-ФУ+БП
БП
228 мг/кг
228мг/кг+150мг
/кг 150 мг/кг
3
3+10
10
1,8±0,38
0,16±0,0
5*
0,12±0,0
4*
0,19±0,0
8*
91,1
93,3
89,4
Мелано
ма В-16
Назорат
5-ФУ
5-ФУ+БП
БП
228 мг/кг
228мг/кг+150мг
/кг 150 мг/кг
3
3+10
10
1,7±0,23
0,62±0,1
2*
0,40±0,1
1*
0,66±0,1
3*
63,4
76,4
61,2
Тажриби гуруҳларининг барча кўрсаткичлари учун *p<0,05,назоратга нисбатан.
Биокор препарати субстанцияси ва 5-фторурацил билан бирга киритилиши
кейингисининг заҳарлилик таъсирининг камайишига, шунингдек, ўсма
ўсиши секинлашишинингортишига, экспериментал ўсма ташувчи ҳайвонлар
ҳаёти давомийлигининг узайишига олиб келади.
Биокорни киритишда ўсма ташувчи ҳайвонлар иммун статусининг
ўзгариши.
Саркома 180 штаммли ўсма зотсиз сичқонларга трансплантация
қилингандан сўнг 3-, 5- ва 9-кунлари қорин бўшлиғидан 5-фторурацил 228
мг/кг дозада, 2-21-кунлари – перорал Биокор 150 мг/кг дозада киритилди.
Иммун статусини баҳолаш усули ҳар бир рецепторнинг ўзига хос
дифференциялаш кластерлари (CD) [Залялиева, 2004] билан лимфоцитлар
субпопуляцияларини миқдорий тестдан ўтказишгаасосланган. CD3, CD4,
CD8, CD16, CD19 каби CD-маркерлар қўлланилди
.
Нейтрофилларнинг
фагоцитар фаоллиги (НФФ) уларнинг латекс (1,5 мк) нейтрал заррачаларини
фоизларда фагоцитлаш хусусиятига кўра аниқланди.
7-жадвал
Оқсил препаратининг 5-фторурацил билан бирга киритилишида
сичқонлар кўчириб ўтказиладиган ўсмаларида ҳайвонлар ҳаёти
давомийлигининг узайишини аниқлаш
Ўсма тури Препарат
Дозаси
Киритилиш ҲДҚ(кун)
ҲДУ%
19
сони
АКАТОН Назорат5-
ФУ
5-ФУ+БП
БП
228 мг/кг
228 мг/кг+150
г/кг 150 мг/кг
3
3+21
21
25,1±1,25
33,5±1,67
37,3±1,72
26,6±1,33
33,4
48,6
35,5
АКАТОЛ
Назорат
5-ФУ
5-ФУ+БП
БП
228 мг/кг
228 мг/кг+150
г/кг 150 мг/кг
3
3+21
21
17,7±1,35
30,5±1,52
27,5±1,26
30,6±1,51
72,3
55,3
72,8
Саркома
180
Назорат
5-ФУ
5-ФУ+БП
БП
228 мг/кг
228 мг/кг+150
г/кг 150 мг/кг
3
3+21
21
36,6±1,83
50,3±2,52
65,3±3,26
56,3±2,81
37,4
78,4
53,8
Мелано
ма В-16
Назорат
5-ФУ
5-ФУ+БП
БП
228 мг/кг
228 мг/кг+150
г/кг 150 мг/кг
3
3+21
21
23,4±1,17
30,8±1,52
41,8±2,06
30,6±1,53
31,6
78,6
30,7
7-расм. 5-фторурацил ва
Биокор препаратининг ўсма
ташувчи-ҳайвонлар
иммунологик
кўрсаткичларига таъсири
Цитостатикларни киритиш CD3+, CD4+, CD8+Т-лимфоцитлар,
шунингдек, ҳимоянинг табиий омилларини ҳам (НФФ, CD16+) фоизи ва
функционал фаоллигини пасайтиради (7-расм). Биокор цитостатикнинг
заҳарлилик ва иммунодепрессив таъсирини пасайтиради, ва шу билан ўсмага
қарши фаолликни кучайтиради, иммунбошқарилиш индексини тиклайди (8-
жадвал).
8-жадвал
5-фторурацил ва Биокор препаратининг иммунбошқарилиш индексига
таъсири
Интакт
ҳайвонлар
Ўсма
ташувчилар
5-ФУ
5-ФУ+Биокор
Биокор
ИРИ
1,63±0,1
0,5 ±0,01
0,6 ±0,01
1,1 ±0,1
1,2 ±0,1
20
Биокор 5-фторурацил киритилган ўсма ташувчи ҳайвонлар иммун
статусининг
тикланишига
ёрдам
беради.
Биокор
ўсмага
қарши
препаратларнинг даволовчи таъсирини модуллаштиради ва ўсма ташувчи
ҳайвонлар иммунитетини бошқаради.
Экспериментал ўсмалар ўсишини нурли терапия ва Биокор таъсирида
модификациялаш.
Нурли терапия 2 Гр дозадаги гамма-нурланишда ўсма кўчириб
ўтказилгандан сўнг 52 с дан кейин олиб борилди. Биокор перорал ўн баробар
150 мг/кг дозасида, ўсма трансплантация қилинганидан сўнг иккинчи кундан
бошлаб киритилди. Ҳайвонлар экспериментнинг 14-куни хлороформли
наркоз остида сўйилди. Ўсмага қарши самара олиб ташланган ўсма
тўқимасининг оғирлиги (М) ва ҳажми (V) бўйича баҳоланди. Тадқиқотлар
натижасига кўра, 2 Гр дозадаги гамма-нурланиш Саркома-180 ўсма ўсишини
оғирлик бўйича 48%га ва ҳажм бўйича 52%га секинлаштиради (9-жадвал).
Биокорнинг нурланиш билан биргаликда таъсири ўсма ўсишини
секинлаштиришда даволаш самарасини оғирлик бўйича 85%га ва ҳажм
бўйича 97%га оширади. АКАТОЛ ўсмаси билан нурланиш ўсма ўсишини
оғирлик бўйича 37%гача ва ҳажм бўйича 70%гача секинлаштиради.
Биокорнинг таъсири нурланишнинг ўсмага қарши самарасини оширади. ЎЎС
оғирлиги бўйича 91%ни, ҳажм бўйича эса 88%ни ташкил этди.
АКАТОН ўсмаси билан нурланиш ўсма ўсишини оғирлик бўйича
64%гача ва ҳажм бўйича 91%гача тўхтатади. Биокорнинг таъсири,
шунингдек, нурланишнинг ўсмага қарши самарасини оширишга олиб келади:
ЎЎС оғирлик бўйича 70%ни, ҳажм бўйича эса, 97%ни ташкил этди.
Олиб борилган тадқиқотларнинг тасдиқлашича, ўсмага қарши
даволашни Биокор билан тўлдириш ҳайвонлар экспериментал ўсмаларнурли
терапияси самарасини ошириш имконини беради. Бунда регрессиясининг
кучайишида намоён бўладиган даволашнинг ижобий самараси ўсма
гистогенезига боғлиқ бўлади.
Диссертациянинг
«Биокорнинг ўсмага қарши фаоллигини invitro
(кўкрак бези саратони, бачадон эндометрияси саратони ва йўғон ичак
саратони) экспериментларидаги тадқиқоти»
деб номланган тўртинчи
бобида Биокор
in vitro
препарати субстанциясининг касаллик
ривожланишининг турли босқичларида апоптозни чақириш ва биопсия
материали саратон ҳужайралари пролиферациясини ингибирлашга кўрсатган
таъсири натижалари тўлиқ келтирилган.
9-жадвал
Биокор ва нурланишнинг кўчириб ўтказилган ўсмалар ўсишига таъсири
Ўсма
Гуруҳ/пре
па ратлар
Ўсманинг
ўртача
Ўсманинг
ўртача
Масса
бўйича,
Ҳажм
бўйича,
массаси, г
ҳажми, см3
ЎЎС
%
ЎЎС
%
Саркома 180
назорат
0,74±0,16
0,93 ±0,28
-
-
21
ϒ
0,38±0,12*
0,45 ±0,25*
48
52
ϒ
+БП
0,11±0,02* **
0,02 ±0,01 *
**
85
97
АКАТОЛ
назорат
1,87±0,32
3,72 ±0,80
-
-
ϒ
1,16±0,34*
1,12 ±0,35 *
38
70
ϒ
+БП
0,17±0,09 *
**
0,44 ±0,43 *
91
88
АКАТОН
назорат
1,75±0,53
2,75 ±1,10
-
-
ϒ
0,63±0,22*
0,25 ±0,16 *
64
91
ϒ
+БП
0,52±0,19 *
0,09 ±0,06 *
**
70
97
Илова: *Р≤0,05 1 гуруҳ билан қиёсланганда (даволанмаган ҳайвонлар), ** Р≤0,05 1
гуруҳ билан қиёсланганда (нурли терапия олган ҳайвонлар).
Анъанавий терапияга резистент бўлган кўкрак бези саратони
ҳужайларида Биокорнинг ўсмага қарши фаоллиги бўйича изланишлар.
Тарқалган кўкрак бези саратони мавжуд беморларда терапия схемасини
индивидуал танлаш учун ўсмаларнинг гормонал ва дори сезгирлигини
аниқлаш, айниқса, долзарбдир [Петров и др., 2000]. Кўкрак бези саратони
ҳужайралари юзасида эстроген ва прогестеронга нисбатан рецепторларнинг
бўлмаслиги бу касалликнинг анъанавий терапиясини қўллаш имконини
бермайди ва фармакологик таъсирни ўзгартиришни талаб этади, бунда ушбу
касаллик беморларнинг тахминан 15%ида учрайди [Герштейн, Кушлинский,
2002].
Ўсма материали олингандан сўнг кўкрак бези саратони билан
касалланган
беморларда
эстроген
ва
прогестеронга
нисбатан
рецепторларнинг
мавжудлиги
бўйича
тадқиқотлар
олиб
борилди.
Эстрогенларга нисбатан рецепторларга қарши «Novoсastra» (Англия)
фирмасида ишлаб чиқарилган сичқон моноклонал антитаналари (клон 6F11)
ва прогестеронга нисбатан рецепторларга қарши сичқон моноклонал
антитаналари (клон 1A6) қўлланилди.
Ўсма тўқималари намуналари прогестерон ва эстрогенларга нисбатан
рецепторларнинг бор-йўқлигига қараб, гуруҳларга бўлинди, шундан сўнг
иккала тур ўсма ҳужайралари ўсиш муҳитида
in vitro
культураланди.
Келтирилган маълумотларга кўра, Биокор ўсма ҳужайраси юзасида эстроген
ва прогестеронларга нисбатан рецепторлар бўлмаган ҳолатда, кўкрак бези
саратони
ҳужайралари
пролиферациясини
сезиларли
ингибирлаш
хусусиятига эга (8, 9-расмлар). Бунда оқсил яққол кўринадиган дозага боғлиқ
таъсирни намоён этди.
22
8-расм. Эстрогенлар ва
прогестеронга нисбатан
рецепторлари мавжуд кўкрак
бези саратони ҳужайралари
қатламининг Биокор таъсирида
деструкция даражаси. Тажриба
гуруҳларининг барча
кўрсаткичлари учун p<0,05..
9-расм. Эстрогенлар ва
прогестеронга нисбатан
рецепторлари бўлмаган кўкрак
бези саратони ҳужайралари
қатламининг Биокор таъсирида
деструкция даражаси. Тажриба
гуруҳларининг барча
кўрсаткичлари учун p<0,05..
Биокорнинг кўкрак бези саратони ҳужайраларига 50 мкг/10
6
ҳужайрага ва 100 мкг/10
6
ҳужайрага нисбатан олинган концентрациялари
таъсирида ўсма ҳужайраларининг кўпгинаси нобуд бўлди (деструкция
даражаси 28,87%±5,38 ва 36,2%±11,47га тегишли равишда тенг бўлди), 10
мкг/10
6
ҳужайрага нисбатан олинган концентрацияда эса аввалгига ўхшаш
самара намоён бўлмади ва оқсилнинг цитотоксик таъсири назорат
кўрсаткичига яқин келди (6,0%±0,98).
Bcl-2 гени апоптоздан устунлик қилиб, ҳужайра нобуд бўлиши
механизмини белгилаб берадиган етакчи ген ҳисобланади. Бу ген
митохондрияларда тўпланадиган оқсилнинг ҳосил бўлишини кодлайди
[Безбородова ва бошқ., 2004; Казачкина ва бошқ., 2006]. Bcl-2 гени
экспрессияси стероид гормонларига нисбатан рецепторларнинг мавжудлиги
ва хавфлиликнинг паст даражаси билан коррекциялангани учун ижобий
натижага ишора қилувчи омиллар билан боғлиқ [Gallo еt al, 2006].
Кўкрак бези саратони ўсма ҳужайралари юзасида эстроген ва
прогестеронларга нисбатан рецепторлари бўлмаган ҳолатда Биокор
таъсиригача ва ундан сўнг протеин Bcl-2 экспрессияси бўйича изланишлар
олиб борилди. Барча концентрациялардаги Биокор таъсири кўкрак бези
ҳужайраларида Bcl-2 оқсили миқдорининг ўртача 27,25
±
1,14%, p<0,05га
камайишига олиб келди (10-расм).
23
10-расм.
Эстрогенлар ва
прогестеронга нисбатан
рецепторлари бўлмаган кўкрак
бези саратони ҳужайраларида
биокор in vitro
таъсирида
bcl-2
протеинининг миқдорий
ўзгариши.
Тажриба
гуруҳларининг барча
кўрсаткичлари учун
p<0,05.
Биокорнинг кўкрак бези саратони ҳужайраларига касалликнинг кеч
босқичларидаги таъсири.
Кўкрак бези ҳужайраларининг хавфли транформацияси кузатилган,
касалликнинг учинчи босқичидаги ўсма тўқимаси намуналаридан
фойдаландик. Бемор Г., 68 ёш, ташҳиси – чап кўкрак бези саратони, T
2
N
1
M
0
(Т
– ўсма ўлчами, N – махсус лимфотик тугунларнинг катталашганлиги, М –
узоқ мтастазларнинг аниқланиши), операция материалидан олинган ўсма
ҳужайралари полистиролли планшетнинг тешикларига солинди, ўртача
қалинликдаги ҳужайра қатлами ҳосил бўлгандан сўнг дозаси 100 мкг/млн
ҳужайрага (I гуруҳ) бўлган вадозаси 50 мкг/млн ҳужайрага (II гуруҳ) бўлган
Биокор қўшилди, назорат гуруҳи сифатида Биокор қўшилмаган кўкрак бези
саратони ҳужайралари олинди (III гуруҳ), протеинли ҳужайралар инкубация
вақти 60 дақиқани ташкил этди. Биокорнинг кўкрак бези саратони
ҳужайраларига нисбатан цитотоксик фаоллиги натижалари 11-расмда
келтирилган.
Олинган натижаларга кўра, дозаси 100 мкг/млн ҳужайрага бўлган
Биокор умумий ўсма ҳужайраларининг 64% ини нобуд қилиб, шу билан бир
қаторда 12% ҳужайраларда апоптозни чақириб, юқори ўсмага қарши
фаолликни кўрсатди. Протеин таъсир қилиш дозасининг камайиши билан
унинг ўсмага қарши фаоллиги ҳам камаяди, худди шундай, Биокорнинг
таъсир қилиш дозаси 50 мкг/млн ҳужайрага бўлган оқсил 38% саратон
ҳужайраларини нобуд қилган.
11-расм. Биокорнинг кўкрак
бези саратони ҳужайраларига
нисбатан цитотоксик
фаоллиги (Бемор Г., 68 ёш,
ташҳиси – чап кўкрак бези
саратони, T
2
N
1
M
0
нинг
операция материали).
Тажриба гуруҳларининг
барча кўрсаткичлари учун
p<0,05
.
24
Биокорнинг ўсмага қарши фаоллигини бачадон эндометрияси саратони
ҳужайраларида тадқиқоти.
Эндометрия саратони (ЭС) онкогинекология патологияси тузилишида
биринчи ўринни эгаллайди, ЭС билан касалланиш кўрсаткичларининг ўсиш
суръатлари аёллар репродуктив тизимининг бошқа хавфли ўсмаларидан
анчагина юқоридир [Imyanitov E.N.et.al, 2005].
Намунада эндометрия тўқимасининг ўсмадан аввалги ҳолат кузатилди,
бемор бачадон миомаси ташҳиси билан операция қилинди. 1 млн ҳужайрага
20 мкг дозада оқсил ўсма ҳужайраларининг 89,0±0,98%ини нобуд қилди.
Шунингдек,
Биокор
таъсиридаги
тажриба гуруҳларида апоптозли
ҳужайраларининг ҳосил бўлиши кузатилди. (12-расм).
Биокор цитотоксик фаоллигининг II-босқич эндометрия саратони
ташҳиси билан, T
2
N
1
M бўлган беморнинг операцион материалидан олинган
ҳужайраларга нисбатан натижалари13-расмда келтирилган. Олинган
натижаларга кўра, сояли протеин барча қўлланилган дозаларда саратон
эндометрияси ҳужайраларга нисбатан юқори цитотоксик фаолликни намоён
қилди, 1 млн ҳужайрага 20 мкг дозада оқсил 42,0±1,56% ўсма ҳужайраларини
нобуд қилган, 50 мкг дозасида эса - 50,0±1,58% бўлди. Бу ҳолатда
эндометрия саратон ҳужайраларига протеиннинг таъсирида тажриба
гуруҳларида апоптозли ҳужайралар сонининг ошиши кузатилди, бундай
ҳужайраларнинг энг кўпи оқсилнинг 20 мкг дозадаги таъсирида – 32,0±1,47%
кузатилди, назорат гуруҳида эса апоптозли ҳужайралар 11,0±0,98% бўлди.
Биокорнинг йўғон ичак саратони ҳужайраларидаўсмага қарши
фаоллигининг тадқиқоти.
Охирги ўн йилликда онкология билан касалланиш динамикасининг ўзига
хос хусусиятларидан бири ёйсимон ва йўғон ичак саратони билан
касалланишнинг ўсганлигидир. Ҳозирда ғарбий Европа мамлакатларида
йўғон ичак саратони барча хавфли ўсмаларнинг 15%ини ташкил
этади.Онкологик касалликлар тизимида эркаклар (ўпка саратонидан кейин)
ва аёлларда (кўкрак бези саратонидан кейин)ҳам иккинчи ўринни эгаллайди
[SmithR.A.etal, 2009, р. 27].
Бемор М.Р., 68 ёш, ташҳиси – йўғон ичак саратони, T
4
N
0
M
0
бўлган
операцион материалидан олинган ўсма тўқимасида Вcl-2 ва Ki-67
онкопротеинлар экспрессияси аниқланди.
12-расм.Эндометрий
ҳужайраларига нисбатан
Биокорнинг цитотоксик
фаоллиги (бачадон миомаси
ташҳисли беморнинг операция
материали).
Тажриба
гуруҳларининг барча
кўрсаткичлари учун
p<0,05
.
25
13-расм. II-босқич эндометрий
саратони ташҳиси билан,
T
2
N
1
M бўлган беморнинг
операцион материалидан
олинган ҳужайраларга
нисбатан Биокор цитотоксик
фаоллиги.
Тажриба
гуруҳларининг барча
кўрсаткичлари учун
p<0,05.
Йўғон ичак саратон ҳужайралари протеин Вcl-2 ва протеин Ki-67ни
бирдай сезиларли даражада экспрессияга учратган. Вcl-2 экспрессияси
97,0±0,76%ни ташкил этди, бу ҳолат ушбу гистогенез ҳужайраларида апоптоз
жараёнларининг кучли секинлашганлигини билдиради. Ki-67 протеин
экспрессияси 64,0±2,14%ни ташкил этди. Ўтказилган иммуногистокимёвий
таҳлилга кўра, йўғон ичак саратон ҳужайралари апоптозли ҳужайрасиз,
анъанавий терапияга резистент юқори пролиферацияли тўқимага эга.
Вcl-2 ва Ki-67 онкопротеинларининг статуси тасдиқланган сўнг йўғон ичак
саратони ҳужайраларига дозаси 50 мкг/1,2 млн ҳужайрага (I гуруҳ) ва дозаси
100 мкг/1,2 млн ҳужайрага (II гуруҳ) сояли Биокор таъсир эттирилди, назорат
гуруҳи бўлиб Биокорсиз йўғон ичак саратони ҳужайралари хизмат қилди (III
гуруҳ), протеинли ҳужайралар инкубация вақти 60 дақиқани ташкил этди.
Олинган маълумотларга кўра,50,0 мкг/1,2 млн ҳужайрага дозасидаги
Биокор 60% ўсма ҳужайраларини нобуд қилиб, шу жумладан, 5% ҳужайрада
апоптозни чақирган ҳолда, юқори ўсмага қарши фаолликни кўрсатди. 100,0
мкг/1,2 млн ҳужайрага таъсир дозасида Биокор оқсили 78% саратон
ҳужайраларини нобуд қилиб, 6% ҳужайрада апоптозни чақирган (14-расм).
14-расм. Йўғон ичак саратони
ҳужайраларига нисбатан
Биокорнинг цитотоксик
фаоллиги (Бемор М.Р., 68 ёш,
ташҳиси – тўғри ичак
саратони, T
4
N
0
M
0
бўлган
операция материали).
Тажриба
гуруҳларининг барча
кўрсаткичлари учун
p<0,05.
Диссертациянинг
«Биокор препарати субстанциясининг умумий,
сурункали ва махсус токсикологиясининг клиникагача бўлган
тадқиқоти»
деб номланган бешинчи бобида экспериментал ҳайвонлар
организмига препарат таъсирининг тавсифи тасдиқланди ва унинг
хавфсизлигига баҳо берилди.
26
Биокор препарати субстанциясининг умумий таъсири ва «ўткир»
токсиклигини аниқлаш
.
Биокор препаратининг субстанцияси заҳарсиз бирикмаларнинг V
синфига кириши тасдиқланди. 5000мг/кг бир марталик перорал киритишда,
сичқонларда LD50 ва қорин бўшлиғидан киритишда 1200 (900-1600) мг/кгни
ташкил этди (10-жадвал). Биокор субстанцияси кумуляцияси бўйича
тадқиқотларга кўра, тажриба ҳайвонларининг (сичқонлар ва каламушлар)
умумий ҳолати ва ҳулқ-атвори интакт гуруҳлардан фарқ қилмаган. Тажриба
сичқонлари ва каламушларининг нобуд бўлмаганлиги, Биокор субстанцияси
кумуляция хоссасига эга эмаслиги тўғрисида хулоса қилишга имкон беради
(11-жадвал).
Биокор препаратинининг сурункали заҳарлилигини клиникача бўлган
изланишлари.
Биокор сурункали киритилишда периферик қон таркибига заҳарли
таъсир кўрсатмайди. Лейкоцит формуласида барча изланишлар муддатларида
патологик ўзгаришлар аниқланмади. Препарат буйраклар фаолиятига заҳарли
таъсир кўрсатмайди. Препарат субстанцияси кўрилган дозаларда перорал ҳар
куни киритилганда каламушлар ва қуёнлар жигари фаолиятига заҳарли
таъсир кўрсатмайди. Препарат субстанциясининг 30 кун давомида ҳар куни
ҳайвонларга киритилишида олиб борилган кузатувлар натижасида тажриба
ва назорат гуруҳлари ўртасида ҳеч қандай фарқлар аниқланмади. Тажриба
каламушлари ва қуёнларининг ҳулқ-атвори назорат гуруҳи ҳайвонларидан
фарқ қилмади.
10-жадвал
Биокор препарати субстанциясининг«ўткир» токсиклиги
кўрсаткичларининг натижалари
Дозала
р,
мг/кг
Киритиш йўли
Перорал
Қорин бўшлиғидан киритиш
Каламушлар
сони
Нобуд
бўлганлар/
ҳаммаси
Каламушлар
сони Нобуд
бўлганлар/
ҳаммаси
Каламушлар
сони
Нобуд
бўлганлар/
ҳаммаси
Каламушлар
сони Нобуд
бўлганлар/
ҳаммаси
500
-
-
0/2
-
600
-
-
1/2
-
800
0/2
-
1/2
-
1000
0/2
0/2
2/2
0/2
1500
0/2
0/2
2/2
0/2
1800
0/2
0/2
-
1/2
2000
0/2
0/2
-
2/2
3000
0/2
0/2
-
2/2
4000
-
0/2
-
-
5000
-
0/2
-
-
27
11-жадвал
Биокор препаратини кумуляцияси
Киритиш
кунлари
Ҳайвонлар сони(п10)
LD
50
ҳиссаси
LD
50
≥ 5000мг/кг
1-4
0/10
0,1
500
5-8
0/10
0,15
750
9-12
0/10
0,22
1100
13-16
0/10
0,34
1700
17-20
0/10
0,50
2500
21-24
0/10
0,75
3800
25-28
0/10
1,12
5600
24 кундаги LD
50
нинг йиғиндиси 12800ни, экспериментнинг максимал давомийлиги 24±4
кунни ташкил этди. К
к
LD
50n
/ LD
50 1
, бунда К
к
-кумуляция коэффициенти, LD
50n
– n
маротабали киритишда ўртача нобуд қилиш дозаси, LD
50 1
– 1 маротабали киритишда
ўртача нобуд қилиш дозаси. К
к
≥ 1 ўрганиш; К
к
≤ 1 кумуляция.
Каламушлар тажриба гуруҳларида тана оғирлигининг бирмунча
ортиши кузатилди. Қуёнлар тажриба ва назорат гуруҳларида эксперимент
давомида тана оғирлигининг ортиши кузатилмади.
Препарат субстанцияси 10 марталик киритилишда гипокоагуляцияни
чақириб, қон ивишининг I ва II фазаларида таъсир кўрсатмайди. Биокор
препаратининг дозасини ошириш гипокоагуляцион самаранинг ошишига
олиб келмади. Самара 10 марта киритилиш давомида барча текширилган
дозаларда сақланиб қолди, 30 кунгача Биокорни киритиш аста-секин
таъсирининг камайишига олиб келади.
Препаратни давомли киритиш ички органлар тузилишида (юрак,
ошқозон, ичаклар, буйрак, бачадон) морфологик ўзгаришларни чақирмайди.
Шунга кўра, берилган янги препарат хавфсиз восита бўлиб, клиника
тиббиёти учун тавсия этилиши мумкин.
Биокор препарати ўзига хос токсикологиясининг клиникагача изланишлари.
Биокор препарати маҳаллий қитиқловчи, резорбтив, маҳаллий
аллерген,
эмбриотоксик
ва
тератоген,
лимфоид
органларнинг
ҳужайравийлиги ва оғирлигига иммунотоксик, мутаген (физиологик норма
даражасидаги хромосома ўзгаришлари) таъсир кўрсатмайди, организм
иммунологик реактивлигини сезиларли рағбатлантирадиган хусусияти
тасдиқланди аниқланган модда иммунитетнинг гуморал занжирини
интенсивлаштириш хоссасига эга.
Биокор препаратининг умумий фармакологиясини аниқлаш
Препаратни 30 кун
давомида киритишда иштаҳага, ёш, ўсаётган сичқонлар тана оғирлигини
тўплашга, ҳаракат фаоллиги ва жисмоний юкламаларга чидамлилигига
сезиларли таъсири кузатилмади. Этаминал натрийнинг уйқу чақириш
таъсирининг кучайиши, коразолнинг тириштириш таъсирининг камайиш
тенденцияси кузатилди.
28
«Очиқ майдон» тести - препарат кўп маротабалик қўлланилганда
тажриба каламушларининг ҳулқ-атвор реакциялари, марказий ва периферик
асаб тизимини экспериментнинг 10 ва 30 кунларида ҳам бирдек
фаоллаштиради. 1 ойдан сўнг препарат киритилиши тўхтатилгандан кейин
тажриба ҳайвонларининг барча кўрсаткичлари назорат кўрсаткичларига
қайтиши кузатилди.
Юқорида санаб ўтилган маълумотлар препаратнинг ҳайвонлар
организмига токсик таъсир кўрсатмаслиги тўғрисида хулоса қилиш
имконини беради.
«Биокор – 0,2г» препаратининг дори шаклини ишлаб чиқиш
Тадқиқотлар асосида «Биокор – 0,2г» препаратининг таблеткаси ишлаб
чиқилди. Таблеткалар оқиш-кул рангдан оч сариқ ранггача, думалоқ, япалоқ
цилиндрсимон, киритмали эгатсиз.
Битта таблетка дорининг таркиби:
Биокор (100% қуруқ модда ҳисобида)
(ВФМ 42 Уз - ) - 200 мг Микрокристалли целлюлоза
(ТУУз 42-002-96 ёкиTSh88.2-6:2000) - 274 мг Н-карбоксиметил
целлюлозахап дори учун
(TSh 88.3-003:2007) 120 мг Кальций стеарат
(ТУ 6-09-42-33-76, ВР) - 6 мг Хап дори массаси 600 мг
Шундай қилиб, «Биокор-0,2г» препарати – иммуномодулятор бўлиб,
клиникагача бўлган тадқиқотлар асосида меланома, йўғон ичак, кўкрак бези
ва бачадон эндометрияси саратонлари каби онкологик касалликларда
қўлланилиши мумкин.
ХУЛОСАЛАР
1. Илк бор соянинг «Генетик-1» (
Glycine max (L.) Mtrr
) навидан
молекуляр массаси 12,7-79,0 кДа бўлган, изолектрик нуқтаси pI -4,1, 4,2, 4,5
ва 4,7 га тенг оқсиллар комплексидан иборат «Биокор-0,2г» препаратининг
субстанцияси ажратилди, унинг таркибига кирувчи оқсиллар (Kunitz trypsin
protease inhibitor, beta-amylase, beta-conglycinin alpha prime subunit, 2,4-
Dinducible glutathione S-transferase, PR10-like protein, 24kDa protein SC24)
аниқланди.
2. «Биокор-0,2г» препаратининг трипсин, химотрипсин ва плазмин
каби серинли протеазаларга нисбатан ингибирлаш фаоллиги кўрсатилди. 3.
«Биокор-0,2г» препаратининг АКАТОЛ, АКАТОН, Меланома В-16 ва
Саркома 180 каби пайвандланган ўсма штаммларида ўсмага қарши фаоллиги,
унинг монотерапияда пайвандланган ўсма штаммларида саратон
тўқимасининг ўсишини 70% га секинлаштириши аниқланди.
29
4.
«Биокор-0,2г»
препаратининг
субстанцияси
экспериментал
ҳайвонлар суяк илиги ҳужайралари пролиферациясини ва уларнинг яшаш
давомийлигини ўсма гистогенезига боғлиқ ҳолда 30-49% гача ошириши
аниқланди.
5. «Биокор-0,2г» препарати субстанциясини 5-фторурацил билан
комплекс терапияда лаборатория ҳайвонларига киритиш ўсмага қарши
таъсирни ўртача 10-25% га кучайтиради ва экспериментал ўсмаларда нурли
терапиянинг самарадорлигини ўртача 1,5-2,3 марта ошириш имконини
беради. Тажриба ҳайвонларининг ҳаётчанлигини 30-60 % гача оширади.
6. «Биокор-0,2г» препарати субстанциясининг 5-фторурацил берилган
ўсма-ташувчи ҳайвонлар иммун тизимининг қайта тикланишига ёрдам
бериши, ўсмага қарши препаратларнинг даволовчи таъсирини яхшилаши ва
ўсма-ташувчи ҳайвонлар иммунитетини бошқариши аниқланди.
7. Сичқонларга «Биокор-0,2г» препарати субстанциясини киритиш
қоннинг гематологик ва морфологик кўрсаткичларини (лейкоцитлар фоиз
таркибини нормаллашиши, гранулоцитлар даражасини, гемоглобин таркиби
ва эритроцитлар сонининг ошиши) яхшилашига ёрдам бериши аниқланди.
8. Эндометрия ҳамда йўғон ичак саратони (bcl-2 bKi-67нинг юқори
кўрсаткичи) хавфли трансформациянинг барча босқичларида
in vitro
тажрибаларда «Биокор-0,2г» препарати субстанцияси кўкрак бези саратони
терапиясига резистент бўлган, эстрогенлар ва прогестеронга нисбатан
рецепторлари бўлмаган ўсма ҳужайралари пролиферациясини 50% га
ингибирлаши кўрсатилди.
9.
«Биокор-0,2г»
препаратининг
субстанцияси
заҳарсиз
бирикмаларнинг V- синфига кириши аниқланди. Сичқонларга препаратни
перорал киритишда LD
50
5000мг/кг дан кўпроқлиги, кумулятив таъсирга эга
эмаслиги, буйрак ва жигар функцияси, шунингдек, ҳайвонлар органлари ва
тўқималари патоморфологиясига заҳарли таъсир кўрсатмаслиги, юрак-томир
тизими, нафас олиш ва периферик асаб тизимларга таъсир қилмаслиги
кўрсатилди. Препаратининг субстанцияси лимфа органлари оғирлигига,
макрофаглар миқдорига, суяк илиги ҳужайраларига иммунотоксик,
резорбцияловчи, аллерген, эмбриотоксик, тератоген ва мутаген таъсир
кўрсатмайди.
10. «Биокор-0,2г» иммуномодулятор препаратининг таблетка дори
кўринишидаги дори шакли ишлаб чиқилди ва онкологик касалликларни
комплекс даволаш учун тавсия этилди.
30
РАЗОВЫЙ НАУЧНЫЙ СОВЕТ ПО ПРИСУЖДЕНИЮ УЧЕНОЙ
СТЕПЕНИ ДОКТОРА НАУК НА ОСНОВЕ НАУЧНОГО СОВЕТА
14.07.2016.К/В/Т.13.01 ПРИ ИНСТИТУТЕ БИООРГАНИЧЕСКОЙ
ХИМИИ И НАЦИОНАЛЬНОМ УНИВЕРСИТЕТЕ УЗБЕКИСТАНА ПО
ПРИСУЖДЕНИЮ УЧЁНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА НАУК
ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ
ИБРАГИМОВ ФАЗИЛ АХМЕДОВИЧ
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ БЕЛКОВОГО ПРЕПАРАТА
ИЗ СОИ В ЛЕЧЕНИИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
02.00.10 – Биоорганическая химия
(биологические науки)
АВТОРЕФЕРАТ ДОКТОРСКОЙ ДИССЕРТАЦИИ
ТАШКЕНТ - 2016
31
Тема докторской диссертации зарегистрирована в Высшей аттестационной
комиссии при Кабинете Министров Республики Узбекистан за 30.09.2014/В2014.5.В68
Докторская диссертация выполнена в Институте биоорганической химии
Автореферат диссертации на трех языках (узбекский, русский, английский) размещен на
веб-странице Научного совета по адресу (http;//ss.biochem.uz) и на
Информационно-образовательном портале «ZiyoNet» по адресу (www.ziyonet.uz).
Научный консультант: Кадырова Дильбар Абдуллаевна
доктор
биологических наук
Официальные оппоненты: Саитмуратова Огульджан Худайбергеновна
доктор биологических наук, доцент
Бугланов Анатолий Аюшевич
доктор биологических наук, профессор
Гафур-Ахунов Мирза Али
доктор медицинских наук, профессор
Ведущая организация
:
Республиканский научный центр иммунологии
Защита диссертации состоится «__» _декабря 2016 года в ___ часов на заседании
разового Научного совета 14.07.2016.К/В/Т.13.01 при Институте биоорганической химии и
Национальном университете Узбекистана. (Адрес: 100125, г. Ташкент, ул. Мирзо Улугбека,
83. Тел.:(99871) 262 35 40, факс: (99871) 262 70 63).
С докторской диссертацией можно ознакомиться в Информационно-ресурсном
центре Института биоорганической химии. Адрес: 100125, г.Ташкент, ул. Мирзо Улугбека,
83. Тел.:(99871) 262 35 40, факс: (99871) 262 70 63, e-mail: asrarov54@mail.ru).
Автореферат диссертации разослан: «___» ноября 2016 года
(реестр протокола рассылки № ___ от ноября 2016 года).
А.С. Тураев
Председатель разового Научного совета по присуждению
ученой степени доктора наук, д.х.н., профессор
М.И. Асраров
Ученый секретарь разового Научного совета по присуждению
ученой степени доктора наук, д.б.н., профессор
Р.З.Сабиров
Председатель разового научного семинара при разовом
Научном совете по присуждению ученой степени
доктора наук, д.б.н., профессор
32
ВВЕДЕНИЕ (Аннотация докторской диссертации)
Актуальность и востребованность темы диссертации.
На
сегодняшний день в мире профилактика и лечение онкологических
заболеваний остается актуальной, в связи с этим создаются новые
лекарственные средства биологического происхождения, получаемые из
растительного и животного сырья. По статистическим данным Всемирной
Организации Здравоохранения в течение 20 лет онкологическая
заболеваемость возростет в два раза
1
.
С приобретением независимости Республики организация научно
исследовательских работ по получению лекарственных средств из местного
сырья и проведенные расширенные мероприятия по обеспечению
национального фармацевтического рынка качественными лекарственными
средствами на высоком уровне привели к определенным результатам. При
этом, особенно важно отметить лекарственные препараты получаемые из
местного сырья используемые при лечении онкологических заболеваний.
В настоящее время механизмы этиологии и патогенеза раковых
заболеваний окончательно не выяснены из-за большой сложности и
многообразия молекулярных механизмов, происходящих при этом процессов.
Проводимые исследования показывают, что компоненты сои способны
ингибировать пролиферацию опухолевых клеток, индуцировать апоптоз в
трансформированных клетках, и действуют они на опухолевые клетки, и
токсические эффекты в отношении нормальных тканей организма
минимальны, кроме того, одной из важнейших задач является создание
эффективных лекарственных средств и внедрение их в производство.
Данное диссертационное исследование в определенной степени служит
выполнению задач, предусмотренных в Постановлениях Президента
Республики Узбекистан от 28 ноября 2011 года № ПП-1652 «О мерах по
дальнейшему углублению реформирования системы здравоохранения»,
Кабинета Министров Республики Узбекистан от 29 марта 2012 г.№ 91 «О
мерах по дальнейшему укреплению материально-технической базы и
совершенствованию организации деятельности медицинских учреждений», а
также в других нормативно-правовых документах, принятых в данной сфере.
Соответствие исследования приоритетным направлениям развития
науки и технологий республики
. Данное исследование выполнено в
соответствии с приоритетным направлением развития науки и технологий
республики – VI. Медицина и фармакология.
Обзор зарубежных научных исследований по теме диссертации
2
.
Научные исследования, направленные на создание биологических
препаратов на основе белков и пептидов в лечении онкологических
заболеваний осуществляются в ведущих научных центрах и высших
образовательных учреждениях мира, в том числе, в Национальном институте
_______________
1
http://www.cancer.org/downloads/STT
33
рака (США), Национальный Университет Андонг (Корея), Научно
исследовательский институт физико-химической медицины;
Республиканский онкологический научный центр (Россия), Институте
онкологии (Украины), Онкологическом научно-исследовательском центре
(Грузия), в Институте биоорганической химии (Узбекистан). В результате
исследований, проведенных в мире по созданию биологических препаратов
на основе белков и пептидов в лечении онкологических заболеваний,
получены ряд научных результатов, в том числе: выделен пептид луназид
содержащийся в сое и в зернах некоторых злаковых культур, который
предложен в качестве средства для лечения рака, выделен ингибитор протеаз
Баумана-Бирка (Национальный институт рака, США); разработан
иммунотерапевтический лечебный препарат Immucor GA 40с
антиканцерогенными свойствами на основе горного растения Купена горная
Polgonatum varticillatum
(Онкологический научно-исследовательский центр,
Грузия); разработана биологическая активная добавка «Инсол», обладающий
антиканцерогенными свойствами (Московский государственный
университет, Россия); выявлена новая фармакологическая активность ряда
соединений и экстрактов, обладающих ингибиторными свойствами роста
раковых клеток (Институт химии растительных веществ, Узбекистан);
разработан полифункциональный препарат Тортезин, представляющий собой
сумму нейтральных олигопептидов из крови среднеазиатских черепах
Testudo horsfieldi
,
как иммунокорректор, и как средство сопровождения
лучевой и химиотерапии (Институт биоорганической химии АН РУз).
В мире по созданию биологических препаратов в лечении
онкологических заболеваний по ряду приоритетных направлений проводятся
исследования, в том числе: разработка средств для коррекции
иммунологических и гематологических нарушений, возникающих после
химиотерапии и облучения; создание иммунокорректоров после тяжелых
оперативных вмешательств; коррекция иммунологических нарушений,
возникающих вследствие иммунодепрессивного действия самой опухоли;
определение механизмов действия онкопрепаратов на молекулярном и
клеточном уровнях; разработка препаратов белковой природы, которые
оказывают антиметастатический эффект;
Степень изученности проблемы.
Одним из самых последних новых
направлений онкологии является лечение рака биопрепаратами -
уникальными средствами, воздействующими губительно на клетки опухоли,
и не оказывающими вредного влияния на здоровые ткани и весь организм в
_______________
2
Научно-исследовательские коментарии по теме диссертационной работы разработаны
приведен-ным
данным
в
источниках
http://www.lib.uiowa.edu/hardin/md/ej.html;
http://www.cancer.gov/search/cancer_literature/; http://www.scirp.org/journal/jct
и разработаны
на основе других источников
34
целом. Зарубежными учеными Nagase H., Medawar P.B., Xiao C.W., Rheinwald
J., Green Н., Jackman K.A. разработаны современные методы диагностики
онкологических заболеваний и созданы биологические лекарственные
средства для лечения. Высокое содержание лецитина в соевом
белке способствует снижению уровня сахара в крови, очищению стенок
кровеносных сосудов от атеросклеротических наслоений, улучшению
обменных процессов. Ингибиторы протеаз, выделяемые из соевых бобов, в 5-
10 раз снижают вероятность ракового перерождения клеток человека под
действием рентгеновских лучей [Jackman, 2007].
В странах СНГ исследования лекарственных средств на основе растений
в лечении онкологических заболеваний, ведутся учеными Казачкиной Н.И.,
Крутяковым В.М., Корсуным Е.В., Тимошенко А.В., Кадагидзе З.Г.,
Немцовой Е.Р. Ингибиторы помогают при различных опухолевых
заболеваниях (аденокарцинома, ангиосаркома, меланома и др.) печени,
легких желудка, кишечника, носоглотки, соединительной ткани у мышей,
крыc, хомяков. Чистые и частично очищенные ингибиторы протеаз
действуют приблизительно одинаково. Последнее свойство позволит снизить
себестоимость препаратов [Крутяков, 2001].
В Узбекистане исследованиями лекарственных средств на основе
растений в лечении онкологических заболеваний занимаются Еникеева З.М.,
Юлдашев А.Х., ими были выделены такие противоопухолевые соединения,
как производные колхицина, винкристин и винбластин. Получение
стандартизированной комбинации белкового комплекса и определение
биологической и противоопухолевой активности в условиях
in vitro
и
in vivo
,
а также фармако-токсикологическая характеристика полученного препарата
имеет практическое значение.
Связь темы диссертации с научно-исследовательскими работами
научно-исследовательского учреждения, где выполнена работа.
Диссертационное исследование выполнено в рамках прикладного проектов
ФА-А11-Т174 «Разработка противоопухолевого белкового препарата из
шрота сои и выделения особо чистых ферментов из местного сырья» (2009-
2011 г.г.), научно-исследовательских работ фундаментального проекта УНТЦ
№3501 «Исследование соевого белка в лечении злокачественных
новообразований клетки организма» (2006-2009г.), проводимых в Институте
биоорганической химии.
Целью исследования
является выделение белкового комплекса из сои,
его
физико-химические,
фармако-токсикологические
характеристики,
определение противораковой активности на различных видах раковой
опухоли
in vivo
, на биопсийном материале
in vitro
рака молочной железы,
эндометрия и толстого кишечника.
Задачи исследования:
разработка метода выделения белкового комплекса из сои;
35
выделение и физико-химическая характеристика белкового комплекса
из сои;
определение протеазной активности белкового комплекса;
определение биологической активности в экспериментальных моделях
при моно- и комплексной терапии в экспериментах
in vivo
;
определение противоопухолевой активности белкового комплекса на
клетки рака молочной железы, эндометрия и толстого кишечника,
резистентных к терапии в экспериментах
in vitro
;
доклиническое исследование фармако-токсикологии субстанции и
лекарственной формы препарата;
разработка лекарственной формы препарата «Биокор-0,2».
В качестве
объекта исследования
выбраны белковый комплекс из
бобов сои сорта «Генетика-1» (
Glycine max -(L.)Mtrr.
), онкологические
заболевания, рака толстого кишечника, перевиваемые штаммы АКАТОЛ,
АКАТОН, меланома В-16, Саркома-180.
Предметом исследования
являются физико-химические и противо
опухолевые свойства белкового комплекса (субстанция препарата «Биокор 0,2
г») на перевиваемых штаммах АКАТОЛ, АКАТОН, меланома В-16,
Саркома-180, на биопсийном материале
in vitro
рака молочной железы,
резистентным клеткам эндометрия и толстого кишечника на всех стадия
злокачественной трансформации, а также фармако-токсикологические
свойства.
Методы исследования.
В диссертации использованы методы
колоночной хроматографии, электрофоретические методы исследования,
определение аминокислотного состава, имунногистохимического анализа,
микроскопии, масс-спектрометрии, имунноферментного анализа и фармако
токсикологические.
Научная новизна диссертационного исследования
заключается в
следующем:
из бобов сои выделен белковый комплекс, определены его физико
химические, фармакологические и токсикологические свойства; доказано, что
белок состоит из комплекса полипептидов с молекулярной массой 12,7-79,0
кДа, изоэлектрической точкой в области pI - 4,1; 4,2;4,5 и 4,7;
методом масс-спетрометрии показано наличие в белковом комплексе
ингибиторы протеаз Кунитца.
показана специфическая противоопухолевая активность белкового
комплекса в условиях
in vitro
и
in vivo
;
на основе комплекса полипептидов из бобов сои разработана
лекарственная форма препарата «Биокор-0,2г» в виде таблетки.
Практические результаты исследования
заключаются в следующем:
36
проведены доклинические фармако-токсикологические исследования и
показано, что препарат «Биокор-0,2г» относится к V классу практически
нетоксичных соединений, не обладает кумулятивными свойствами.
Достоверность результатов исследования
обосновывается тем, что
экспериментальные данные получены с применением современных
высокоточных методов исследования. Выводы в работе сделаны на основе
результатов, обработанных с использованием современных методов
математической статистики.
Научная и практическая значимость результатов исследования.
Научная значимость результатов исследования заключается в том, что
выделен белковый комплекс из бобов сои в первые в Республике, что
позволит создать новое направление в биотерапии рака. Установлен
механизм действия препарата «Биокор-0,2г» на организм экспериментальных
животных, что позволит получить новые данные об этиологии и
особенностях развития злокачественных опухолей.
Практическая значимость заключается в том, что на основе белкового
комплекса из сои создана лекарственная форма препарата - «Биокор-0,2г»
таблетка для комплексного лечения онкологических заболеваний, препарат
снижает токсическое действие других видов лечения (химио и лучевой
терапии), нормализует иммунную систему, улучшает гематологические и
морфологические показатели крови, предотвращает метастазирование.
Внедрение результатов исследования.
На основании исследования
биологической противораковой активности белка из местной сои: из шрота
сои выделен и разработан способ выделения белка обладающий
противораковой активностью, и получен патент на изобретение Агентства по
интеллектуальной собственности Республики Узбекистан (26.04.2012, №IAP
04501). В результате научно-исследовательских работ разработана
лекарственная форма в виде таблетки для лечения онкологических
заболеваний;
данные по комплексу белков выделенные из сои зарегистрированы в
базе данных EMBL (http://www.ebi.ac.uk), установлена противоопухолевая
активность препарата «Биокор-0,2г» на перевиваемых опухолевых штаммах
АКАТОЛ, АКАТОН, Меланома В-16 и Саркома 180. Препарат «Биокор-0,2г»
способствует восстановлению иммунного статуса животных получавших 5-
фторурацил, увеличивает лечебное действие противоопухолевых препаратов
и регулирует иммунитет у животных-опухоленосителей. Результаты научных
исследований позволят создать новое направление в лечении онкологических
заболеваний на основе растительных белков и создание эффективных
лекарственных средств.
Апробация работы.
Результаты исследований по теме диссертации,
изложены в виде докладов и прошли апробацию на 23 международных и
республиканских научно-исследовательских конференциях, в частности на:
37
III конгрессе онкологов закавказских государств (Ереван, 2004),
Конференции «Актуальные проблемы последипломной подготовки врачей и
новые
горизонты
медицины»
(Ташкент,
2007);
XI
Российском
онкологическом конгрессе (Москва, 2007); Материалы научно-практической
конференции «физико-химическая биология и перспективы биотехнологии»
(Андижан, 2007); V-съезде онкологов и радиологов СНГ (Ташкент, 2008);
конференция «Актуальные проблемы химии природных соединений»
(Ташкент,
2009,
2010,
2011,
2012),
Международном
конгрессе
«Биотехнология – состояние и перспективы развития» (Москва, 2009);
Научно-практической конференции «Биологически активные вещества:
фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения»
(Украина, 2009г, 2011); Российской научно-практической конференции с
международным участием «Современная онкология: достижения и
перспективы развития» (Томск, 2009); 6-й Российской конференции по
фундаментальная
онкологии
(Санкт-Петербург,
2010),
14-й,
15-й
Международной Пущинской школе – конференция молодых учёных
«Биология – наука XXI века» (Москва, 2010, 2011); Конференция
«Актуальные проблемы развития биоорганической химии» (Ташкент 2010);
X,XIВсероссийской научной- практической конференции с международным
участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2011,
2012.); Седьмой конференции «Фундаментальная онкология – петровские
чтения» (Санкт-Петербург, 2011); II Конгрессу онкологов Узбекистана
(Ташкент, 2011); 8-й конференции по фундаментальной онкологии
«Петровские чтения (Москва, 2012); Белорусско-Российской научно
практической конференция с международным участием «Отечественные
противоопухолевые препараты» (Минск, 2013).
Опубликованность результатов.
По материалам диссертации
опубликовано 48 печатных работ. Из них 13 научных статей, в том числе 9 в
республиканских и 4 в зарубежных журналах, рекомендованных Высшей
аттестационной комиссией Республики Узбекистан для публикации основных
научных результатов докторских диссертаций, получен патент на
изобретение.
Структура и объем диссертации.
Структура диссертации состоит из
введения, пяти глав, заключения, списка литературы. Объем диссертации
составляет 195 страниц.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ
Во введении
обосновывается актуальность и востребованность
проведенного исследования, цель и задачи исследования, характеризуются
объект и предмет, показано соответствие исследования приоритетным
направлениям развития науки и технологий Республики Узбекистан,
излагаются научная новизна и практические результаты исследования,
38
раскрываются научная и практическая значимость полученных результатов,
внедрение
в
практику
результатов
исследования,
сведения
по
опубликованным работам и структуре диссертации.
В первой главе диссертации «
Соевые бобы: характеристика и
значение в профилактике и лечении различных заболеваний»
приведен
подробный обзор литературы, посвященный исследованию белков и пептидов
в биотерапии опухолей, применение иммуномодуляторов при лечении
онкологических больных, лекарственные средства на основе производных
сои в терапии различных заболеваний.
Во второй главе диссертации
«Материал, условия и методы
исследования белкового комплекса препарата Биокор-0,2г»
подробно
описаны методы выделения белкового комплекса из бобов сои, изложены
электрофоретические,
радиометрические,
масс-спектрометрические,
иммунологические, определение биологической активности белкового
препарата на экспериментальных опухолевых штаммах, фармако
токсикологические и гистологические.
В третьей главе диссертации
«Физико-химическая характеристика
белкового комплекса и его биологическая активность»
приведены
результаты
исследований
физико-химической
характеристики
и
биологической активности препарата «Биокор-0,2г» на экспериментальных
опухолевых штаммах.
Хроматография белков и физико-химической характеристика белков.
В
настоящее время в мире проводится большое количество исследований по
изучению влияния сои и её компонентов на течение канцерогенеза [Крутяков
2001; Немцова и др., 2002]. Проводимые исследования показывают, что
компоненты сои способны ингибировать пролиферацию опухолевых клеток,
индуцировать апоптоз в трансформированных клетках, и действуют они на
опухолевые клетки, и токсические эффекты в отношении нормальных тканей
организма минимальны [Залеток и др., 2006; Казачкина и др., 2006].
В связи с этим является актуальным, выделение белкового комплекса
из сои для исследования их противоопухолевой активности. Выделение
белков из бобов сои проводили двумя методами экстракции раствором 0,06М
раствора хлористого натрия 0,05М Трис буфером pH 7,4. Для тестирования
противоопухолевой активности белков нами была использована модельная
тест-система для отбора противоопухолевых веществ in vitro на клеточной
линии меланомы мышей КМЛ - штамм меланомы мышей В-16 [Кузнецова и
др., 2005]. Были выбраны носители для гельфильтрации сефадексы G-75 и
G-50, позволяющие провести эффективное разделение [Остерман, 1983].
Хроматограммы гельфильтрации белков представлены на рисунках 1 и
2. На обоих носителях элюировалось по три фракции. Определение
активности фракций по включению
14
С-тимидина, показало, что наибольшей
39
активностью 64,0±1,9%в дозе 100 мкг/мл обладала первая фракция после
гельфильтрации на колонке с сефадексом G-75.
D
2
80 D
2
80
2,5
2
1
2
1,5
1
0,5
3
0
0 200 400 600 800 1000 1200
Объем элюции, мл
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
2
Рис.1. Гельфильтрация
белка из сои на колонке с
сефадексомG-75 (80 x 2,6),
0,05М Трис -HCl буфер pH
7,4
Рис.2. Гельфильтрация
белка из сои на колонке с
сефадексомG-50 (80 x 2,6),
0,05М Трис -HCl буфер pH
7,4
0.2
1
3
0
-0.2
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Объем
элюции
Электрофоретические
исследования
белковых
фракций
после
гельфильтрации, показало, что наиболее эффективное разделение белков на
сефадексе G-75.
Компонентный состав первой фракции представлен ярко выраженными
полипептидами с молекулярной массой 12,7, 13,0, 15,0, 67,0, 79,0 кДа. При
гельфильтрации на колонке с сефадексом G-50 разделение белков не
эффективное, спектр белков всех трех фракций практически одинаков.
Затем было проведено изоэлектрофокусирование активной белковой
фракции. Наблюдалось наличие четырех изоточек в области pI -4,1, 4,2, 4,5 и
4,7 (рис.3).
1 2I/M _
9,45
Рис. 3. Изоэлекторофокусирование
активной фракции белка после
гельфильтрации на колонке с G-75
(амфолины в диапазоне pH 3,5-10
4,7
4,5
4,2
4,1
+
1-Фракция I
2-Свидетели изофокусирования.
3,50
40
Активная белковая фракция стандартизированая на пяти сериях
лабораторных образцов, получила название препарата «Биокор-0,2г» (рис. 4).
кДа 1 2 3 4 5 6 7 _
67,0
25,0
12,5
+
Рис. 4. Электрофорез в 10% ПААГ в
присутствии ДСН субстанции Биокор:
1-смесь белков-маркеров (БСА-67 кДа,
Химотрипсиноген-25 кДа, Цитохром С
12,5кДа), 2–РСО, 3-7 – пять серий
опытных образцов препарата.
Определен аминокислотный состав активной белковой фракции (табл. 1).
Таблица 1.
Аминокислотный состав активной белковой фракции
Аминокислоты Процентное содержание
Аминокислоты Процентное содержание
Ala
5,30
Leu
9,04
Arg
10,08
Lys
4,90
Asp
11,09
Met
1,40
Val
5,06
Pro
5,19
His
3,57
Ser
4,85
Glu
16,03
Tyr
3,09
Gly
4,05
Thr
4,90
Ile
3,01
Phe
4,05
Σ 95,99%
Определение антитрипсиновой активности препарата «Биокор-0,2г».
Важную роль в опухолевом росте играют сериновые протеазы, содержащие в
своем активном центре серин (трипсин, химотрипсин, калликреин, плазмин,
тромбин), и металлопротеиназы, содержащие Zn
2+
в активном центре [Nagase,
et al, 1994].
В связи с этим, был проведен эксперимент по определению
антитрипсиновой активности препарата «Биокор-0,2г» (табл. 2). Из
табличных
данных
видно,
что
«Биокор-0,2г» обладает высокой
ингибирующей активностью по отношению к сериновым протеазам от
24,1±0,1 до 34,7±0,1, что предполагает противоопухолевые свойства
препарата.
Таблица 2.
Ингибирование протеазной активности сериновых протеаз Биокором
Сериновые протеазы
Ингибирование активности сериновых протеаз
Условные единицы
протеолитической активности,
поглощение λ 280
% ингибирования
41
Трипсин
0,145±0,002
34,7±0,1
Химотрипсин
0,156±0,003
29,4±0,2
Плазмин.
0,167±0,002
24,1±0,1
Контроль*
0,220±0,002
0
*3,0 мкг протеаз, в 0,05М фосфатном буфере pH 7,6; субстрат-казеин 300,0 мкг, (
*
- p<0,05).
Масс-спектрометрический анализ пептидов субстанции препарата Биокор
Методом двумерного гель-электрофореза в сочетании с масс
спектрометрическим методом были определены белки входящие в состав
препарата Биокор. Было подтверждено наличие в препарате ингибиторов
протеаз –Kunitz trypsin protease inhibitor. Данные приведены в таблице 3.
Таблица 3.
Масс-спекримический анализ препарата Биокор
Идентифицированные белки
ID
Mr(Da)
Score
Sequence
Coverag %
Kunitz trypsin protease inhibitor
Glycine max
22676,1
339,17
50
Beta- conglycinin alpha subunit
Glycine max
72475,7
375,39
43
Beta-amylase
Glycine max
57000,0
205,59
52
2,4-D inducible glutathione
S transferase
Glycine max
49000,0
78,66
23
PR10-like protein
Glycine max
3865,99
55,42
29
24 kDa protein SC24
Glycine max
24569,7
52,27
17
Примечание: ID – аббревиатура названия белков в соответствии с базами данных
NCBI; Mr – молекулярная масса белков; Score-10xlgP, где Р – вероятность того, что белок,
который был сопоставлен масс-спектру из баз данных, является неверным. Все результаты
поиска белков со значением Score больше 50 являются достоверными; SequenceCoverag –
процент покрытия аминокислотной последовательности белка по базам данных.
Достоверным считается показатель от 15 до 90%.
Исследование противоопухолевой активности субстанции Биокор в
экспериментальном канцерогенезе на перевиваемых опухолевых штаммах
аденокарцинома толстого кишечника (АКАТОЛ), аденокарцинома тонкого
кишечника (АКАТОН), меланома В-16 и саркома 180.
Торможение роста опухоли по массе и объему.
Отработку дозы введения препарата «Биокор-0,2» проводили на штамме
аденокарцинома толстого кишечника (АКАТОЛ). Экспериментальные
животные были разбиты на 4 опытные группы: I группа – животные
получали препарат «Биокор-0,2г» per os 10 дней каждый день однократно в
дозе 125 мг/кг; II группа – животные получали «Биокор-0,2г» per os 10 дней
каждый день однократно в дозе 150 мг/кг; III группа – животные получали
«Биокор-0,2г» peros 10 дней каждый день однократно в дозе 250 мг/кг; IV
группа –контроль, животным вводили каждый день per os физиологический
раствор NaCl.
«Биокор-0,2г» в дозе 150 мг/кг в случае применения peros показал
наибольшую эффективность и ингибировал рост опухоли АКАТОЛ по массе
42
на 71,9%, при снижении дозы воздействия до 125 мг/кг ингибирование роста
опухоли по массе уменьшалось до 57,68%. Повышение дозы введения до 250
мг/кг не привело к повышению ингибирования опухоли по массе и составило
69,8%.
Во всех опытных группах животных, принимавших «Биокор-0,2г»,
наблюдается значительное достоверное снижение объема опухоли, что может
объясняться положительным влиянием протеина на процессы экссудации
инейтрофильной инвазии. Самый значительный противоопухолевый эффект
наблюдается у животных из опытных групп II и III - 88,46%. В группе I
ингибирование роста объема опухолевой ткани составило 61,4%.
Полученные результаты показали, что оптимальной дозой введения «Биокор
0,2г» а, является доза 150 мг/кг.
Дальнейшие исследования влияния «Биокор-0,2г» проводили на
штаммах аденокарцинома тонкого кишечника (АКАТОН), меланома В-16 и
саркома 180.
На рисунке 5. представлены результаты торможения роста опухоли на
всех четырех штаммах.
Рис 5. Изменение массы и объема
опухоли экспериментальных жи
вотных на различных штаммах
после введения субстанции в дозе
150 мг/кг ко дню окончания
эксперимента (* - p<0,05).
Препарат«Биокор-0,2г» при монотерапии тормозит рост исследуемых
опухолей по массе и объему более чем на 70%.
Подсчет митотического и апоптотического индексов в опухолевой
ткани после введения препарата«Биокор-0,2г»
Метрические данные массы и объема опухоли не всегда адекватно
способны отразить процессы прогрессии или регрессии опухолевой ткани.
Более объективную картину о пролиферативной активности опухолевых
клеток дает подсчет количества митозов в опухолевой ткани - ее
митотический индекс (МИ). Другим параметром, отражающим процессы
гибели опухолевых клеток, является апоптотический индекс (АИ).
Отношение апоптозного индекса (АИ) к митотическому индексу (МИ)
(АИ/МИ) демонстрирует степень регрессии или прогрессии опухолевой
ткани. В случае если значения АИ/МИ превышают единицу, наблюдается
регрессия опухоли.
В опытной группе на штамме АКАТОЛ наблюдалась высокая регрессия
опухолевой ткани. Отношение АИ/МИ в опыте составило 2,08, в то
43
время как в контроле – 0,89. На штамме Меланома В-16 отношение АИ/МИ в
опыте составило 15,18, в контроле – 0,74.На штамме АКАТОН отношение
АИ/МИ в опыте составило 1,75, в контроле – 0,81.На штамме Саркома
180отношение АИ/МИ в опыте составило 3,6, в контроле – 0,86.
Как видно из представленных результатов, во всех опытных группах
наблюдается достоверная регрессия опухолевой ткани, т.е. количество
апоптозных клеток превышает количество митотически делящихся раковых
клеток, тогда как в контрольной группе экспериментальных животных
значение АИ/МИ меньше 1,0.
Изучение ингибирующего действия «Биокор-0,2г
»
на клетки красного
костного мозга в условиях экспериментального канцерогенеза.
Применение
любого терапевтического вещества, обладающего цитотоксическим
эффектом в отношении опухолевых клеток, создает риск снижения
пролиферации и нормальных высокопролиферирующих клеток организма.
Одной из первоочередных мишеней такого побочного влияния препаратов
являются клетки красного костного мозга, нарушение пролиферации которых
приводит к серьезным негативным последствиям для процессов гемопоэза и
эффективной работы иммунной системы [Васильев, 1997].
Для определения пролиферативной активности клеток костного мозга
использовали прямой метод часового культивирования клеток для
хромосомного
анализа
по
Фитцжералъду.
В
исследованиях
противоопухолевых свойств «Биокор-0,2г» нами проводилось изучение
ингибирующего действия этого белка на пролиферацию клеток красного
костного мозга в условиях экспериментального канцерогенеза на моделях
опухоли АКАТОЛ, АКАТОН, Меланома В-16 и Саркома 180. На рисунке 6.
приведены результаты подсчета МИ в красном костном мозге
экспериментальных животных. Как видно из данных диаграммы, «Биокор
0,2г» не ингибировал пролиферацию клеток красного костного мозга.
5
4
3
МИ%
опыт 2
контроль
1
Рис. 6. Митотический индекс (МИ)
клеток красного костного мозга
эксперимен тальных животных с импла
нтированной опухолью после введения
биокора ко дню
0
АКАТОЛ АКАТОН Меланома В-16 Саркома 180
окончания эксперимента (* - p<0,05).
44
Влияние препарата «Биокор-0,2г» на гематологические показатели и
морфологическую картину крови мышей с экспериментальной моделью
опухоли Саркома 180.
Исследования проводили в цельной крови мышей. Животные были
разделены на следующие группы: интактные животные, контрольная группа
(модель с имплантированной опухолью) и группа животных, получавших
препарат в дозе 150 мг/кг per os. Введение препарата начали на 10 день после
перевивки опухоли и продолжали ежедневно в течение 10 дней (табл. 4).
Таблица 4
Влияние применения препарата «Биокор-0,2г» на гематологические
показатели
и
морфологическую
картину
крови
мышей
с
экспериментальной моделью опухоли Саркома 180
Наименование исследования
Группы животных
Интактная
Контрольная
Леченая
Лейкоциты
7,95±0,61
20,4±3,64*
11,2±2,48**
Лимфоциты
5,1±0,16
3,5±0,46*
4,0±0,15
Клетки средних размеров
1,45±0,12
1,7±0,5
1,2±0,1
Гранулоциты
1,9±0,08
3,03±0,2*
2,97±0,26*
Процент лимфоцитов
57,0±2,45
38,3±0,66*
45,3±1,2**
Клетки средних размеров, %
17,6±1,06
14,2±1,09
13,1±2,0
Гранулоциты, %
22,4±1,31
44,8±1,13*
47,2±4,19*
Палочкоядерные Процент
1,5±0,4
7,3±2,91*
5,0±2,08*
Сегментоядерные Процент
34,0±1,63
48,0±2,31*
50,7±3,84*
Гемоглобин
130,3±8,89
122,5±5,31
141,0±7,58**
Эритроциты
7,98±0,71
7,98±0,26
9,06±0,48
Примечание: *Р≤0,05 по сравнению с интактными животными, ** Р≤0,05 по сравнению с
контрольной группой
Отмечается также улучшения гематологических и морфологических
показателей крови (нормализация процентного содержания лейкоцитов,
повышения уровня гранулоцитов, содержания гемоглобина и числа
эритроцитов).
Стандартизированная комбинация полипептидов обладает не только
выраженным
противоопухолевым
эффектом,
но
и
участвует
в
восстановление иммунной системы организма, улучшает гематологические
показатели крови.
Изучение
противоопухолевой
активности
«Биокор-0,2г
»
на
экспериментальных животных с перевитыми штаммами при позднем
введении препарата.
Эксперименты по изучению продолжительности жизни животных
при действии вышеназванного препарата проводились аналогично, как и в
случае изучения торможения роста опухоли по массе и по объему. Введение
препарата осуществлялось на 10 сутки после перевивки опухоли.
45
Проведенное изучение противоопухолевой активности соевого биокора
на перевиваемых штаммах АКАТОЛ, АКАТОН, Меланома В-16 и Саркома
180 по показателям эффективности торможения роста опухоли (ТРО) и
увеличения продолжительности жизни (УПЖ) экспериментальных животных
показало позитивное действие данного белка при его введении на 10-й день
после перевивки опухоли более 60% и 30% соответственно (табл. 5). Ревизия
внутренних
органов
в
экспериментах
по
изучению увеличения
продолжительности
жизни
экспериментальных
животных
показало
единичные случаи метастазирования на 10-й день после перевивки опухоли.
Ингибиторы протеаз, содержащиеся в белковом комплексе «Биокор-0,2г»,
способствуют снижению метастазирования.
Таблица 5
Изучение противоопухолевой активности «Биокор-0,2г» при позднем его
введении (на 10 день после перевивки опухоли) по показателям
торможения роста опухоли и увеличению продолжительности жизни
животных
Эксперимен
тальные штаммы
ТРО по объему %
ТРО по массе %
УПЖ
%
АКАТОЛ
91,40
66,35
38,34
АКАТОН
60,95
47,17
49,83
Меланома В-16
56,35
60,06
30,59
Саркома 180
63,84
61,63
35,90
Изучение противоопухолевой активности «Биокор-0,2г»при совместном
введении с 5-фторурацилом на перевиваемые опухоли мышей
Препарат
5-фторурацил (5-ФУ) в дозе 228 мг/кг внутрибрюшинно вводился животным
на 3, 5 и 9 день после трансплантации опухоли, «Биокор 0,2г» в дозе 150
мг/кг перорально в течение 10 дня, начиная со вторых суток после
трансплантации опухоли. Затем после естественной гибели животных во
всех группах подсчитывались показатели ТРО, средней продолжительности
жизни и на их основе рассчитывали увеличение продолжительности жизни
по сравнению с контрольной группой. Изучение противоопухолевой
активности белкового препарата при совместном введении с 5-фторурацилом
на перевиваемые опухоли мышей на ранних сроках введения. Препарат
показал высокую противоопухолевую активность на уровне цитостатика.
Введение соевого белка в комплексной терапии с 5- фторурацилом усиливает
противоопухолевое воздействие в среднем от 10 до 25% (табл. 6). Эффект
комплексного применения противоопухолевого цитостатика и биокора был
еще более существенным выживаемость подопытных животных увеличилась
от 30 до 60% в зависимости гистогенезиса опухоли (табл. 7). Совместное
введение субстанции препарата «Биокор-0,2г» и 5-фторурацила приводит к
снижению токсического
46
действию последнего и увеличению торможения роста опухоли, увеличению
продолжительности жизни экспериментальных животных-опухоленосителей.
Таблица 6
Изучение противоопухолевой активности белкового препарата при
совместном введении с 5-фторурацилом на перевиваемые опухоли
мышей
Вид
опухоли
Препарат
Доза
Кол-во
введений
Средняя
масса
опухоли (г)
ТРО по
массе %
АКАТОН
Контроль
5-ФУ
5-ФУ+БП
БП
228 мг/кг
228мг/кг+150мг
/кг 150 мг/кг
3
3+10
10
1,24±0,48
0,32±0,1
8*
0,09±0,0
6*
0,36±0,2
3*
74,2
92,7
71,0
АКАТОЛ
Контроль
5-ФУ
5-ФУ+БП
БП
228 мг/кг
228
мг/кг+150мг/кг
150 мг/кг
3
3+10
10
0,87±0,31
0,12±0,0
3*
0,07±0,0
1*
0,25±0,1
9*
86,2
91,9
71,3
Саркома
180
Контроль
5-ФУ
5-ФУ+БП
БП
228 мг/кг
228мг/кг+150мг
/кг 150 мг/кг
3
3+10
10
1,8±0,38
0,16±0,0
5*
0,12±0,0
4*
0,19±0,0
8*
91,1
93,3
89,4
Мелано
ма В-16
Контроль
5-ФУ
5-ФУ+БП
БП
228 мг/кг
228мг/кг+150мг
/кг 150 мг/кг
3
3+10
10
1,7±0,23
0,62±0,1
2*
0,40±0,1
1*
0,66±0,1
3*
63,4
76,4
61,2
Для всех значений опытных групп *p<0,05 по отношению к контролю.
Таблица 7
Изучение увеличения продолжительности жизни белкового препарата
при совместном введении с 5-фторурацилом на перевиваемые опухоли
мышей
Вид
опухоли
Препарат
Доза
Кол-во
введений
СПЖ
(дней)
УПЖ %
АКАТОН
Контроль
5-ФУ
5-ФУ+БП
БП
228 мг/кг
228 мг/кг+150
г/кг 150 мг/кг
3
3+21
21
25,1±1,25
33,5±1,67
37,3±1,72
26,6±1,33
33,4
48,6
35,5
АКАТОЛ
Контроль
5-ФУ
5-ФУ+БП
БП
228 мг/кг
228 мг/кг+150
г/кг 150 мг/кг
3
3+21
21
17,7±1,35
30,5±1,52
27,5±1,26
30,6±1,51
72,3
55,3
72,8
Саркома
180
Контроль
5-ФУ
5-ФУ+БП
БП
228 мг/кг
228 мг/кг+150
г/кг 150 мг/кг
3
3+21
21
36,6±1,83
50,3±2,52
65,3±3,26
56,3±2,81
37,4
78,4
53,8
Меланома Контроль
23,4±1,17
47
В-16
5-ФУ
5-ФУ+БП
БП
228 мг/кг
228 мг/кг+150
г/кг 150 мг/кг
3
3+21
21
30,8±1,52
41,8±2,06
30,6±1,53
31,6
78,6
30,7
Изменение иммунного статуса у животных-опухоленосителей при
введении «Биокор-0,2г».
После трансплантации опухоли штамма Саркома 180 беспородным
мышам на 3-, 5-, и 9-й день внутрибрюшинно вводили 5-фторурацил в дозе
228 мг/кг, на 2-21-й день – перорально «Биокор-0,2г» в дозе 150 мг/кг. Метод
оценки иммунного статуса основан на количественном тестировании
субпопуляций лимфоцитов со специфическими для каждого вида
рецепторами – кластерами дифференцировки (CD) [Залялиева, 2004].
Использовались CD-маркеры: CD3, CD4, CD8, CD16, CD19
.
Фагоцитарную
активность
нейтрофилов (ФАН) определяли по их способности
фагоцитировать нейтральные частицы латекса (1,5 мк) в процентах.
Рис. 7. Влияние 5-фторурацила
и препарата Биокор-0,2 на
иммунологические показатели
животных-опухоленосителей
Введение
цитостатиков
снижает
процентное
содержание
и
функциональную активность Т-лимфоцитов CD3+, CD4+, CD8+, а также
естественных факторов защиты (ФАН, CD16+) (рис. 7). «Биокор-0,2г»
снижает токсическое и иммунодепрессивное действие цитостатика и тем
самым усиливает противоопухолевый эффект, восстанавливает индекс
иммунорегуляции (табл. 8).
Таблица 8
Влияние 5-фторурацила и препарата Биокор-0,2г на индекс
иммунорегуляции
Интактные
животные
Опухоле
носители
5-ФУ
5-ФУ+Биокор
Биокор
ИРИ
1,63±0,1
0,5 ±0,01
0,6 ±0,01
1,1 ±0,1
1,2 ±0,1
«Биокор-0,2г»
способствует
восстановлению иммунного статуса
животных-опухоленосителей, получавших 5-фторурацил. «Биокор-0,2г»
модулирует лечебное действие противоопухолевых препаратов и регулирует
иммунитет у животных-опухоленосителей.
48
Модификация роста экспериментальных опухолей под воздействием
лучевой терапии и «Биокор-0,2г».
Лучевую терапию проводили при тотальном гамма-облучении в дозе 2
Гр через 52 ч после перевивки опухоли. «Биокор-0,2г» вводили перорально
десятикратно в дозах 150 мг/кг, начиная со вторых суток после
трансплантации опухоли. Животных забивали на 14 день эксперимента под
хлороформенным
наркозом.
Эффект
противоопухолевого
действия
оценивали по массе (М) и объему (V) извлеченной опухолевой ткани.
Результаты исследования показали, что тотальное облучение в дозе 2
Гр тормозит рост опухоли Саркома-180 до 48% по массе и до 52% по объему
(табл. 9). Воздействие на рост опухоли совместно с облучением «Биокор-0,2
г» повышает эффективность лечения ТРО по массе до 85% ТРО по объему до
97%. С опухолью АКАТОЛ, тотальное облучение вызывает торможение
роста опухоли по массе до 37% и по объему - до 70%. Воздействие препарата
усиливает противоопухолевый эффект облучения. ТРО по массе составило
91%, а по объему - 88%.
С опухолью АКАТОН, тотальное облучение задерживает рост опухоли
до 64% по массе и до 91% по объему. Воздействие «Биокор-0,2г» также
приводит к увеличению противоопухолевого эффекта облучения: ТРО по
массе составило 70%, а по объему - 97%.
Проведенные исследования свидетельствует о том, что дополнение
противоопухолевого
лечения
«Биокор-0,2г»
позволяет
повысить
эффективность лучевой терапии экспериментальных опухолей животных.
При этом положительный эффект лечения, проявляющийся в усилении
регрессии опухоли, зависит от гистогенеза опухоли.
Таблица 9
Влияние Биокора и облучения на рост перевиваемых опухолей
Опухоль
Группа/пре
па раты
Средняя
масса
опухоли, г
Средний
объем
опухоли, см3
ТРО, по
массе,%
ТРО по
объему,%
Саркома 180
контроль
0,74±0,16
0,93 ±0,28
-
-
ϒ
0,38±0,12*
0,45 ±0,25*
48
52
ϒ
+БП
0,11±0,02* **
0,02 ±0,01 *
**
85
97
АКАТОЛ
контроль
1,87±0,32
3,72 ±0,80
-
-
ϒ
1,16±0,34*
1,12 ±0,35 *
38
70
ϒ
+БП
0,17±0,09 *
**
0,44 ±0,43 *
91
88
АКАТОН
контроль
1,75±0,53
2,75 ±1,10
-
-
ϒ
0,63±0,22*
0,25 ±0,16 *
64
91
ϒ
+БП
0,52±0,19 *
0,09 ±0,06 *
**
70
97
Примечание: *Р≤0,05 по сравнению с 1 группой (нелеченные животные), ** Р≤0,05
группой (животные, получавшие лучевую терапию).
49
В четвертой главе диссертации
«Исследование противоопухолевой
активности «Биокор-0,2г»в экспериментах
in vitro
(рак молочной железы,
рак эндометрия и толстого кишечника)»
подробно описаны результаты
влияние субстанции препарата «Биокор-0,2г»
in vitro
на индукцию апоптоза и
ингибирование пролиферации раковых клеток биопсийного материала на
разных стадиях развития заболевания.
Исследование противоопухолевой активности «Биокор-0,2г»на клетки
рака молочной железы резистентных к традиционной терапии.
У больных
распространенным раком молочной железы особенно актуальным является
определение гормональной и лекарственной чувствительности опухолей для
индивидуального подбора схем терапии [Петров, 2000; Пожарисский,
Леенман, 2000]. Отсутствие на поверхности клеток рака молочной железы
рецепторов к эстрогену и прогестерону не позволяет придерживаться
традиционной терапии этого заболевания и требует изменения
фармакологического воздействия, при этом, данная патология встречается
приблизительно у 15% пациентов [Герштейн, Кушлинский, 2002]. После
получения опухолевого материала у больных раком молочной железы
проводили его исследование на наличие рецепторов к эстрогенам и
прогестерону. Были использованы мышиные моноклональные антитела
против рецепторов к эстрогенам (клон 6F11) и мышиные моноклональные
антитела против рецепторов к прогестерону (клон 1A6) производства фирмы
«Novoсastra» (Англия). Образцы опухолевой ткани разделяли на группы с
наличием и отсутствием рецепторов к прогестерону и эстрогенам, после чего
оба типа опухолевых клеток культивировали
in vitro
в ростовой среде. Как
видно из представленных данных, «Биокор-0,2г», при отсутствии рецепторов
к эстрогенам и прогестерону на поверхности опухолевых клеток, способен
значительно ингибировать пролиферацию клеток рака молочной железы (рис.
8, 9).
При влиянии «Биокор-0,2г» на клетки рака молочной железы в
концентрации 50 мкг/10
6
клеток и 100 мкг/10
6
клеток значительное количество
опухолевых клеток оказывалось погибшими (степень деструкции равнялось
28,87%±5,38 и 36,2%±11,47 соответственно), тогда как в концентрации 10
мкг/10
6
клеток аналогичный эффект практически не
проявлялся и
цитотоксическое действие белка было близко к контролю (6,0%±0,98).
Bcl-2 является ведущим геном, определяющим механизм клеточной
смерти, подавляя апоптоз. Этот ген кодирует образование белка,
накапливающегося в митохондриях [Безбородова, 2004; Казачкина, 2006].
Экспрессия Bcl-2 связана с факторами, указывающими на благоприятный
прогноз, так как коррелирует с наличием рецепторов к стероидным гормонам
и низкой степенью злокачественности [Gallo, 2006]. При этом этот белок
проявил ярко выраженное доз зависимое действие.
50
40
30
СД
%
20
10
0
10 12,215,5
10
мкг
/
млн
клеток
50
мкг
/
млн
клеток
100
мкг
/
млн
клеток
…
Рис. 8. Степень деструкции
слоя клеток рака молочной
железы с наличием
рецепторов к эстрогенам и
прогестерону при
воздействии Биокора-0,2г.
Для всех значений
опытных групп p<0,05..
Рис. 9. Степень деструкции
слоя клеток рака молочной
железы с отсутствием
рецепторов к эстрогенам и
прогестерону при
воздействии биокора. Для
всех значений опытных
групп p<0,05..
Было проведено исследование экспрессии протеина Bcl-2 на клетках
рака молочной железы с отсутствием рецепторов к эстрогенам и
прогестерону до, и после воздействия «Биокор-0,2г».
Воздействие «Биокор-0,2г» во всех концентрациях привело к
уменьшению количества белка Bcl-2 в клетках молочной железы в среднем
на 27,25
±
1,14%, p<0,05 (рис. 10).
400
300
Н
-
баллы
200
100
0
288
217,2
205 206,4
Рис. 10. Количественные
изменения протеина bcl-2 в
клетках рака молочной
железы с отсутствием
рецепторов к эстрогенам и
прогестерону при
воздействии биокора in
vitro. Для всех значений
опытных групп p<0,05.
10 50 100
контроль
доза
воздействия
препарата
Биокор
,
мкг
/
млн
…
Влияние «Биокор-0,2г»а на клетки рака молочной железы при поздних
стадиях заболевания
Мы использовали образцы опухолевой ткани, в которых прослеживалась
злокачественная трансформация клеток молочной железы, третья стадия
заболевания.
51
Опухолевые клетки, полученные из операционного материала больной
Г., 68 лет, диагноз – рак левой молочной железы, T
2
N
1
M
0
(Т - размер опухоли,
N – увеличение региональных лимфотических узлов, М – обнаружение
отдаленных метастаз), вносили в лунки полистиролового планшета, куда
после образования клеточного слоя средней плотности
добавляли
«Биокор-0,2г» в дозах 100 мкг/млн клеток (группа I) и 50 мкг/млн клеток
(группа II), контролем служили клетки рака молочной железы без
воздействия «Биокор-0,2г» (группа III), время инкубации клеток с протеином
составило 60 мин. Результаты цитотоксической активности препарата в
отношении клеток рака молочной железы приведены на рис. 11.
Как видно из полученных данных «Биокор-0,2г» в дозе 100 мкг/млн
клеток показал высокую противоопухолевую активность, вызывая гибель в
общей сложности 64% раковых клеток, в том числе индуцируя апоптоз у 12%
клеток. С уменьшением дозы воздействия протеина уменьшается и его
противоопухолевая активность, так, в дозе воздействия «Биокор-0,2г» 50
мкг/млн клеток, белок вызывал гибель у 38% раковых клеток.
120
100
80
%
60
52
33
72
36
98
мертвые клетки
живые клетки
апоптозные клетки
Рис. 11.
Цитотоксичес
кая
активность
Биокор-0,2г в
отношении
клеток рака
молочной
40 20 0
12 5
0 2
железы (операцио-нный
материал больной Г., 68
лет, диагноз – рак
группа I (100 мкг/млн клеток) группа II (50 мкг/млн клеток) группа III (контроль)
левой молочной железы, T
2
N
1
M
0
).
Для всех значений опытных групп
p<0,05.
Исследование противоопухолевой активности «Биокор
0,2г»анаклетки рака эндометрия матки
Рак эндометрия (РЭ) занимает первое место в структуре
онкогинекологической патологии, темпы роста показателей заболеваемости РЭ
значительно выше таковых при других злокачественных опухолях
репродуктивной системы у женщин [Imyanitov et.al, 2005]. В образце
наблюдалось
предраковое
состояние
ткани
эндометрия,
пациентку
оперировали с диагнозом миома матки. В дозе 20 мкг на 1 млн клеток белок
вызывал гибель 89,0±0,98% опухолевых клеток. Также отмечалось появление
апоптозных клеток в опытных группах при воздействии «Биокор-0,2г»
(рис.12).
Результаты цитотоксической активности «Биокор-0,2г» в отношении
клеток эндометрия приведены, полученные из операционного материала
больной с диагнозом рак эндометрия II стадии, T
2
N
1
M, показаны на рис. 13.
Как видно из полученных данных, соевый протеин во всех использованных
дозах проявил высокую цитотоксическую активность в отношении клеток
рака эндометрия, в дозе 20 мкг на 1 млн клеток белок вызывал гибель
42,0±1,56% опухолевых клеток, в дозе 50 мкг - 50,0±1,58%. В этом случае
воздействие протеином на клетки рака эндометрия также отмечалось
52
значительное повышение количества апоптозных клеток в опытных группах,
наибольшее количество таких клеток наблюдалось при воздействии белком в
дозе 20 мкг – 32,0±1,47%, тогда как в контрольной группе апоптозных клеток
было 11,0±0,98%.
Рис. 12. Цитотоксическая
активность Биокора-0,2г в
отношении клеток эндомет
рия (операционный мате
риал пациентки с диагно
зом миомы матки). Для
всех значений опытных
групп p<0,05
Рис.13. Цитотоксическая
активность Биокора-0,2г в
отношении клеток рака
эндометрия II стадии
(операционный материал
пациентки с диагнозом рак
эндометрия, T
2
N
1
M
0
). Для
всех значений опытных
групп p<0,05.
Исследование противоопухолевой активности «Биокор-0,2г» на
клетки рака прямой кишки
Одной из особенностей динамики онкологической заболеваемости
последних десятилетий явился рост заболеваемости раком ободочной и
прямой кишки. В настоящее время рак толстого кишечника составляет почти
15% всех злокачественных опухолей в западноевропейских странах. Он
занимает второе место в структуре онкологической заболеваемости как у
мужчин (после рака легкого), так и у женщин (после рака молочной железы)
[Smith et al, 2009].
В опухолевой ткани, полученной из операционного материала больного
М.Р., 68 лет, диагноз – рак прямой кишки, T
4
N
0
M
0
, определили экспрессию
онкопротеинов
Вcl-2
и
Ki-67. Раковые клетки прямой кишки
экспрессировали в значительной степени как протеин Вcl-2, так и протеин
Ki-67. Экспрессия Вcl-2 составила 97,0±0,76%, что говорит о сильном
торможении процессов апоптоза в клетках данного гистогенеза. Экспрессия
протеина
Ki-67
составила
64,0±2,14%.
Проведенный
иммуногистохимический анализ показал, что раковые клетки прямой кишки
представляли собой высокопролиферирующую ткань с практически
отсутствующими апоптозными клетками, резистентную к традиционной
53
терапии. После установления статуса онкопротеинов Вcl-2 и Ki-67 на клетки
рака прямой кишки воздействовали соевым биокором в дозах 50 мкг/1,2 млн
клеток (группа I), 100 мкг/1,2 млн клеток (группа II), контролем служили
клетки рака прямой кишки без воздействия «Биокор-0,2г» (группа III), время
инкубации раковых клеток с протеином составило 60 мин.
Как видно из полученных данных «Биокор-0,2г» в дозе 50,0 мкг/1,2 млн
клеток показал высокую противоопухолевую активность, вызывая гибель в
общей сложности 60% раковых клеток, в том числе индуцируя апоптоз у 5%
клеток. В дозе воздействия «Биокор-0,2г» 100,0 мкг/1,2 млн клеток, белок
вызывал гибель у 78% раковых клеток, в том числе индуцируя апоптоз у 6%
клеток (рис. 14).
120 100 80
60
%
40
20
55
40
22
72
6
94
мертвые клетки
живые клетки
апоптозные клетки
Рис. 14.
Цитотоксич
еская
активность
Биокора-0,2
г в
отношении
клеток рака
прямой
кишки
(операцион
ный
материал
пациента
М.Р., 68
5
6
0
0
лет, T
4
N
0
M
0.
Для всех значений
группа I (50 мкг/1,2 млн клеток) группа II (100 мкг/млн клеток) группа III (контроль)
опытных групп p<0,05.
В пятой главе диссертации
«Доклиническое изучение общей,
хронической и специфической токсикологии субстанции препарата
«Биокор-0,2г»
установлен характер действия препарата на организм
экспериментальных животных и проведена оценка его безопасности.
Изучение общего действия и «острой» токсичности субстанции
препарата «Биокор-0,2г»
Изучение острой токсичности препарата «Биокор-0,2г» показало, что
препарат относится к V классу практически нетоксичных соединений . LD50
у мышей при однократном пероральном введении составило ›5000 мг/кг и
при внутрибрюшинном введении 1200 (900-1600) мг/кг(таблица 10).
Таблица 10
Результаты показателей «осторой» токсичности субстанции препарата
«Биокор-0,2г»
Дозы,
Путь введения
мг/кг
Пероральный
внутрибрюшинный
Кол-во крыс
погибшие/
всего
Кол-во мышей
Погибшие/
всего
Кол-во крыс
погибшие/
всего
Кол-во мышей
Погибшие/
всего
500
-
-
0/2
-
600
-
-
1/2
-
800
0/2
-
1/2
-
1000
0/2
0/2
2/2
0/2
54
1500
0/2
0/2
2/2
0/2
1800
0/2
0/2
-
1/2
2000
0/2
0/2
-
2/2
3000
0/2
0/2
-
2/2
4000
-
0/2
-
-
5000
-
0/2
-
-
Исследование кумуляции препарата «Биокор-0,2г»
Талица 11
Дни введения
Число животных(п10)
Доля от LD
50
LD
50
≥ 5000мг/кг
1-4
0/10
0,1
500
5-8
0/10
0,15
750
9-12
0/10
0,22
1100
13-16
0/10
0,34
1700
17-20
0/10
0,50
2500
21-24
0/10
0,75
3800
25-28
0/10
1,12
5600
Суммарная доза за 24 дня 12800LD
50,
максимальная продолжительность эксперимента
24±4дня.К
к
LD
50n
/ LD
50 1
, где К
к
коэф. кумуляции, LD
50n
– средняя смертельная доза при n
кратном введении, LD
50 1
– средняя смертельная доза при однократном введении. К
к
≥ 1
привыкание;К
к
≤ 1 кумуляция.
Исследование кумуляции субстанции «Биокор-0,2г» показало, что
общее состояние и поведение опытных животных (мыши и крысы) не
отличались от интактных групп. Гибели среди подопытных мышей и крыс не
было, что позволяет сделать вывод об отсутствии кумулятивного свойства у
субстанции «Биокор-0,2г» (табл. 11).
Доклиническое изучение хронической токсичности препарата «Биокор-0,2г».
«Биокор-0,2г» не оказывает токсического действия при хроническом
введении на состав периферической крови. В лейкоцитарной формуле не
было обнаружено патологических изменений во все сроки исследования.
Препарат не оказывает токсического действия на функцию почек. Субстанция
препарата при пероральном ежедневном введении в изученных дозах не
оказывает токсического действия на функцию печени крыс и кроликов.
Наблюдение за животными в течение 30 дней ежедневного введения
субстанции препарата не выявили, каких либо различий между опытными и
контрольными группами. Поведение подопытных крыс и кроликов не
отличалось от поведения контрольных групп животных. В опытных группах
крыс наблюдалось незначительное увеличение веса тела. У кроликов, как в
контрольной, так и опытных группах увеличение веса не наблюдалось на
протяжении всего эксперимента.
Субстанция препарата при 10 кратном введении оказывала влияние на I и II
фазы свертывания крови, вызывая гипокоагуляцию. Увеличение дозы
препарата «Биокор-0,2г» не приводило к увеличению выраженности
гипокоагуляционного эффекта. Эффект сохраняется в течение 10 введений,
55
во всех изученных дозах, дальнейшее введение «Биокор-0,2г» до 30 дней
приводит постепенно к снижению его действия.
Длительное введение препарата в структуре внутренних органов
(сердце, желудок, кишечник, печень, почки, матка) не вызывает
морфологических изменений. Следовательно, предлагаемый новый препарат
является безопасным средством и может быть рекомендован для клинической
медицины.
Доклиническое изучение специфической токсикологии препарата «Биокор
0,2г».
Препарат «Биокор-0,2г» не оказывает местного раздражающего,
резорбтивного, местного аллергенного действия, эмбриотоксического и
тератогенного, иммунотоксического действия на клеточность и вес
лимфоидных органов, мутагенного действия (хромосомные изменения на
уровне физиологической нормы), установлена способность изученного
препарата существенно стимулировать иммунологическую реактивность
организма, изученное вещество обладает способностью интенсифицировать
гуморальное звено иммунитета.
Изучение общей фармакологии препарата «Биокор-0,2г»
При
длительном
30-ти
дневном
введении
не
отмечалось
существенного влияния на аппетит, набор массы тела молодых растущих
мышей, существенного влияния на двигательную активность и устойчивость
к физической нагрузке.
Отмечалось: усиление снотворного действия этаминала-натрия,
тенденция к ослаблению судорожного действия коразола.
Тест « открытое поле».
Препарат при многократном применении активирует поведенческие
реакции, центральную и периферическую нервную систему подопытных
крыс, как через 10 дней проведения эксперимента, так и через 30 дней. Через
1 месяц после прекращения введения препарата все показатели опытных
животных возвращались к контрольным значениям.
Все выше перечисленные данные позволяют сделать вывод о том, что
препарат не оказывает токсического действия на организм животных.
Разработка лекарственной формы препарата «Биокор-0,2г»
Таблетки от
беловато серогодо светло желтого цвета , круглые, плоско цилиндрические,
без риски с вкраплениями.
Состав на одну таблетку:
Биокор (в пересчёте на 100% безводное вещество)
(ВФС 42 Уз - ) 200 мг
Микрокристаллической целлюлозы
(ТУУз 42-002-96 или TSh88.2-6:2000) 274 мг
Н-карбоксиметил целлюлозы для таблетирования
(TSh 88.3-003:2007) 120 мг
Кальция стеарата
(ТУ 6-09-42-33-76, ВР) 6 мг
Масса одной таблетки 600 мг
56
Препарат
«Биокор-0,2г»
–
иммуномодулятор,
на
основании
доклинических исследований может применяться для комплексного лечения
онкологических заболеваний меланомы, рака прямой кишки, рака молочной
железы, рака эндометрия матки.
ВЫВОДЫ
1. Впервые из бобов сои сорта Генетик-1(
Glycine max
) выделена
субстанция препарата «Биокор-0,2г» состоящая из комплекса белков с
молекулярной массой 12,7-79,0 кДа, изоэлектрической точкой в области pI -
4,1, 4,2, 4,5 и 4,7.2., определены белки входящие в состав препарата
Исследование кумуляции субстанции «Биокор-0,2г» (Kunitz trypsin proteasein
hibitor, beta-amylase, beta-conglycininalphaprimesubunit, 2,4-Dinducible
glutathioneS-transferase, PR10-likeprotein, 24 kD aproteinSC24).
2. Показана ингибирующая активность препарата «Биокор-0,2г» к
сериновым протеазам трипсину, химотрипсину и плазмину. 3. Установлена
противоопухолевая активность препарата «Биокор-0,2г» на перевиваемых
опухолевых штаммах АКАТОЛ, АКАТОН, Меланома В-16 и Саркома 180,
при монотерапии тормозит рост раковой ткани на перевиваемых опухолевых
штаммах более чем на 70%.
4. Выявлено, что субстанция препарата «Биокор-0,2г» увеличивает
пролиферацию клеток красного костного мозга экспериментальных
животных и продолжительность жизни экспериментальных животных от 30
до 49% в зависимости от гистогенезиса опухоли.
5. Показано, что введение субстанции препарата «Биокор-0,2г» в
комплексной терапии с 5-фторурацилом усиливает противоопухолевое
воздействие в среднем от 10 до 25% и позволяет повысить эффективность
лучевой терапии экспериментальных опухолей животных в среднем в 1,5-2,3
раза. Увеличивает выживаемость подопытных животных от 30 до 60%.
6. Установлено, что субстанция препарата «Биокор-0,2г» способствует
восстановлению иммунного статуса животных-опухоленосителей,
получавших 5-фторурацил, модулирует лечебное действие противо
опухолевых препаратов и регулирует иммунитет у животных-опухоле
носителей.
7. Определено, что введение субстанции препарата «Биокор-0,2г»
способствует улучшению гематологических и морфологических показателей
крови (нормализации процентного содержания лейкоцитов, повышения
уровня гранулоцитов, содержания гемоглобина и числа эритроцитов).
8. Показано, что субстанция «Биокор-0,2г» ингибирует пролиферацию
in
vitro
более чем на 50% резистентных к терапии клеток рака молочной железы
с отсутствием рецепторов к эстрогенам и прогестерону, рака
57
эндометрия, рака толстого кишечника (с высоким содержанием bcl-2 , Ki-67)
на всех стадиях злокачественной трансформации.
9. Установлено, что субстанция препарата «Биокор-0,2г» относится к V
классу практически нетоксичных соединений. LD
50
при пероральном
введении более 5000мг/кг, не обладает кумулятивным действием, не
оказывает токсического действия на функцию почек и печени, а также на
патоморфологию органов и тканей животных, не влияет на сердечно
сосудистую систему, дыхание и периферическую нервные системы.
Субстанция препарат «Биокор-0,2г» не оказывает местного раздражающего,
резорбтивного,
аллергенного,
эмбриотоксического
и
тератогенного,
мутагенного действия, иммунотоксического действия на клеточность и вес
лимфоидных органов, количество макрофагов и клеточность костного мозга.
10. Разработана лекарственная форма препарата иммуномодулятора
«Биокор – 0,2г» таблетки и рекомендована для комплексного лечения
онкологических заболеваний.
58
ONCE-ONLY SCIENTIFIC COUNCIL ON AWARD OF SCIENTIFIC
DEGREE OF DOCTOR OF SCIENCES 14.07.2016.К/В/Т.13.01 AT THE
INSTITUTE OF BIOORGANIC CHEMISTRY AND THE NATIONAL
UNIVERSITY OF UZBEKISTAN
INSTITUTE OF BIOORGANIC CHEMISTRY
IBRAGIMOV FAZIL AHMEDOVICH
BIOLOGICAL ACTIVITY OF PROTEIN PREPARATION FROM
SOYBEAN IN TREATMENT OF ONCOLOGICAL DISEASES.
02.00.10 – Bioorganic chemistry
(biological sciences)
ABSTRACT OF DOCTORAL DISSERTATION
ТASHKENT – 2016
59
The theme of the doctoral dissertation is registered at the Supreme Attestation
Commission of the Cabinet of Ministers of the Republic of Uzbekistan under number
30.09.2014/В2014.5.В68.
The doctoral dissertation has been pripared at
Institute of Bioorganic Chemistry
The abstract of the dissertation is posted in three (Uzbek, Russian, English) languages on the
website of the Scientific Cousil
(http;//ss.biochem.uz)
and the website of «ZiyoNet» information
and educational portal (www.ziyonet.uz).
Scientific consultant
:
Kadirova Dilbar Abdullaevna
doctor of sciences in
biology
Official opponents: Saitmuratova Oguldjan Hudaybergenovna
doctor of sciences in
biology, docent
Buglanov Anatoliy Ayuchevich
doctor of sciences in biology, professor
Gafur-Akhunov Mirza Ali
doctor of sciences in medicine, professor
Leading organization: Republican Scientific Center of Immunology
Defense will take place on «___» december 2016 at ___at the once-only meeting of the
Scientific council 14.07.2016.К/В/Т.13.01 of the Institute of Bioorganic Chemistry and the
National University of Uzbekistan at the following address: 100125, Tashkent, 83 M.Ulugbek
street. Phon: 262 35 40, Fax: (99871) 262 70 63; e-mail: asrarov54@mail.ru
Doctoral dissertation is registered in library at the Institute of Bioorganic Chemistry, it is
possible to review it in library (100125, Tashkent, 83 M.Ulugbek street. Phone: 262 35 40, Fax:
(99871) 262 70 63)
Abstract of dissertation sent out on «____» November 2016 year
(mailing report № ____ on «___»___________2016 year)
A.S. Turaev
Chairman of once-only Scientific council on award of
scientific degree of doctor of sciences, D. ch. Sc., рrofessor
M.I. Asrarov
Scientific secretary of once-only Scientific council onaward
of scientific degree of doctor of sciences, D.b. Sc., рrofessor
R.Z. Sabirov
Chairman of once-only Scientific seminar under once-only
Scientific council on award of scientific degree of doctor of
sciences, D.b.Sc., рrofessor
60
INTRODUCTION (abstract of doctoral dissertation)
Urgency and relevance of the dissertation topic.
For today in the world
preventive maintenance and treatment of oncological diseases remains actual in
this connection the new medical products of a biological origin received from
vegetative and animal raw materials are created. On statistical data of the World
Organization of Public health services within 20 years oncological disease grows
in two
1
.
With acquisition of independence of Republic the organization of research
works on reception of medical products from local raw materials and the carried
out expanded actions for maintenance of the national parmacyeutical market with
qualitative medical products at high level have led to certain results. Thus, it is
especially important to note medical products received of local raw materials used
at treatment of oncological diseases.
Now mechanisms of an aetiology and патогенеза cancer diseases
definitively are not found out because of the big complexity and variety of the
molecular mechanisms occurring thus of processes. Carried out researches show,
that soya components are capable tumor cages, to induce apoptosis in the
transformed cages, and they operate on tumor cages, and toxic effects concerning
normal fabrics of an organism are, besides, one of the major problems is creation
of effective medical products and their introduction in manufacture.
The given dissertational research in certain degree serves performance of the
problems provided in Decisions of the President of Republic Uzbekistan from
November, 28th, 2011 № software-1652 «About measures on the further
deepening of reforming of system of public health services», the Cabinet of
Republic Uzbekistan from March, 29th, 2012 № 91 «ABOUT measures on the
further strengthening of material base and perfection of the organization of activity
of medical institutions», and also in other is standard-legal documents accepted in
given sphere.
Compliance of the research with priority areas of science and technology
of the Republic
2
.
This research was performed in accordance with the priority
areas of science and technology of the Republic - VI. Medicine and parmacylogy.
Review of foreign scientific researches on the dissertation topic
2
.
Researches aimed at development of biological drugs based on proteins and
peptides for treatment of cancer are performed at leading research centers and
higher education institutions of the world, including the National Institute of
Cancer (USA), Andong National University (Korea ), State Scientific Research
Institute of Physic-Chemical Medicine of the Russian Academy of Medical
Sciences (Russian), The Institute of Oncology of the Academy of Medical
Sciences (Ukraine), Oncology Research Center of the Ministry of Health of
_________________
1
http: //www.cancer.org/downloads/STT
61
Georgia, National Oncology Research Center of RAMS (Russia). As a result of
researches carried out in different research institutions on development of
biological products on the basis of proteins and peptides in the treatment of cancer,
a number of scientific results was received, including: - isolation of lunazid
peptide, that presents in soy and grains of some cereals, which is offered as a
means for treatment of cancer, high cholesterol, cardiovascular diseases and
inflammation (University of California-Berkeley); - isolation of Bowman-Birk
protease inhibitor, received from soy with molecular weight of 8 kDa, seems
promising at application after radical surgical removal of malignant tumor with the
purpose of prevention of recurrence and metastases (USA);
- development of GA-40 immunotherapeutic treatment medication with anti
carcinogenic properties (Immucor GA-40), which is a complex of plant
polypeptides from mountain Solomon's seal (Polgonatum varticillatum) (Oncology
Research Center of the Georgian Ministry of Health);
- development of "Insol" BAS possessing anti-cancer properties, extracted
from soybeans and containing Bowman-Birk inhibitor, soy proteins and
carbohydrates, with anti-inflammatory and anti-cancer effect (Moscow State
University);
New parmacylogical activity of some connections and the extracts possessing
ингибиторными properties of growth of cancer cages (Institute of chemistry of
plants of Academy of sciences Republik of Uzbekistan)
- development of Tortezin - a multifunctional drug which is a sum of neutral
oligopeptides from the blood of Central Asian tortoises Testudo horsfieldi, used as
immunocorrector and means for accompaining radiation and chemotherapy
(Institute of Bioorganic Chemistry of the Academy of Sciences of the Republic of
Uzbekistan).
A number of researches are held worldwide for development of biological
drugs for treatment of cancer in several priority areas, including: development of
means for correction of immunological and hematological disorders arising after
chemotherapy and radiation; studies of immunomodulations for application after
severe surgical interventions; correction of immunological disorders arising as a
result of immunosuppressive influence of the tumor; development of preparations
of protein nature possessing anti-metastatic effect.
The degree of study of the problem.
It is well known that oncological
situation in the world remains unfavorable. According to recent reports of IARC
(International Agency for Research on Cancer) and WHO, over 12 million new
cancer cases are registered in the world each year.
Despite the fact that cancer is the most dangerous of all diseases, its treatment
becomes more and more efficient year to year, thanks to constant development of
2
Research
and
commentary
on
the
thesis
developed
in
http://www.lib.uiowa.edu/hardin/md/ej.html;http://www.cancer.gov/search/cancer
literature/;
http://www.scirp.org/journal/jctи and developed on the basis of other sources.
62
new methods and their implementation on practice. One of the most recent areas of
oncology is the treatment of cancer by biological preparations - unique agents
acting destructively on tumor cells, and that have no adverse effects on healthy
tissues and the organism as a whole.
It is known that soy protein products do not contain cholesterol, which allows
recommending them to patients with lipid metabolism disorders (atherosclerosis,
coronary heart disease, hypertension, etc.). Soy proteins are easily digested (86-
98%), have medical effects on allergies and diathesis [Xiao C.W., 2008]. High
content of lecithin in soy protein helps to reduce blood sugar, cleanse blood vessels
from atherosclerotic layers, and improve metabolic processes [Jackman K.A,
2007].
Protease inhibitors isolated from soybeans for 5-10 times lower probability of
cancerous degeneration of human cells under the influence of X-rays. Inhibitors
help with various tumor diseases of liver, lung stomach, bowel, nasopharynx,
connective tissue of mice, rats, hamsters. Pure or partially purified protease
inhibitors act approximately equally. The latter property will reduce the cost of the
medicine [Krutyakov V.M., 2001].
In Uzbekistan researches of medical products on the basis of plants in
treatment of oncological diseases are engaged in Enikeeva Z.M., Juldashev A.H.,
they had been allocated such antineoplastic connections, as proiz-water colhicine,
vincristine and vinblastine. The present work is devoted reception of the
standardised combination of an albuminous complex and studying of biological
and tumor activity in conditions
in vitro
and
in vivo
, and also to studying of the
parmacy-toxicology, the received preparation has practical value.
This paper is dedicated to reception of a standardized combination of protein
complex and study of its biological and antitumor activity in vitro and in vivo, as
well as study of parmacy-toxicology of the received preparation.
Connection of the dissertation topic with research work held in research
institution where the work was carried out
. The dissertation research was
carried out within the framework of the plan of research works of fundamental
project STCU №3501 «Study of soy protein in the treatment of cancer cells of an
organism" (2006-2009) and applied project FA-A11-T174 "Development of
antitumor protein preparation from soybean cake and isolation of highly pure
enzymes from local raw materials" (2009-2011) held at the Institute of Bioorganic
Chemistry.
The purpose of the research
is reception of soy protein complex,
determination of its physicochemical characteristics, anti-cancer activity on various
kinds of cancer in vivo, in vitro on biopsies of breast and endometrial cancer,
parmacy-toxicology of the received substance.
Research objectives:
- development and physical and chemical characterization of protein complex
from soy;
- determination of protease activity of the protein complex;
63
- determination of biological activity on experimental models in mono- and
combined therapy at in vivo experiments;
- determination of antitumor activity of the protein complex on breast, colon
and endometrium cancer cells resistant to conventional therapy at in vitro
experiments;
- preclinical studies of parmacy-toxicology of the substance and dosage form
of the preparation;
- development of Biokor medical form of the medicine.
The object of the research
is the protein complex from soybeans from beans
of a soya of a grade «Genetica-1» (
Glycine max - (L
is
.) Mtrr.
), oncological
diseases, a cancer of the thick intestines, intertwined ACATOL, ACATON,
melanome В-16, Sarcome-180
The subject of the research
Physical and chemical and anti-tumor properties
of an complex (a preparation substance «Biocor-0,2 g») on intertwined ACATON,
ACATON, melanome В-16, Sarcome-180, on biopsy material
in vitro
a mammary
gland cancer, to resistant cages endometria and thick intestines on all a stage of
malignant transformation as well as parmacylogical and toxicological properties of
the received substance.
Research methods.
The research included methods of column
chromatography, electrophoretic methods of research, definition of amino acid
composition, imunnehistochemical analysis, microscopy, mass spectrometry,
immune-enzyme and parmacyy-toxicological analysis.
Scientific novelty of the research is as follows:
- protein complex was isolated from soy beans, its physicochemical properties
were determined;
- the purified protein consists of a complex of proteins with a molecular
weight of 12,7-79,0 kDa, and isoelectric point in pI -4,1; 4.2, 4.5 and 4.7; - mass
spectrometry determined the presence of Kunitz trypsin protease inhibitor in the
protein complex;
- specific antitumor activity of the protein complex revealed at in vitro and in
vivo conditions;
- parmacy-toxicological properties of the received substance were
identified; - medical form of "Biokor-0,2g" preparation was developed .
Practical results of the study are as follows:
- development of "Biokor" preparation based on a set of polypeptides from
soy beans;
- development of an effective medicine with antitumor action possessing
detoxicating, anti-inflammatory, immunomodulationy and anticarcinogenic
properties;
- pre-clinical parmacy-toxicological studies showed that Biokor preparation
belongs to class V of practically non-toxic compounds and has no cumulative
properties.
64
Reliability of the research results
based on the fact that the experimental
data was obtained with application of modern high-precision methods. Conclusions
of the work were made on the basis of the results processed using modern methods
of mathematical statistics.
Scientific and practical significance of the research results.
The scientific
significance of the research results is isolation and study of a protein complex from
soybean. The mechanism of action of the preparation on the organism of
experimental animals was studied, what allows to receiving new data on the
etiology and characteristics of development of malignant tumors.
The practical significance of the work is development of medical form of
"Biokor-0,2g" pills preparation on the basis of a protein complex from soybean for
complex treatment of oncological diseases. The preparation reduces the toxic
effects of other treatments (chemotherapy and radiotherapy), normalizes the
immune system, improves the hematological and morphological parameters of
blood (reduces the percentage of white blood cells, increases the level of
granulocytes, hemoglobin and red blood cells) and prevents metastasis.
Implementation of the research results
. On the basis of receiving data on
extraction, physic-chemical study of biologic and anticancer activity of the protein
from soybean cake the following actions were made:
- Development of Biokor preparation possessing anti-cancer activity, as well
as of a method of its extraction. The invention was patented in the Intellectual
Property Agency of the Republic of Uzbekistan (26.04.2012, №IAP 04501). Based
on the receiving substance a medicinal form (pills) was developed for
incorporation into a basic therapy of cancer treatment.
The obtained data, on a complex of fibers allocated of a soya are registered in
database EMBL (<http://www.ebi.ac.uk>), antineoplastic activity of a preparation
«Bikor-0,2g» on intertwined tumor AKATOL, AKATON, melanome В-16 and the
Sarcoma 180 is established.
- "Biokor-0,2g" pills on the basis of preclinical studies are recommended as an
immunomodulation for the integrated treatment of oncological diseases of different
localization of tumor process of breast cancer, melanoma, colorectal cancer,
endometrial cancer.
- The technical documentation on VFS projects was submitted to the General
Department for Medicines and Medical Equipment Quality Control for
examination and registration. "Biokor-0,2g" pills are tested in clinical trials on the
second stage breast cancer patients in not adjuvant therapy mode.
Approbation of the work.
Results of the research on dissertation topic were
presented in the form of reports and have been approved at 23 international and
national science and research conferences, in particular: III Congress of
Oncologists of Transcaucasian States (Yerevan, 2004), The conference on "Actual
problems of post-graduate training of doctors and new horizons of medicine"
(Tashkent, 2007); XI Russian Oncology Congress (Moscow, 2007); Materials of
scientific-practical conference on "The physic-chemical biology and prospects of
65
biotechnology" (Andijan, 2007); V Congress of oncologists and radiologists of CIS
countries (Tashkent, 2008); Conference on "Actual problems of chemistry of
natural compounds" (Tashkent, 2009, 2010, 2011, 2012); International Congress
"Biotechnology: state and prospects for development" (Moscow, 2009);Scientific
practical conference "Biologically active substances: basic and applied questions
of preparation and application" (Ukraine, 2009, 2011);Russian scientific-practical
conference with international participation "Modern Oncology: achievements and
prospects" (Tomsk, 2009); 6th Russian conference on fundamental oncology (St.
Petersburg, 2010),14
th
and 15th International Pushchino School - Conference of
Young Scientists "Biology - Science of XXI Century" (Moscow, 2010, 2011);
Conference on "Actual problems of development of Bioorganic Chemistry"
(Tashkent, 2010); X, XI All-Russian scientific-practical conference with
international participation "Domestic antitumor preparations" (Moscow, 2011,
2012); 7
th
Conference "Fundamental Oncology – Peter readings" (St. Petersburg,
2011); II Congress of Oncologists of Uzbekistan (Tashkent, 2011); 8th Conference
on fundamental oncology "Peter Reading (Moscow, 2012);Belarusian-Russian
scientific-practical conference with international participation "Domestic antitumor
preparations" (Minsk, 2013).
Publication of the results.
48 publications were made on the materials of the
dissertation: 13 scientific articles, including 9 national and 4 foreign journals
recommended by the Higher Attestation Commission of the Republic of
Uzbekistan for publication of basic scientific results of doctoral dissertations. In
addition, a patent for the invention was receiving.
The structure and volume of the dissertation
. The Structure of the
dissertation consists of an introduction, five chapters, conclusion, and list of
references. The volume of the dissertation is 195 pages.
HIGHLIGHTS OF THE DISSERTATION
The introduction
discusses the urgency and relevance of the study, the
purpose and objectives of the study, the object, subject and correspondence with
research priority areas of Science and Technology of the Republic of Uzbekistan,
scientific novelty and practical results of the study, scientific and practical
significance of the results, practical application of research results, information on
published works and the dissertation structure.
The first chapter of the dissertation
"Soybeans: characteristics and
importance in prevention and treatment of various diseases"
provides a
detailed review of the literature devoted to the study of proteins and peptides in the
biotherapy of tumors, application of immune modulators in the treatment of cancer
patients, medicines based on soy derivatives in the treatment of various diseases.
The second chapter of the dissertation
"The material, conditions and
methods of study of protein complex of Biokor preparation "
describes detailed
methods for extraction of the protein complex from soybean, electrophoretic,
radiometric, mass spectrometry, immunologic methods, methods of determining
66
the biological activity of the protein preparation on experimental tumor strains,
parmacy-toxicological and histology methods.
The third chapter of the dissertation
"Physical and chemical characteristics
of the protein complex and its biological activity"
describes the results of the
studies of physical and chemical properties and biological activity of the Biokor
preparation on experimental tumor strains.
Proteins chromatography and physical-chemical characterization of proteins.
Currently, many researches are held to study the influence of soy and its
components on carcinogenesis (Krutyakov VM 2001, p.106; Nemtsova ER et al,
2002, p.30.). Ongoing studies indicate that soy components capable of inhibiting
tumor cell proliferation, inducing apoptosis in transformed cells, and they
influence tumor cells with minimum toxic effects on normal tissues of the
organism (Zaletok S.P. et al., 2006, s.294 ; N.I. Kazatchkina et al, 2006, p 35). In
this regard extraction of soy protein complex to study its anti-tumor activity is a
topical problem.
Isolation of proteins from soybean was performed by two methods of
extraction: with solution of 0,06M solution of sodium chloride 0.05 M Tris buffer,
pH 7,4.
To test the antitumor activity of protein we used a model test system for the
selection of anticancer agents in vitro on KML mice melanoma cell line - B-16
mice melanoma strain (Kuznetsov, N. et al, 2005, p.5). Carriers for gel filtration –
sephadex G-75 and G-50 – were selected for efficient separation (Osterman, L.A.,
1983, p.116).
The chromatograms of gel filtration of proteins are shown in Fig. 1 and 2.
D
2
80
2,5 2
1,5 1
0,5
1
2
Fig.1. Gel filtration
of soy
protein on column
with
sephadex G-75 (80 x
2,6),
0,05М Tris-HCl
buffer pH 7,4
D
2
80
0
0 200 400 600 800 1000 1200
Объем элюции, мл
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
2
0.2
1
Fig.2. Gel filtration of soy
protein on column with
sephadex G-50 (80 x 2,6),
0,05М Tris-HCl buffer pH 7,4
0
-0.2
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Объем
элюции
67
Both media eluted three fractions. Determination of activity of fractions by
14
C-thymidine activation showed that the highest activity of 64.0 ± 1.9% at the
dose of 100 mcg/ml was shown by the first fraction after gel filtration on column
with Sephadex G-75.
Electrophoretic studies of the protein fractions after gel filtration has shown
that the most effective separation of proteins is receivingd on Sephadex G-75. The
component composition of the first fraction is presented by pronounced
polypeptides with molecular weights of 12.7, 13.0, 15.0, 67.0, 79.0 kDa. Gel
filtration on Sephadex G-50 column did not provide effective separation of
proteins, the spectrum of all three protein fractions was virtually identical.
Isoelectric focusing of active protein fraction showed the presence of four
isopoints in pI -4,1, 4,2, 4,5 and 4.7 (Fig.3).
1 2 I/M _
9,45
Fig.3. Isoelectic focusing of the active
protien fraction after gel filtration on
G-75 column (ampholinc within the
4,7
4,5
4,2
4,1
3,50
range of pH 3,5-10)
1-Fraction I
2- Witnesses of Свидетели isofocusing.
+
kDa_ 1 2 3 4 5 6 _
67,0
25,0
12,5
+
Fig.4
Electrophoresis
in
10%
polyacrylamide gel with presence of SDS
of Biokor substance:
1-
mixture
of
marker
proteins
(Albumins
Bovine
67-kDa,
chemotrypsinogen-25 kDa, cytochrome
С-12,5 kDa), 2–WSS, 3-7 – five series of
experimental
samples
of
the
preparation.
The active protein fraction standardized on five series of laboratory samples
was given the name of Biokor preparation (Fig. 4).
Amino acid composition of the active protein fraction was determined (Table
1).
68
Table 1.
Amino acid composition of the active protein fraction
Amino acids
Percentage
Amino acids
Percentage
Ala
5,30
Leu
9,04
Arg
10,08
Lys
4,90
Asp
11,09
Met
1,40
Val
5,06
Pro
5,19
His
3,57
Ser
4,85
Glu
16,03
Tyr
3,09
Gly
4,05
Thr
4,90
Ile
3,01
Phe
4,05
Σ 95,99%
Determination of antitrypsin activity of Biokor preparation.
Serine proteases play an important role in tumor growth, comprising serine
(trypsin, chymotrypsin, kallikrein, plasmin, thrombin) in its active site, as well as
metalloproteinase containing Zn
2+
in the active site (Nagase H., et al, 1994, p.
21491).
Table 2.
Inhibition of serine proteases activity by Biokor
Serine proteases
Inhibition of serine proteases activity
Standard units of proteolytic
activity, absorption λ 280
% of inhibition
Trypsin
0,145±0,002
34,7±0,1
Chymotrypsin
0,156±0,003
29,4±0,2
Plasmin
0,167±0,002
24,1±0,1
Control*
0,220±0,002
0
*3,0 mcg protease, in 0,05М phosphate buffer pH 7,6; substrate - casein 300,0 mcg, (
*
- p<0,05).
In this connection, an experiment was conducted to determine the anti-trypsin
activity of Biokor preparation (Table 2). The data shows that Biokor possesses
high inhibitory activity against serine proteases from 24.1 ± 0.1 to 34.7 ± 0.1, that
suggests antitumor properties of the preparation.
69
Mass spectrometric analysis of peptides of Biokor preparation
Table 3.
Identified proteins
ID
Mr(Da)
Score
Sequence
Coverage %
Kunitz trypsin protease inhibitor
Glycine max
22676,1
339,17
50
Beta- conglycinin alpha subunit
Glycine max
72475,7
375,39
43
Beta-amylase
Glycine max
57000,0
205,59
52
2,4-D inducible glutathione
S transferase
Glycine max
49000,0
78,66
23
PR10-like protein
Glycine max
3865,99
55,42
29
24 kDa protein SC24
Glycine max
24569,7
52,27
17
Note: ID - abbreviation of proteins according to NCBI databases; Mr - molecular weight of
proteins; Score-10xlgP, where P - probability that a protein, which was compared to the mass
spectrum of the databases is incorrect. All search results of proteins with the Score value greater
than 50 are valid; SequenceCoverage – the percentage of coverage of amino acid sequence
according to databases. Reliable index is from 15 to 90%.
Two-dimensional gel electrophoresis coupled with mass spectrometry
identified the proteins that are part of Biokor preparation. The presence of protease
inhibitors – Kunitz trypsin protease inhibitor - in the preparation was confirmed.
The data is presented in Table 3.
Investigation of antitumor activity of Biokor substance in experimental
carcinogenesis on transplanted colon adenocarcinoma (AKATOL), small bowel
adenocarcinoma (AKATON), B-16 melanoma and Sarcoma 180 tumor strains.
Inhibition of tumor growth by weight and volume.
Adjustment of the dose of Biokor preparation was performed on colon
adenokartsinoma tumor strain (AKATOL).
The experimental animals were divided into 4 groups: group I - animals
receivingd Biokor per os 10 days once a day at a dose of 125 mg/kg; group II -
animals receivingd Biokor per os 10 days once a day at a dose of 150 mg/kg; group
III – animals receivingd Biokor per os 10 days once a day at a dose of 250 mg/kg;
group IV - control, animals were once a day injected NaCl saline per os.
Biokor at the dose of 150 mg/kg per os showed the greatest efficacy and
inhibited AKATOL tumor growth by 71.9% by weight. Reducing the exposure
dose to 125 mg/kg lead to reduction of tumor growth inhibition to 57.68% by
weight. Increasing the dose to 250 mg/kg did not lead to increased inhibition of
tumor weight and reached 69.8%.
All experimental groups of animals treated with Biokor have shown a
significant confirmed decrease of tumor by volume what can be explained by a
positive effect of the protein on the processes of exudation of ineytrofilnoy
invasion. The most significant antitumor effect was observed on the animals of the
II and III experimental groups - 88,46%. In Group I the inhibition of tumor tissue
growth reached 61.4%.
The results have shown that that the optimal dose of BIOKOR is 150mg/kg.
70
Further studies of BIOKOR were carried out on adenocarcinoma of small
intestine (AKATON), B-16 melanoma and Sarcoma 180 tumor strains.
Fig. 5. Changes in tumor volume
and weight in experimental animals
on different strains after substance
introduction at the dose of
150mg/kg to the last day of the
experiment. (* - P <0,05).
Fig. 5 shows the results of tumor growth inhibition on all four strains. Biokor
substance at mono therapy inhibits tumor growth by volume and weight by more
than 70%.
Calculation of apoptotic and mitotic index in the tumor tissue after
introduction of Biokor.
Metric data on tumor weight and volume is not always able to adequately
reflect the processes of progression or regression of the tumor tissue. More
objective picture of proliferative activity of tumor cells can be obtained by
counting the number of mitoses in the tumor tissue - its mitotic index (MI).
Another parameter that reflects the processes of tumor cell death is apoptotic index
(AI).
The ratio of apoptotic index (AI) to the mitotic index (MI) (AI/MI)
demonstrates the degree of progression or regression of the tumor tissue. In case
the value of AI/MI exceeds unity, tumor regression is observed.
The experimental group with AKATOL strain has shown high regression of
the tumor tissue. The AI/MI ratio in the experiment was 2.08, whereas the control
group ratio was 0.89. On Melanoma B-16 strain the AI/MI ratio in the experiment
reached 15.18, and in the control group - 0,74. On AKATON strain the AI/MI ratio
in the experiment was 1.75, with 0.81 ration in the control group. On Sarcoma 180
tumor strain the AI/MI ration reached 3.6 in the experiment, with 0.86 ration in the
control group.
As can be seen from the results, all experimental groups have shown
significant regression of the tumor tissue, i.e. the number of apoptotic cells exceeds
the number of mitotically dividing cancer cells, whereas the control group of
experimental animals provided the AI/MI ration of less than 1.0.
Study of the inhibitory effect of Biokor on red bone marrow cells in
experimental carcinogenesis.
Application of any therapeutic substance possessing a cytotoxic effect on
tumor cells creates a risk of reducing the proliferation of normal and highly
proliferating cells. One of the primary targets of such side effect of the
71
preparations are red bone marrow cells. Disorder of their proliferation leads to
serious negative consequences for the process of hematopoiesis and efficient
operation of the immune system [Y.M. Vasilyev, 1997, p.20].
To determine the proliferative activity of red bone marrow cells the direct
method of one-hour cell culturing for chromosome analysis by Fitzgerald was
used. In studies of Biokor anticancer properties we studied the inhibitory effect of
the protein on the proliferation of red bone marrow cells in experimental
carcinogenesis on AKATOL, AKATON, B-16 melanoma and Sarcoma 180 tumor
models. Fig. 6 shows the results of counting of MI in red bone marrow of
experimental animals. As can be seen from the chart Biokor did not inhibit
proliferation of red bone marrow cells.
Fig. 6. Mitotic index (MI) of red
bone marrow cells of
experimental animals with
implanted tumors after
introduction of Biokor to the last
day of the experiment
(* - P <0,05).
Influence of Biokor preparation on haematological parameters and
morphological picture of blood of the mice with experimental model of sarcoma
180 tumor.
Table 4
Influence of "Biokor" preparation application on haematological parameters
and morphological picture of blood of mice with Sarcoma 180 experimental
model.
Objects of study
Animal groups
Intact
Control
Treated
White blood cells
7,95±0,61
20,4±3,64*
11,2±2,48**
Lymphocytes
5,1±0,16
3,5±0,46*
4,0±0,15
Cells of medium size
1,45±0,12
1,7±0,5
1,2±0,1
Granulocytes
1,9±0,08
3,03±0,2*
2,97±0,26*
The percentage of lymphocytes
57,0±2,45
38,3±0,66*
45,3±1,2**
Cells of medium size, %
17,6±1,06
14,2±1,09
13,1±2,0
Granulocytes, %
22,4±1,31
44,8±1,13*
47,2±4,19*
Rod nuclear cell, %
1,5±0,4
7,3±2,91*
5,0±2,08*
Segmentated cell, %
34,0±1,63
48,0±2,31*
50,7±3,84*
Hemoglobin
130,3±8,89
122,5±5,31
141,0±7,58**
Red blood cells
7,98±0,71
7,98±0,26
9,06±0,48
Note: * p ≤ 0.05 compared to intact animals, ** p ≤ 0.05 compared to the control group
72
Studies were performed on whole blood of mice. Animals were divided into
the following groups: intact animals, control group (model with implanted tumor)
and a group of animals receiving the drug at the dose of 150 mg/kg per os.
Introduction of the drug was started on the 10
th
day after tumor transplantation and
continued daily for 10 days.
The study has shown improvement of hematological and morphological
parameters of blood (normalization of percentage of white blood cells, increase of
the level of granulocytes, hemoglobin and quantity of red blood cells). A
standardized combination of polypeptides possesses not only pronounces anti
tumor effect, but also is involved in the recovery of the immune system, improves
blood hematologic indices.
Study of Biokor antitumor activity on experimental animals with transplanted
tumor strains at late introduction of the drug.
Experiments on study of the life span of animals after introduction of
Biokor were conducted similarly to the study of tumor growth inhibition by weight
and by volume. Introduction of the drug was carried out on day 10 after tumor
transplantation.
The conducted study of anti-tumor activity of Biokor on transplanted
AKATOL, AKATON, B-16 melanoma and sarcoma 180 strains in terms of the
effectiveness of tumor growth inhibition (TGI) and an increase of life span (ILS) of
experimental animals has shown a positive effect of the protein at introduction on
the 10
th
day after tumor transplantation for more than 60% and 30% respectively
(table 5).
An audit of internal organs in experiments for study of life span of
experimental animals revealed isolated cases of metastasis on the 10
th
day after
tumor transplantation. Protease inhibitors contained in Biokor protein complex
help to reduce metastasis.
228 mg/kg of 5-fluorouracil (5-FU) was introduced to animals intraperitoneally on
the 3
rd
, 5
th
and 9
th
day after tumor transplantation
Table 5
Study of Biokor antitumor activity at later introduction (on day 10 after
tumor transplantation) in terms of tumor growth inhibition and increase of
life span of animals.
Experimental strains
TGI by volume %
TGI by weight %
ILS %
AKATOL
91,40
66,35
38,34
AKATON
60,95
47,17
49,83
Melanoma В-16
56,35
60,06
30,59
Sarcoma 180
63,84
61,63
35,90
Study of Biokor antitumor activity at joint introduction with 5- fluorouracil (5-FU)
on mice with transplanted tumor.
73
Table 6
Study of antitumor activity of Biokor protein preparation (BP) at combined
application with 5-FU on animals with transplanted tumor.
Tumor
strain
Preparation
Dosage
Q-ty of
intro
ductions
Average
tumor
weight (g)
TGI by
weight %
AKATON
Control
5-FU
5-FU+BP
BP
228 mg/kg
228mg/kg
+150mg/kg 150
mg/kg
3
3+10
10
1,24±0,48
0,32±0,1
8*
0,09±0,0
6*
0,36±0,2
3*
74,2
92,7
71,0
AKATOL
Control
5-FU
5-FU+BP
BP
228 mg/kg
228mg/kg
+150mg/kg 150
mg/kg
3
3+10
10
0,87±0,31
0,12±0,0
3*
0,07±0,0
1*
0,25±0,1
9*
86,2
91,9
71,3
Sarcoma
180
Control
5-FU
5-FU+BP
BP
228 mg/kg
228mg/kg
+150mg/kg 150
mg/kg
3
3+10
10
1,8±0,38
0,16±0,0
5*
0,12±0,0
4*
0,19±0,0
8*
91,1
93,3
89,4
Melanoma
В-16
Control
5-FU
5-FU+BP
BP
228 mg/kg
228mg/kg
+150mg/kg 150
mg/kg
3
3+10
10
1,7±0,23
0,62±0,1
2*
0,40±0,1
1*
0,66±0,1
3*
63,4
76,4
61,2
For all values of the experimental groups * p <0,05 versus control
Table 7
Study of the effect of Biokor protein preparation (BP) on increase of life span
of animals with transplanted tumor at combined application with 5-FU.
Tumor
strain
Preparation
Dosage
Q-ty of
intro
ductions
Average
life span
(days)
Increase
of life
span, %
AKATON
Control
5-FU
5-FU+BP
BP
228 mg/kg
228mg/kg
+150mg/kg 150
mg/kg
3
3+21
21
25,1±1,25
33,5±1,67
37,3±1,72
26,6±1,33
33,4
48,6
35,5
AKATOL
Control
5-FU
5-FU+BP
BP
228 mg/kg
228mg/kg
+150mg/kg 150
mg/kg
3
3+21
21
17,7±1,35
30,5±1,52
27,5±1,26
30,6±1,51
72,3
55,3
72,8
Sarcoma
180
Control
5-FU
5-FU+BP
BP
228 mg/kg
228mg/kg
+150mg/kg 150
mg/kg
3
3+21
21
36,6±1,83
50,3±2,52
65,3±3,26
56,3±2,81
37,4
78,4
53,8
Melanoma
В-16
Control
5-FU
5-FU+BP
BP
228 mg/kg
228mg/kg
+150mg/kg 150
mg/kg
3
3+21
21
23,4±1,17
30,8±1,52
41,8±2,06
30,6±1,53
31,6
78,6
30,7
74
Biokor in a dose of 150 mg/kg was introduced per os for 10 days starting
from the second day after tumor transplantation. Then, after natural death of the
animals in all groups, indices of TGI and average life span were counted and ILS
index was calculated and compared with the control group.Study of antitumor
activity of protein drug at joint application with 5-FU on mice with transplanted
tumor at early stages of introduction.
The drug has shown excellent antitumor activity at cytostatic level.
Introduction of soy protein in complex therapy with 5-fluorouracil increases
antitumor effect on average from 10 to 25% (Table 6). The effect of combined
application of antitumor cytostatic and Biokor was even more significant - survival
of experimental animals increased by 30 to 60% depending tumor histogenesis
(Table 7).
Combined application of Biokor substance and 5-fluorouracil reduces the
toxic effect of the latter and increases tumor growth inhibition and life span of
experimental animals with transplanted tumor.
Changes in immune status of tumor-bearing animals at introduction of Biokor.
After transplantation of Sarcoma 180 tumor strain to outbred mice, 5- fluorouracil
was introduces intraperitoneally on the 3
rd
, 5
th
, and 9
th
day at a dose of 228mg/kg.
Biokor was introduced per os at a dose of 150 mg/kg on 2
nd
and 21
st
day.
The method for assessing the immune status is based on quantitative testing
of lymphocyte subpopulations with specific receptors - differentiation clusters
(CD) [Zalyalieva M., 2004, p. 9]. The following markers were used: CD3, CD4,
CD8, CD16, CD19. The phagocytic activity of neutrophils (PAN) was determined
by their ability to phagocytize neutral particles of latex (1.5 microns) in
percentage.
Fig. 7. Effect of 5-
fluorouracil and Biokor
preparation on immune
parameters of animals with
transplanted tumors.
Table 8
Effect of 5-fluorouracil and Biokor preparation on immunoregulation index
(IRI).
Intact
animals
Animals
with tumor
5-FU
5-FU+Biokor
Biokor
IRI
1,63±0,1
0,5 ±0,01
0,6 ±0,01
1,1 ±0,1
1,2 ±0,1
75
Introduction of cytostatics reduces the percentage content and functional
activity of T-lymphocytes CD3+, CD4+, CD8+, as well as the natural protective
factors (FAN, CD16+) (Fig. 7). Biokor preparation reduces toxic and
immunosuppressive effect of the cytostatic and thus enhances antitumor effect and
restores immune regulation index (Tab.8)
Biokor helps restore immune status of tumor-bearing animals treated with 5-
fluorouracil. Biokor modulates the therapeutic effect of anticancer drugs and
regulates immunity in tumor-bearing animals.
Modification of the growth of experimental tumors under the influence of
radiation therapy and Biokor.
Radiation therapy was performed by total gamma-irradiation at a dose of 2
Gy 52 hours after tumor transplantation. Biokor was introduced per os at a dose of
150 mg/kg, starting from the second day after tumor transplantation. The animals
were killed on 14
th
day of the experiment under chloroform anesthesia. The effect
of antitumor activity was evaluated by weight (W) and volume (V) of the extracted
tumor tissue.
The results showed that 2 Gy total radiation inhibits Sarcoma-180 tumor
growth for 48% by weight and up to 52% by volume (Table 9). Effect of
combination of Biokor with radiation treatment increases the efficiency of TGI for
85% by weight and for 97% by volume. On AKATOL tumor, total irradiation
causes inhibition of tumor growth for 37% by weight and for 70% by volume.
Addition of Biokor to the therapy enhances antitumor effect of radiation: TGI
reached 91% by weight and 88% by volume.
On AKATON tumor, total irradiation inhibits tumor growth for 64% by weight and
up to 91% by volume. Application of Biokor also increases the antitumor effect of
irradiation: TGI reached 70% by weight and 97% by volume.
Table 9
Influence of Biokor and irradiation on the growth of transplanted tumors.
Tumor
Group/preparations
Average
tumor
weight, g
Average
tumor
volume, sm3
TGI by
weight, %
TGI by
volume, %
Sarcoma 180
control
0,74±0,16
0,93 ±0,28
-
-
ϒ
0,38±0,12*
0,45 ±0,25*
48
52
ϒ
+BP
0,11±0,02*
**
0,02 ±0,01 *
**
85
97
AKATOL
control
1,87±0,32
3,72 ±0,80
-
-
ϒ
1,16±0,34*
1,12 ±0,35 *
38
70
ϒ
+BP
0,17±0,09 *
**
0,44 ±0,43 *
91
88
AKATON
control
1,75±0,53
2,75 ±1,10
-
-
ϒ
0,63±0,22*
0,25 ±0,16 *
64
91
ϒ
+BP
0,52±0,19 *
0,09 ±0,06 *
**
70
97
Note: * p ≤ 0.05 compared to group 1 (untreated animals), ** p ≤ 0.05 group (animals
treated with radiation therapy).
76
The research testifies that the addition of Biokor to anti-tumor treatment can
improve the efficacy of radiotherapy of experimental animal tumors. The positive
effect of treatment, shown by enhancing tumor regression, depends on the
histogenesis of the tumor.
The fourth chapter of the dissertation -
"Study of antitumor activity of
Biokor invitro (breast cancer, endometrial cancer and colon cancer)" -
describes in detail the effect of Biokor preparation in vitro on induction of
apoptosis and inhibition of proliferation of biopsies cancer cells at different stages
of disease development.
Study of antitumor activity of Biokor on breast cancer cells resistant to
conventional therapy.
Determination of hormone and tumor drug sensitivity for individual
selection of treatment schemes is very important for patients with advanced breast
cancer [Petrov S.V., 2000, p. 35, Pozharissky K.M., Leenman E.E., 2000, p.5]. The
absence of receptors to estrogen and progesterone on the surface of breast cancer
cells does not allow to follow traditional treatment of the disease and requires
changes in parmacylogic influence. This pathology occurs at approximately 15%
of patients [Gerstein E.S., Kushlinsky N.E., 2002, p. 40].
Upon receipt of tumor material from patients with breast cancer, we
conducted research of the presence of receptors for estrogen and progesterone. The
study used mice monoclonal antibodies against estrogen receptors (clone 6F11)
and mice monoclonal antibodies against progesterone receptors (clone 1A6)
manufactured by “Novosastra” (England).
Tumor tissue samples were divided into groups with and without receptors
for estrogen and progesterone, then both types of tumor cells were cultured in
growth substance in vitro.
As can be seen from the data presented, Biokor in the absence of estrogen
and progesterone receptors on the surface of tumor cells, can significantly inhibit
the proliferation of breast cancer cells (Figure 8, 9).
Fig. 8. The degree of destruction
of breast cancer cells layer with
the presence of receptors to
estrogen and progesterone after
exposure to Biokor. For all
values of the experimental
groups p <0,05.
It is worth to notice that the protein showed a pronounced dose-dependent effect.
77
Fig. 9. The degree of destructon
of breast cancer cells layer
without receptors to estrogen
and progesterone after exposure
to Biokor. For all values of the
experimental groups p <0,05.
After influence by Biokor on breast cancer cells at a concentration of 50
mcg/10
6
cells and 100 mcg/10
6
cells significant number of tumor cells died
(degradation degree equaled to 28.87%±5.38 and 36.2%±11.47 respectively),
whereas at a concentration of 10 mcg/10
6
cells the effect was not shown and the
cytotoxic action of the protein was similar to the control (6,0% ± 0,98).
Bcl-2 gene is a leading gene defining the mechanism of cell death by
inhibiting apoptosis. This gene encodes a formation of protein accumulated in the
mitochondria [Bezborodov O.A. et al., 2004, p.40, Kazatchkine N.I. et al., 2006,
p.35]. Expression of Bcl-2 is associated with factors indicating a favorable
prognosis, as it correlates with the presence of receptors for steroid hormones and a
low degree of malignancy [GalloD. Et al., 2006, p.74].
The expression of Bcl-2 protein on breast cancer cells with the absence of
receptors to estrogen and progesterone was studied before and after exposure to
Biokor.
Exposure to Biokor at all concentrations resulted in reduction of Bcl-2
protein in breast cancer cells by an average of 27,25
±
1,14%, p <0,05 (Fig. 10).
Fig. 10. Quantitative changes
of bcl-2 protein in breast
cancer cells with the absence of
receptor to estrogen and
progesterone at invitro
exposure to Biokor. For all the
values of the experimental
groups p <0,05.
Influence of Biokor on breast cancer cells at later stages of the disease.
The study
was conducted on samples of the tumor tissue with malignant transformation of
breast cells, the third stage of the disease.
Tumor cells from surgical specimen of patient G., 68 years, diagnosis - cancer of
the left mammary gland, T
2
N
1
M
0
(T - tumor size, N - increase in regional lymph
nodes, M - detection of distant metastases) were added to the wells of a
78
polystyrene plate. After formation of cellular layer of medium density, Biokor
preparation was added at the dose of 100 mcg/million cells (group I) and 50
mcg/million cells (group II). The control group were breast cancer cells without
exposure to Biokor (group III). Incubation time with the protein was 60 min. The
results of Biokor cytotoxic activity against breast cancer cells are presented in
Fig.11.
As can be seen from the data, Biokor at the dose of 100 mcg/million cells
showed high antitumor activity, causing death of 64% of cancer cells, including
inducing apoptosis in 12% of cells. Reduction of exposure dose of the protein
reduced its antitumor activity, at the dose of 50 mcg/million cells the protein
caused death of 38% of cancer cells.
Fig. 11. Cytotoxic activity of
Biokor against breast cancer
cells (surgical material from
patient G., 68 years old,
diagnosis - cancer of the left
breast,
T
2
N
1
M
0
). For all the
values of the experimental
groups p <0,05.
The study of antitumor activity of Biokor on uterus endometrium cancer cells.
Endometrial cancer (EC) takes the first place in the structure of onco gynecological
pathology, morbidity growth rate of EC is significantly higher than those of other
cancers of the reproductive system of women [Imyanitov E.N.et.al, 2005 p.1004].
Precancerous condition of endometrial tissue was observed in the sample
from the patient operated with the diagnosis of hysteromyoma.
At a dose of 20 mg/1 million cells the protein caused death of 89,0±0,98% of
tumor cells. Also the study showed appearance of apoptotic cells in the
experimental groups after exposure to Biokor (Figure 12).
Results of Biokor cytotoxic activity against endometrial cells obtained from
surgical specimens of patient diagnosed endometrial cancer stage II, T
2
N
1
M, are
shown in Fig. 13.
As seen from the data obtained, the soy protein at all applied doses showed
high cytotoxic activity against endometrial cancer cells, at a dose of 20 mcg/ 1
million cells the protein caused death of 42.0±1.56% of tumor cells, at a dose of 50
mcg - 50,0±1,58%. In this case the influence of protein on endometrium cancer
cells also showed a significant increase in the number of apoptotic cells in the
experimental groups.
79
Fig. 12 Cytotoxic activity of
Biokor against endometrium
cells (Operating material
from patient diagnosed
hysteromyoma). For all the
values of the experimental
groups p <0,05
The largest number of such cells was observed at exposure at a dose of 20 mcg -
32,0±1,47%, whereas the control group showed the level of apoptotic cells of only
11,0±0,98%.
Fig. 13 Cytotoxic activity of
Biokor against endometrial
cells (surgical specimens of
patient diagnosed
endometrial cancer stage II,
T
2
N
1
M
0
) For all
experimental groups the
values of p <0,05
The study of antitumor activity of Biokor on colon cancer cells.
One of the peculiarities of cancer morbidity dynamics of recent decades is increase
in the incidence of colon and rectum cancer. Currently colon cancer accounts for
nearly 15% of all malignancies in West European countries. It ranks second in the
structure of cancer incidence at males (after lung cancer) and at females (after
breast cancer) [Smith R.A.etal, 2009, p.27].
In tumor tissue obtained from a patient's surgical material M.R., 68 years old,
diagnosis - cancer of the colon, T
4
N
0
M
0
, expression of Bcl-2 and Ki-67
oncoproteins was determined.
Colon cancer cells expressed largely both Bcl-2 and Ki-67 proteins. Expression of
Bcl-2 reached 97,0 ± 0,76% that indicates strong inhibition of apoptosis in cells of
the histogenesis. Expression of Ki-67 protein reached 64,0 ± 2,14%.
Immunohistochemical analysis showed that rectum cancer cells were highly
proliferating tissue with virtually absent apoptotic cells and resistant to
conventional therapy.
After definition of the status of Bcl-2 and Ki-67 oncoproteins, the colon cancer
cells were exposed to Biokor preparation at doses of 50 mcg/1.2 million cells
(Group I) and 100 mcg/1.2 million cells (group II). The control group was rectal
80
