➤

Characteristics of relationship of structure and functions in protein nanoscopic pores

Abstract

Topicality and relevance of the dissertation topics. One of the major problems in modem biophysics is to study the relationship of structure and function of ion channels formed by proteins. On one hand, the ion channels arc nanoscopic pores which exhibit selectivity to ions, ability to selectively transport through the membranes different molecules or respond to them by changing their own properties. On the other hand, some organisms (including highly pathogenic ones) produce proteins that are capable to spontaneously integrate in the host cell membrane and form there ion channels de novo. Not only clinical symptoms of various infectious diseases, but also compositions of medium in which the cells and bacteria exist depend on these proteins. Therefore, nanopores formed by proteins attracted attention of researchers of all over the world, both in terms of basic principles of biophysical and physiological functioning of living cells, and from the practical aspect, as there arc ideas for their use as nano sequencers, components of nano-filter, biosensors and other nanodcvices. The data on what structural characteristics affect nanopore functioning and how selectivity depends on their structure and amino acid composition may help in designing nanoporcs with predetermined properties.
In international publications, scientists noted that knowledge about the structure of protein nanopores and its impact on their properties, can help both in the development of modem medicine and the development of nanodcvices used in modern devices. Most researchers believe that a-hemolysin (a-HL) is the most promising ion channel as a basis of these instruments, and therefore, a large number of papers devoted to the studies of the properties of this channel have been published. The ability of a-HL to form water-filled transmembrane pores in bilayer lipid membranes was first discovered over 35 years ago in Uzbekistan.
This dissertation research to a certain extent is the implementation of the tasks stipulated by the Joint Statement between Uzbekistan and Japan signed in February.
The aim of research work is to conduct structural and functional analysis of nanopores formed by different proteins.
Scientific novelty of the dissertation work includes the followings:
for the first time, using the method of asymmetric application of non-elcctro-lytes, it has been shown that the changes in the pore radius along the axis of the ion channels can be detected;
it was found that the radius of the VDAC ion channel changes upon transition from one to other conduction state;
it was found that the properties of ion channels depend not only on the sign of the charge of the charged groups distributed within a channel, but also by their location along the longitudinal axis of the channel;
a novel method for determining the stoichiometry of channels formed in situ has been proposed;
it is established that the maxi-anion channel does not belong to the family of VDAC proteins;
for the first time, it was demonstrated that blocking of ion channel by polyanions depends on their size and concentration of divalent cations;
it was found that the potential clamped on the membrane causes an elastic deformation of the a-HL pore.
CONCLUSIONS
1. Using the modified method of polymer probing, it was shown for the first time that:
a) the diameters of the two entrances of the a-HL channel arc close to each other and equal to 2.6-2.4 nm (cis/trans); the channel has two narrow portion: the main constriction has a diameter of 1.3 nm and is located approximately in the center of the channel, whereas the second one has a diameter of 1.8 nm and is located closer to the cis entrance of the pore;
b) the diameter of the cis entrance of VCC channel is 1.9 nm, and that of the trans entrance is 1,6 nm; there is a constriction inside the channel with a diameter of 1.2 nm;
c) the diameters of the cis and trans entrance of VDAC ion channel in its high-conductance state arc 2.0 nm and 4.0 nm, respectively. Upon transition to the low-conductance state, the diameters of both entrances decrease and become equal to 1.8 nm and 2.4 nm, respectively. The total decrease in channel volume is ~ 10 nm3, which is about 40% of the total pore volume.
2. Detailed comparison (under physiological conditions) of the biophysical properties of the maxi-anion channel and VDAC has shown that these two ion channels arc formed by different proteins.
3. For the first time, it was shown that introduction of additional negative charges to the structure of a-HL channel changes its selectivity from slightly anionic to highly cationic, whereas introduction of positive charges increases significantly the anionic selectivity. The extent of these changes depends on the radius of the channel at the point of addition of new charges (which mainly affects the selectivity of the ion) and the location of these charges along the longitudinal axis of the channel (which mostly alters the currcnt-to-voltage characteristic). These results demonstrate that the total charge of the pore wall is responsible for the cationanion selectivity of a-HL channel, and the position of the charges at the entrances is the main factor determining the shape of the current-voltage curves.
4. A new method of determining the stoichiometry of oligomeric ion channels has been developed based only on electrophysiological measurements. With this method, it was found that a-HL channel formed in the lipid bilayer membrane is a hcptamcr.
5. It has been established that a polyanion molecule enters into the pore due to electrostatic forces and physically blocks the passage of ions. Blocking probability of the a-HL channel by polyanions depends on the followings:
a) the presence and concentration of divalent cations, which, according to their effectiveness, can be ranked as follows: Zn2+ >Ca2+ >Mg2+;
b) the concentration, molecular weight and structure of the polyanion. Efficiency of effect of polyanions on the channel correlates with their effect on the membrane ^-potential;
c) the side of polyanion addition: addition of polyanions from the trans entrance is more efficient due to the asymmetric structure of a-HL channel.
6. For the first time, it was shown that the applied membrane potential causes an elastic deformation of the a-HL channel, which explains a residual asymmetry of the currcnt-to-voltagc characteristics at high salt concentrations as well as the voltage-dependence of channel block by a complex of 18-crown-6 with potassium cations.

Source type: Abstracts
Years of coverage from 1992
inLibrary
Google Scholar
Catalog of abstracts
Issue:
Branch of knowledge
CC BY f
1-86
44

Downloads

Download data is not yet available.
To share
Download
Merzlyak П. (1970). Characteristics of relationship of structure and functions in protein nanoscopic pores. Catalog of Abstracts, 1(1), 1–86. Retrieved from https://inlibrary.uz/index.php/autoabstract/article/view/48211
1
Citations
Crossref
Сrossref
Scopus
Scopus
Google
Google

Keywords:

nanoparticles / nanotechnology / nanomaterial / crystal / defects / magnetic / ferromagnetic / magnetic cluster

Abstract

Topicality and relevance of the dissertation topics. One of the major problems in modem biophysics is to study the relationship of structure and function of ion channels formed by proteins. On one hand, the ion channels arc nanoscopic pores which exhibit selectivity to ions, ability to selectively transport through the membranes different molecules or respond to them by changing their own properties. On the other hand, some organisms (including highly pathogenic ones) produce proteins that are capable to spontaneously integrate in the host cell membrane and form there ion channels de novo. Not only clinical symptoms of various infectious diseases, but also compositions of medium in which the cells and bacteria exist depend on these proteins. Therefore, nanopores formed by proteins attracted attention of researchers of all over the world, both in terms of basic principles of biophysical and physiological functioning of living cells, and from the practical aspect, as there arc ideas for their use as nano sequencers, components of nano-filter, biosensors and other nanodcvices. The data on what structural characteristics affect nanopore functioning and how selectivity depends on their structure and amino acid composition may help in designing nanoporcs with predetermined properties.
In international publications, scientists noted that knowledge about the structure of protein nanopores and its impact on their properties, can help both in the development of modem medicine and the development of nanodcvices used in modern devices. Most researchers believe that a-hemolysin (a-HL) is the most promising ion channel as a basis of these instruments, and therefore, a large number of papers devoted to the studies of the properties of this channel have been published. The ability of a-HL to form water-filled transmembrane pores in bilayer lipid membranes was first discovered over 35 years ago in Uzbekistan.
This dissertation research to a certain extent is the implementation of the tasks stipulated by the Joint Statement between Uzbekistan and Japan signed in February.
The aim of research work is to conduct structural and functional analysis of nanopores formed by different proteins.
Scientific novelty of the dissertation work includes the followings:
for the first time, using the method of asymmetric application of non-elcctro-lytes, it has been shown that the changes in the pore radius along the axis of the ion channels can be detected;
it was found that the radius of the VDAC ion channel changes upon transition from one to other conduction state;
it was found that the properties of ion channels depend not only on the sign of the charge of the charged groups distributed within a channel, but also by their location along the longitudinal axis of the channel;
a novel method for determining the stoichiometry of channels formed in situ has been proposed;
it is established that the maxi-anion channel does not belong to the family of VDAC proteins;
for the first time, it was demonstrated that blocking of ion channel by polyanions depends on their size and concentration of divalent cations;
it was found that the potential clamped on the membrane causes an elastic deformation of the a-HL pore.
CONCLUSIONS
1. Using the modified method of polymer probing, it was shown for the first time that:
a) the diameters of the two entrances of the a-HL channel arc close to each other and equal to 2.6-2.4 nm (cis/trans); the channel has two narrow portion: the main constriction has a diameter of 1.3 nm and is located approximately in the center of the channel, whereas the second one has a diameter of 1.8 nm and is located closer to the cis entrance of the pore;
b) the diameter of the cis entrance of VCC channel is 1.9 nm, and that of the trans entrance is 1,6 nm; there is a constriction inside the channel with a diameter of 1.2 nm;
c) the diameters of the cis and trans entrance of VDAC ion channel in its high-conductance state arc 2.0 nm and 4.0 nm, respectively. Upon transition to the low-conductance state, the diameters of both entrances decrease and become equal to 1.8 nm and 2.4 nm, respectively. The total decrease in channel volume is ~ 10 nm3, which is about 40% of the total pore volume.
2. Detailed comparison (under physiological conditions) of the biophysical properties of the maxi-anion channel and VDAC has shown that these two ion channels arc formed by different proteins.
3. For the first time, it was shown that introduction of additional negative charges to the structure of a-HL channel changes its selectivity from slightly anionic to highly cationic, whereas introduction of positive charges increases significantly the anionic selectivity. The extent of these changes depends on the radius of the channel at the point of addition of new charges (which mainly affects the selectivity of the ion) and the location of these charges along the longitudinal axis of the channel (which mostly alters the currcnt-to-voltage characteristic). These results demonstrate that the total charge of the pore wall is responsible for the cationanion selectivity of a-HL channel, and the position of the charges at the entrances is the main factor determining the shape of the current-voltage curves.
4. A new method of determining the stoichiometry of oligomeric ion channels has been developed based only on electrophysiological measurements. With this method, it was found that a-HL channel formed in the lipid bilayer membrane is a hcptamcr.
5. It has been established that a polyanion molecule enters into the pore due to electrostatic forces and physically blocks the passage of ions. Blocking probability of the a-HL channel by polyanions depends on the followings:
a) the presence and concentration of divalent cations, which, according to their effectiveness, can be ranked as follows: Zn2+ >Ca2+ >Mg2+;
b) the concentration, molecular weight and structure of the polyanion. Efficiency of effect of polyanions on the channel correlates with their effect on the membrane ^-potential;
c) the side of polyanion addition: addition of polyanions from the trans entrance is more efficient due to the asymmetric structure of a-HL channel.
6. For the first time, it was shown that the applied membrane potential causes an elastic deformation of the a-HL channel, which explains a residual asymmetry of the currcnt-to-voltagc characteristics at high salt concentrations as well as the voltage-dependence of channel block by a complex of 18-crown-6 with potassium cations.


background image

БИООРГАНИК КИМЁ ИНСТИТУТИ ВА ЎЗБЕКИСТОН МИЛЛИЙ

УНИВЕРСИТЕТИ ҲУЗУРИДАГИ ФАН ДОКТОРИ ИЛМИЙ
ДАРАЖАСИНИ БЕРУВЧИ 16.07.2013.К/В/Т.13.01 РАҚАМЛИ

ИЛМИЙ КЕНГАШ

БИООРГАНИК КИМЁ ИНСТИТУТИ, ПЕРНАМБУКО ФЕДЕРАЛ

УНИВЕРСИТЕТИ

МЕРЗЛЯК ПЕТР ГРИГОРЬЕВИЧ

НАНОСКОПИК ОҚСИЛ ПОРАЛАРИ СТРУКТУРА ВА

ФУНКЦИЯЛАРИНИНГ ЎЗАРО БОҒЛИҚЛИГИНИ ТАВСИФЛАШ

03.00.02 – Биофизика ва радиобиология

ДОКТОРЛИК ДИССЕРТАЦИЯСИ АВТОРЕФЕРАТИ

Тошкент – 2016

Докторлик

диссертацияси

мавзуси

Ўзбекистон

Республикаси

Вазирлар

Маҳкамаси ҳузуридаги Олий аттестация комиссиясида 30.09.2014/В2014.5.В73 рақам
билан рўйхатга олинган


background image

Докторлик диссертацияси Биоорганик кимѐ институти ва Бразилиянинг Пернамбуко

Федерал университетида бажарилган.

Диссертация автореферати уч тилда (ўзбек, рус, инглиз) Илмий кенгаш веб-саҳифаси

(http://ss.biochem.uz)

ва

“ZiyoNet”

таълим

ахборот

тармоғида

(www.ziyonet.uz)

жойлаштирилган.

Илмий маслаҳатчи: Красильников Олег Владимирович

биология фанлари

доктори, профессор

Расмий оппонентлар: Мирходжаев Улуғбек 3акирович

биология фанлари

доктори, профессор

Мадьяров Шухрат Раимджанович

биология фанлари доктори

Турдикулова Шахло Уткуровна

биология фанлари доктори

Етакчи ташкилот: ЎзР ФА Микробиология институти

Диссертация ҳимояси Биоорганик кимѐ институти ва Ўзбекистон Миллий университети
ҳузуридаги 16.07.2013.K/B/T.13.01 рақамли Илмий кенгашнинг 2016 йил
«____»___________ соат____да ўтадиган мажлисида бўлади (Манзил: 100125, Тошкент
шаҳри, Мирзо Улуғбек кўчаси, 83. Тел.: 262 35 40; факс: (99871) 262 70 63). Диссертация
билан Биоорганик кимѐ институти Ахборот-ресурс марказида танишиш мумкин. (Манзил:
100125, Тошкент шаҳри, Мирзо Улуғбек кўчаси, 83. Тел.: (99871) 262 35 40, факс: (99871)
262 70 63, e-mail: asrarov54@mail.ru).

Автореферат 2016 йил «___»___________ да тарқатилди.
(2016 йил_____________ даги №____ рақамли реестр баѐнномаси).

А.С.Тураев

Фан доктори илмий даражасини берувчи Илмий кенгаш

раиси, к.ф.д., профессор

М.И. Асраров

Фан доктори илмий даражасини берувчи Илмий кенгаш

илмий котиби, б.ф.д., профессор

Д.А. Кадирова

Фан доктори илмий даражасини берувчи Илмий кенгаш

ҳузуридаги илмий семинар раиси, б.ф.д.

КИРИШ (Докторлик диссертацияси аннотацияси)

Диссертация мавзусининг долзарблиги ва зарурати.

Жаҳонда

оқсиллардан ташкил топган ион каналларининг структура ва функцияларини
ўзаро боғлиқлигини тадқиқ қилиш замонавий биофизиканинг энг муҳим
вазифаларидан бири ҳисобланади. Ион каналлари наноскопик поралар бўлиб,


background image

ионлар

учун

селективлик

хусусиятига

эга,

у мембранадан турли

молекулаларни танлаб ўтказади ѐки уларнинг таъсирига жавобан ўзининг
хусусиятларини ўзгартиради. Сўнгги тадқиқот натижаларига биноан айнан
ион каналлари сенсор вазифасини бажаради, яъни тирик организмларнинг
ҳароратини ўлчаш, ҳид, таъм ва ѐруғликни ҳис қилади.

Шу билан бирга, баъзи микроорганизмлар (ва шу қаторда юқори

патогенлилар) ишлаб чиқарган оқсиллар ўз-ўзидан хўжайин ҳужайра
мембранасига жойлашиб, у ерда

de novo

(яъни янгидан) ҳосил бўлган ион

каналларидан ионлар билан бирга сувда эрувчан метаболитларни бошқарувга
бўйсинмайдиган ўтиши ҳужайрани ўлимига олиб келади. Бу оқсиллар
нафақат касалликларнинг клиник кўриниши учун жавобгар, балки ҳужайра
ва бактериялар жойлашган муҳитнинг таркиби ҳам ушбу оқсилларга боғлиқ
ҳолда ўзгаради. Шу сабабли оқсиллардан ҳосил бўлган нанопоралар бутун
дунѐ тадқиқотчиларининг диққат марказида, чунки фундаментал нуқтаий
назардан

нанопоралар тирик ҳужайралар функциясининг физиологик ва

биофизикавий хусусиятларини тушунтириб берса, амалий томондан уларни
нано-қурилмалар

сифатида ишлатиш мумкинлиги тўғрисида ғоя мавжуд.

Жаҳондаги

ўтказилаѐтган тадқиқотларда такидланаѐтганидек, оқсил

нанопоралар

структураси ва унинг хусусиятларига таъсири хақидаги

билимлар янги дорилар

ва замонавий ускуналар учун нано-қурилма

яратишда аҳамиятга эга.

Кўпчилик тадқиқотчилар нано-қурилмаларнинг асоси сифатида энг

истиқболли ион каналлари бу

Staphyloccus aureus

бактериялари ҳосил қилган

α-гемолизин (α-ГЛ) деб ҳисоблашади, шунинг учун кўп сонли илмий
тадқиқотлар шу каналга бағишланган. Таъкидлаш керакки, α-ГЛнинг
қўшқаватли липид мембраналарда сувга тўлган трансмембрана пора ҳосил
қилиши, бундан 35 йил аввал Ўзбекистонда аниқланган.

Юқоридагилардан диссертация мавзуси ўта муҳимлиги ва зарурлиги

кўринади, ушбу ион каналларининг функциясига оқсилларнинг қайси
структуравий ўзига хослиги таъсир қилиши, уларнинг селективлиги канал
тузилишига ва аминокислоталар таркибига қандай боғлиқлиги ҳақидаги
натижалар олдиндан мўлжалланган хусусиятларга эга бўлган нанопоралар
яратилишига ѐрдам беради.

Ушбу диссертация тадқиқоти 2011 йил феврал ойида имзоланган

Ўзбекистон ва Япония ўртасидаги Қўшма баѐнотда белгиланган вазифаларни
амалга оширишга муайян даражада хизмат қилади.

Тадқиқотнинг республикаси фан ва технологиялари ривожланиши

устувор йўналишларига боғлиқлиги.

Мазкур тадқиқот республика фан ва

технологиялар ривожланишининг V. «Қишлоқ хўжалиги, биотехнология,
экология ва атроф муҳитни ҳимоя қилиш» устувор йўналишига мувофиқ
бажарилган.

5

Диссертация мавзуси бўйича хорижий илмий тадқиқотлар шарҳи.

Оқсил пораларини структура ва функцияларининг ўзаро боғлиқлигини энг


background image

замонавий усулларни қўллаган ҳолда ўрганишга йўналтирилган изланишлар
жаҳоннинг етакчи илмий марказлари ва олий таълим муассасалари,
жумладан, University of Manitoba (Италия), Columbia University, University of
Chicago,University of Maryland (АҚШ),Миллий Физиология институти
(Япония), Ҳужайра биофизика институти (Россия), Ўзбекистон миллий
университети ва бошқа илмий марказларда олиб борилмоқда.

Оқсил нанопоралари структураси бўйича жаҳонда олиб борилган илмий

тадқиқотлар натижасида қатор, жумладан, қуйидаги илмий натижалар
олинган: вольтга боғлиқ анион каналининг (VDAC) тузилишли модели
аниқланган (University of Manitoba, Италия) ва унинг функционал ўзига
хослиги исботланган (University of Maryland, АҚШ); цитолизин

V. cholerae

El

Torнинг кристалли структураси аниқланган (Columbia University, АҚШ); α
гемолизиннинг (α-ГЛ) структураси гептамер эканлиги аниқланган ва унинг
кристалл структураси (University of Chicago, АҚШ) исботланган.

Жаҳонда ион каналларини ўрганишда бир қатор устувор йўналишларда

тадқиқотлар олиб борилмоқда, шу жумладан: механосезгир ва TRP
каналларини структура ва функцияларининг ўзаро таъсирини аниқлаш; канал
ички тузилишининг потенциалга боғлиқ ўзгаришини исботлаш, турли
органик

молекулаларнинг нанопора хоссаларига таъсирини аниқлаш; энг

янги нано секвенаторлар яратиш; токсик оқсиллардан канал ҳосил қилувчи
α-ГЛ ва

Mycobacterium smegmati

порин А структураси ва функцияларини

аниқлаш.

Муаммонинг ўрганилганлик даражаси.

Staphylococcus aureus

бакте

риялари синтезловчи экзотоксин α-ГЛ бугунги кунда жуда яхши ўрганилган

ва истиқболли нанопора ҳосил қилувчи оқсиллардан бири ҳисобланади.

Унинг бирламчи ва кристалли структураси аниқланган бўлиб, потенциалга

боғлиқлиги ва селективлик хусусиятлари батафсил ўрганилган. Шунинг учун

бу нанопоралар тадқиқотларида идеал даражадаги модел система ҳисоб

ланадики, унинг структурасини молекуляр-биологик методлар билан ўзгар

тириш мумкин. Мисол учун, сайт-йўналтирилган мутагенез методи ѐрдамида
нанопоралар ичидаги ѐки унинг кириш жойидаги асосий заряд-лар сонини ва

уларнинг жойлашишини ўзгартириш имкони мавжуд. Хорижий олимлардан

проф. Х.Байли, Дж.Касиановичнинг илмий ишларида липид мембранада

жойлашган α-ГЛдан ташкил топган нанопораларнинг ички тузилишини ва

ундан турли молекулаларнинг ўтишига таъсирини тўлиқ ўрганилган. Проф.

С.Бхакди раҳбарлигида цитолизин

V. cholerae El Tor

. Тад-қиқ қилинган.

Ҳужайра мембранасининг моддалар транспорти жараѐнида муҳим рол

ўйнайдиган табиий мембраналардаги вольтга боғлиқ анион канал-лари проф.

М.Коломбини ишларида тўлиқ ўрганилган. Ҳозирги кунда макси-анион

канали устида проф. Я.Окада бошчилигидаги гуруҳ изланиш олиб боради.

Мамлакатимизда

ион

каналлари

бўйича

тадқиқотлар

акад.

Б.А.Ташмухамедов, профессорлар П.Б.Усманов ва Р.З.Сабиров раҳбарлигида
олиб борилмоқда, жумладан α-ГЛ, қорақурт ўргимчак заҳаридан олинган
латротоксин ўрганилмоқда, умуртқалилар ва бўғмоѐқлиларнинг қўзғалган


background image

6

мембранасидаги натрий каналларини блокловчи бир қатор янги токсинлар
ажратилган.

Диссертация мавзусининг диссертация бажарилаѐтган илмий

тадқиқот муассасининг илмий ишлари билан боғлиқлиги.

Диссертация

тадқиқоти Биоорганик кимѐ институтининг «Бир қанча оқсил токсинларидан
ҳамда, бир қанча абиоген омиллардан ва табий мембраналардаги
изолирланган

оқсиллардан

ҳосил

бўлган

ион

каналларидаги

сув

пораларининг геометрик параметрларини ўрганиш» (1997-1999 йй.), Ф-4.1.3
«Сунъий ва табиий мембраналарда ион каналлари ва транспортерларнинг
хусусиятларини ва уларнинг ҳужайра ҳажм бошқарилишдаги ролини
ўрганиш» (2003-2007 йй.), ФА-Ф3-Т112 «Ҳайвонлар ва ўсимликлар
ҳужайралари ҳажми бошқарилишининг биофизик механизмлари » (2007-2011
йй.), ФА-Ф5-Т080 «Ҳажмга боғлиқ анион транспортининг молекуляр
физиология ва биофизикаси» (2012-2016 йй.) мавзусидаги лойиҳалар ҳамда
Пернамбуко Федерал университетнинг Биофизика ва радиобиология
департаменти (Бразилия) ИТИ тематик планлари доирасида, Япониянинг
Миллий физиология институти ва Биоорганик кимѐ институти ўртасидаги
ҳамкорлик меморандуми доирасида бажарилган.

Тадқиқот мақсади

турли оқсиллардан ташкил топган ион каналларида

структура-функционал ўзаро боғлиқликни аниқлашдан иборат.

Тадқиқотнинг вазифалари

:

ион канали узунлик ўқи бўйича поранинг радиусини ўзгаришини

аниқлаш;

VDACдан ташкил топган сув пораларининг радиусини юқори ва қуйи

ўтказувчанлик холатларда аниқлаш;

нанопоралар стехиометриясини аниқлашнинг янги услубини ишлаб

чиқиш;

цистеин-сканирловчи мутагенез методи ѐрдамида нанопоралар ион

ўтказувчанлик хусусиятига,α-ГЛ молекуласининг таркибига кирувчи турли
аминокислоталар таъсирини аниқлаш;

цистеин-сканирловчи мутагенез методи ѐрдамида каналнинг ион

ўтказувчанлик хусусиятига таъсир кўрсатувчи аминокислоталарнинг кимѐвий
модификацияси устида тадқиқотлар ўтказиш;

α-ГЛ нанопораси ион ўтказувчанлик хусусиятига таъсир кўрсатувчи

полианионлар ва краун-эфирлар таъсирини ўрганиш;

макси-анион каналининг VDAC оиласига кирувчи оқсиллардан

эканлигини текшириш.

Тадқиқотнинг объекти

оқсиллардан ташкил топган ион-ўтказувчан

нанопоралар ҳисобланади.

Тадқиқот предметини

нанопоралар хусусиятларини оқсилларнинг

структурасига ва уларнинг аминокислоталар таркибига боғлиқлиги ташкил
этади.

Тадқиқот усуллари.

Тадқиқотларда фойдаланилган усуллар энг замонавий


background image

электрофизиологик ва биокимѐвий бўлиб, Мюллер ва Монталл Мюллер усули

ѐрдамида қўшқават липид мембраналар ҳосил қилинган,

7

мембрана электрик параметрларини потенциал фиксацияси шароитида тўлиқ

компьютерда амалга оширилган ҳамда цистеин-сканирловчи мутагенез
усулидан ва оқсилларни ажратиш каби усуллар қўлланган.

Компьютер программаларидан Originнинг 5 ва 8.6 ҳамда молекуляр

моделларни шакиллантиришда Swiss-PDBViewer, Ver. 3.7 ва CS Chem3D Pro
(CambridgeSoft, Cambridge, MA) программалари каби тадқиқот ва таҳлил
усуллари қўлланган.

Тадқиқотнинг илмий янгилиги

қуйидагилардан иборат

:

илк бор ион каналларининг ўқи бўйлаб поранинг радиусини ўлчаш

мумкинлиги исботланган;

VDAC ион канали ўтказувчанлигини бир ҳолатдан иккинчисига ўтганда

унинг радиуси ўзгариши аниқланган;

ион каналларининг хусусиятлари нафақат зарядланган гуруҳларнинг

зарядига боғлиқ, балки уларнинг канал бўйлаб жойлашган ўрнига ҳам боғлиқ
эканлиги аниқланган;

олигомер нанопораларнинг стехиометриясини

in situ

аниқлашнинг янги

усули ишлаб чиқилган;

макси-анион канали VDAC оқсиллар оиласига мансуб эмаслиги

аниқланган;

илк бор полианионларнинг ион каналларини блоклаши уларнинг

ўлчамларига боғлиқлиги билан биргаликда икки валентлик катионларнинг
концентрациясига боғлиқлиги исботланган;

мембранада фиксация қилинган потенциал α-ГЛ пораларнинг эластик

деформацияга учратиши аниқланган.

Тадқиқотнинг амалий натижаси.

In situ

олигомер нанопоралардаги

мономерлар сони асосида, физиологик шароитга максимал яқин шароитда
ион каналларининг стехиометриясини аниқлашнинг янги усули тавсия
қилинди.

Тадқиқот натижаларининг ишончлилиги

ишда қўлланилган ѐндашув

ва усуллар, назарий маълумотларнинг олинган тажриба натижалари билан
мос

келиши,

лаборатория

тажрибалардаги замонавий биофизикавий

жараѐнларни аниқлаш адекват методлар билан амалга оширилганлиги,
тажриба маълумотларининг корреляцион статистик таҳлил қилинганлиги
билан изоҳланади.

Тадқиқот натижаларининг илмий ва амалий аҳамияти.

Тадқиқот

натижаларининг илмий аҳамияти бу илмий иш авваламбор фундаментал
бўлиб, оқсилли наноскопик поралар хусусиятларининг аминокислотали
таркибига ва оқсилларнинг тузилишига боғлиқлигига аниқлик киритиш
имконини яратади ва нано-датчиклар ясаш учун зарур хусусиятга эга бўлган
нанопоралар ҳосил қилишга ѐрдам беради.

Олинган натижалар нанотехнологияда амалий қўлланилади, яъни


background image

замонавий қурилмада қўлланиладиган нано-датчиклар, нано-секвенаторлар,
нано-фильтр компонентлар, биосенсорлар ва бошқа нано-қурилмаларни
яратишда асос бўлиб хизмат қилади. Шу билан бирга натижаларни

8

фармакологияда, биомедицинада ва наноскопик поралар блокаторларини
ишлаб чиқиш тадқиқотларида қўллаш мумкин.

Тадқиқот

натижаларининг

жорий

қилиниши.

Физиологик

шароитларда ион каналлари тузилишини аниқлашда қўлланиладиган янги
биофизик методлар:

Сокендай университети ва Япония Миллий физиология институтида

эътироф

этилиб,

оқсил

нанопораларининг

тузилишини

аниқлашда

фойдаланилган (Сокендай университети, Япония, Канагава, 2016 йил 10
мартдаги маълумотномаси). Ушбу янги биофизик методлар Ўзбекистон
Республикаси Фанлар академияси томонидан эътироф этилган (Ўзбекистон
Республикаси

Фанлар

академиясининг

2016

йил

10

майдаги

маълумотномаси). Бу методлар турли олигомер ион каналларини радиусини
ўлчаш ва стехиометриясини исботлаш имконини беради;

Пернамбуко

Федерал

университети

(Бразилия)

Биофизика

ва

радиобиология департаментида оқсил нанопоралари ион оқимлари ўзгариши
асосида ўта заҳарли оқсиллар – микроцистинларни танлаб аниқлайдиган
нанодатчик ишлаб чиқилган (Биофизика ва радиобиология департаментнинг
2016 йил 2 майдаги маълумотномаси). Бу нанодатчик гемодиализ тизимидаги
циклик пептид токсинларни аниқлаш имконини беради.

Тадқиқот натижаларининг апробацияси.

Тадқиқот натижалари 21 та

илмий-амалий анжуманларда, жумладан, «Экспериментал биология жамияти
федерацияси» (FESBE) (Бразилия, 1996-2003, 2005) нинг XI-XVIII, ХХ
кенгашларида, ҳар йили ўтказиладиган Биофизика жамиятининг 43, 44, 48
кенгашларида (АҚШ, 1999, 2000, 2004), Жанубий Конуснинг IV Биофизик
конгрессида (Кампинас, Бразилия, 2000), Пора ҳосил қилувчи токсинлар IV
Халқаро семинарида (Тренто, Италия 2000), Пора ҳосил қилувчи
токсинлар,V Халқаро семинарида (Майнц, Германия, 2004), Япония
физиологлар жамиятининг ҳар йили ўтказиладиган 87 съездида (Мориока,
Япония, 2010) мавзуларидаги республика ва халқаро илмий-амалий
конференцияларда маъруза кўринишида баѐн этилган ҳамда апробациядан
ўтказилган.

Тадқиқот натижаларининг эълон қилиниши.

Диссертация мавзуси

бўйича жами 38 та илмий иши чоп этилган, Ўзбекистон Республикаси Олий
аттестация комиссиясининг докторлик диссертациялари асосий илмий
натижаларини чоп этиш тавсия этилган илмий нашрларда 14 та мақола
барчаси хорижий журналларда нашр этилган.

Диссертациянинг тузилиши ва ҳажми.

Диссертация таркибикириш,

олтита боб, хулоса, фойдаланилган адабиѐтлар рўйхатидан иборат.
Диссертациянинг ҳажми 198 бетни ташкил этган.


background image

9

ДИССЕРТАЦИЯНИНГ АСОСИЙ МАЗМУНИ

Кириш

қисмида ишнинг долзарблиги ва мавзунинг янгилиги ва

зарурлиги

асослаб

берилган,

мақсад

ва

вазифалар

таърифланган,

тадқиқотнинг объект ва предмети аниқланган, тадқиқотларнинг Ўзбекистон
Республикаси

фан ва технологияларни ривожлантиришнинг устувор

йўналишларига мос келиши кўрсатилган, тадқиқотларнинг илмий янглиги ва
амалий натижалари ѐритилган, олинган натижаларнинг ишончлилиги
асосланган, қўлга киритилган натижаларнинг назарий ва амалий аҳамияти
ѐритилган, нашр этилган ишлари тўғрисида ва диссертация структураси
ҳақида малумотлар келтирилган .

Диссертациянинг

«Тадқиқ қилинаѐтган канал ҳосил қилувчи

оқсилларнинг структура ва хусусиятлари»да

, деб номланган биринчи

бобида, нанопораларга бағишланган тадқиқотлар юзасидан ҳамда уларнинг
тузилиши ва функцияларига тегишли адабиѐтлар тўлиқ ѐритилган, шу билан
бирга

ушбу

диссертация тадқиқотларидаги барча турдаги оқсилли

каналларнинг

тузилиши ва хусусиятлари тўғрисида энг замонавий

маълумотлар келтирилган.

Диссертациянинг

«Канал ҳосил қилувчи оқсилларнинг ажратилиши

ва уларнинг тадқиқот усуллари

» деб номланган иккинчи бобида , ушбу

илмий ишда ишлатилган оқсилларнинг олиниш усуллари тўлиқ ѐритилган,
ҳамда тадқиқотларда ишлатилган электрофизиологик методлар аниқ ва
равшан баѐн қилинган.

Диссертациянинг

«Ион каналларининг полимер зондирлаш

» деб

номланган учинчи бобида, илмий ишнинг асосий натижалари, ион
каналларини радиусини аниқлаш тадқиқотлари асосида келтирилган.

α-ГЛ

каналнинг ўқи бўйича пора радиусининг ўзгаришини аниқлаш. Staphylococcus
aureus

бактерияси синтез қилувчи экзотоксин α-гемолизин сувда эрувчан

мономер ҳисобланади. Бу полипептид 293 та аминокслота қолдиғидан иборат
бўлиб, 33,2 кДа молекуляр массани ташкил қилади ва мембранада
гомогептамер поралар ҳосил қилади. (Gouaux et al., 1994).

α-ГЛ каналининг ҳар бир алоҳида кириш жойининг ўлчамини аниқлаш

ва унинг геометрияси тўғрисида маълумот олиш учун биз канал
ўтказувчанлигини ноэлектролитларнинг БЛМга нисбатан асимметрик бир
томонлама, яъни

цис

ѐки

транс

ҳолатида киритилганда ўлчаш ишларини

олиб бордик. Бу усул билан якка ион каналларининг асосий қисми
ўтказувчанлигини ўртача катталигини ноэлектролитларни каналнинг

цис

(g

cis

)


background image

ѐки

транс

томони (g

trans

) ҳолатида аниқладик. Канал радиусини яна хам аниқ

ўлчаш учун биз полимерларнинг гидродинамик радиусига боғлиқ ҳолда
каналнинг тўлишини анализ қилдик. Поралар структурасининг ўзига
хослигини адекват таърифлаш учун полимерлар билан тўлиш F(w)
коэффициентидан фойдаландик. Мувозанат шароитида (полимерларнинг
симметрик аппликациясида) тўлиш коэффициенти 1га тенг бўлади. Бунда
катта бўлмаган ноэлектролитлар концентрацияси пора ичида ва эритмада бир
хил бўлади.

10

1-расм. F

cis

ва F

trans

полимер

ларнинг гидродинамик радиусига

боғлиқлиги.

Хатоликлар символдан кичик ѐки

тенг. Стрелкалар критик

нуқталардаги радиуслар ўлчам

ларини кўрсатади. Эритма таркиби

100 мМ KCl, 5 мМ Трис/цитрат, рН

7,5; 20% ПЭГ. Ҳар бир нуқта поли

мерларнинг мавжуд ѐки йўқлигидаги

(n=150-300) амплитудалар бўйича

каналларнинг тақсимланиш гисто

граммасидан олинган.

Тўлиш коэффициенти F(w) қуйидаги тенглама ѐрдамида ҳисобланди

(Krasilnikov et al., 1998):

χ

( ( )) ( )

g g w w

F w

0

−

( )

=

(1)

χ χ

( ( )) ( )

0

−

w g w

Бу ерда g

0

ва

χ

0

– каналдан ўтмайдиган полимер мавжудлигидаги канал

ўтказувчанлиги ва эритманинг электро ўтказувчанлиги; g(w) ва

χ

(w) –

каналдан ўтувчи полимер мавжудлигидаги канал ўтказувчанлиги ва
эритманинг электро ўтказувчанлиги. Кутилганидек, тўлиш коэффициенти F

(1-расм) полимер молекулаларининг гидродинамик радиусига боғлиқ бўлди.

F нинг максимал кўрсаткичи, молекуларининг радиуслари 0,6дан кичик
бўлган ноэлектролитлар мавжуд бўлганда кузатилди. Шубҳасизки, порадан
ўтаѐтган глицерин молекуласи оқимини тўхтатувчи каналнинг торайган
қисми йўқ. Катта гидродинамик радиусли полимерлар учун биз F

cis

и F

trans

нинг

турли

ўлчамларини

кузатдик

ва

бу

канал

геометриясининг


background image

асимметриясидан далолат беради. Бу икки ҳолатда ҳам полиэтилен гликоллар
(ПЭГ) тўлиш коэффициентининг гидродинамик радиусга боғлиқлигининг
икки фазалиги каналнинг ичида торайган қисми борлигидан далолат беради.

Каналнинг

цис

томонини тўлдириш учун олиб борилган тадқиқотларда

ПЭГнинг катта радиусли молекулалари учун қуйироқ даражадаги F (F

cis

~ 0)

кузатилди. Радиуси 1,22 нмдан катта молекулалар

цис

тарафдан каналга

кираолмайди, полимер молекулалари ўлчамларини кичрайтириш секин –аста
тўлишнинг икки фазали ўсишига олиб келади. Бу икки фазали график шуни
кўрсатадики, каналнинг сув порасининг ўлчами

цис

киришдан

транс

киришга силлиқ ўзгармайди. Бу боғлиқликни учта чизиқ билан таърифлаш
мумкин. Биринчи чизиқ молекулаларнинг радиуси 0,9 дан 1,22 нмгача бўлган
оралиққа тўғри келади. Иккинчи чизиқ нисбатан давомли F = 0,36 инвариант
қисмга тўғри келади. Учинчи чизиқ глицерин билан PEG300 (r = 0,31 - 0,6 нм)
орасидаги F параметрининг қиялигини акс эттиради. Тахминимизча, полимер
радиуси (r) билан F

cis

нинг боғлиқлигини аппроксимация қилувчи биринчи

чизиқ ва (F

cis

≈

0)нинг инвариант қисмининг энг қуйи қийматининг

11

кесишган нуқтаси каналнинг

цис

кириш қисмининг радиусини (1,26 нм)

белгилаб беради. Биринчи ва иккинчи чизиқларнинг кесишган жойи
каналнинг

цис

кириш томонидаги биринчи торайган жойнинг радиусини (0,9

нм) беради. Шу ва ундан кичкина ўлчамдаги полимерлар биринчи ва
иккинчи торайган жойлар қисмига уларнинг радиусига боғлиқ бўлмаган
ҳолда жойлашади. Уларнинг хажми поранинг иккинчи торайган қисми
ўлчамидан ҳам кичиклашиши иккинчи ва учинчи чизикларнинг 0.6 нмда
кесишувида амалга ошади. Шу тарзда, канал радиуси 1.25 нм дан 0.9 нм гача
кичраяди, сўнгра эса радиус асосий тораший жойигача (0.6 нм) ўзгармайди.
F

cis

=0,36 бўлганда нисбатан узун бўлган оралик инвариант бўлимнинг

мавжудлиги шуни кўрсатадики, 0.9 нм дан 0.6 нмгача бўлган гидродинамик
радиусли ПЭГ молекулалари поранинг шу қисмини тахминан бирдек
самарали тўлдиради. Уларнинг поралари ўқи бўйлаб кириб боришини асосий
торайиш чеклайди. Бу торайишнинг тахминий жойлашувини шу “плато”нинг
тўлдирилиш қийматини F

cis

нинг максимал қийматига бўлган нисбати бўйича

аниқлаш мумкин: 0.36/0.6=0,6 (Krasilnikov et al., 1998).

Транс

кириш орқали канални тўлдириш тажрибаларида ҳам F

trans

нинг

ноэлектролитларнинг гидродинамик радиусига боғликлигининг икки фазали
характери кузатилди (1-расм).

Цис

тўлдириш бўйича экспериментлар каби,

1.22 нмдан катта радиусли молекулалар каналга

транс

кириш орқали умуман

кирмади (F

trans

=0). Полимерларнинг порадан тўлиқ ажратилиши худди

цис

тўлдиришни амалга оширган ПЭГларда кузатилди. Бундан хулоса қилиш
мумкинки,

транс

кириш

цис

кириш билан катталик жиҳатидан яқин. Худди

олдинги

ҳол

каби,

полимер

ҳажмининг

кичрайиши

тўлдирилиш

параметрининг

прогрессив

катталашишига

олиб

келди.

F

trans

нинг

ноэлектролитларнинг радиусига боғликлиги 4та қисмга бўлиниб, 4та тўғри


background image

чизиқ билан аппроксимация қилиниши мумкин. Биринчи чизик (ўнгдан
чапга) 0.8 нмдан 1.22 нм оралиғидаги молекулаларга тўғри келади. Бу ва
пастдаги F

trans

боғликлигининг инвариант бўлимига тегишли чизиқнинг

кесишуви каналнинг

транс

киришининг радиусини белгилаб беради (1.24

нм).

Глицериндан

тортиб

ПЭГ300

(0.31-0.6нм)гача

бўлган

молекула

хажмлари диапазонида тўлиқлигича тушунилмаган сабабларга кўра F

trans

F

cis

дан сифат жихатидан фарқ қилади. Зондловчи молекулаларининг ҳажми
кичрайиши натижасида F

cis

ўсиб бораѐтган вактда, F

trans

ПЭГ300 ҳажмида

ўзининг максимал қийматига етгунча тўйинади. Бошланғич хулоса сифатида
0.7 нм радиусли асосий торайиш мавжудлигини ва унинг пора ўқидаги ўрни
F

trans

нинг бу радиусда баланд қиймати (0.4) туфайли

цис

киришга яқин

жойлашганлигини қабул килиш мумкин.

Биз якка каналлар ўтказувчанлигининг полимер ноэлектролитли муҳитда

соддалаштирилган тахлилимиз натижасидан шундай хулосага

келдикки,

каналнинг хар икки томонлама киришининг радиуси бир хил бўлиб 1.2-1.3нм
га яқин. Шунингдек, яна бир хулоса шуки, каналда ифодаланган 0.6-0.7
радиусли асосий торайиш мавжуд.

Цис

тўлдириш бўйича

ўтказилган

тажрибалар шуни кўрсатдики,

цис

кириш ва асосий торайиш

12

орлиғида жойлашган 0.9 нм радиусли иккинчи торайиш ҳам мавжудлигини

тахмин килишимиз мумкин (2-расм).

Олинган натижаларни канал тузилиши ҳақидаги кристаллографик

маълумотлар (Song et al., 1996) билан солиштириб кўрилди. Бу мақола
муаллифлари канал тузилишини 3та бўлимга ажратадилар, шундан 2таси,
қалпоқча ва поя (ѐки ўзак), канал очилишини ҳосил килади, ва бизнинг
тадқиқотимизда

цис

ва

транс

кириши деб белгиланган. Канал порасининг

узунлиги 10 нм ни ташкил қилади,

цис

киришнинг радиуси эса 1,4 нм ни

ташкил қилади.

Цис

киришдан 3,5 нм масофада канал ўзининг максимал

радиусига эришади. Поранинг тор 0,7 нм радиусли бўлими каналнинг
марказий қисмида жойлашган. Шунингдек аниқландики, ўзак бўлимида пора
радиуси, аминокислталарнинг 1,3 нм радиусли цилиндр ичига кириб борувчи
ѐн занжирлари ҳажмидан келиб чиқиб, 0,7 нм дан 1,2 нм гача бўлган
оралиғда ўзгариб туради. Каналнинг бундай тасвирланиши ва бизнинг
тадқиқотимиз натижасида олинган геометрик хусусиятлари ўртасидаги
сезиларли ўхшашликни кўриш мумкин. Деярли барча полимернинг зондлаш
натижасида

олинган

структуравий

хусусиятлари

кристаллографик

маълумотларга тўғри келади (2-расм).


background image

2-расм. Кристаллог
рафик ва полимерли
зондлаш

ѐрдамида

олинган натижалар
дан каналнинг узун
лиги бўйлаб пора
нинг эффектив ра
диуси.

Каналнинг узунлиги,
цис кириш қисмидан
бошлаб, нанометр
ларда кўрсатилган.

Кристаллографик анализ натижаларидан олинган поранинг тахминий
профили

(

○

,

•

)

символларини тўғри чизиқ ѐрдамида бирлаштириб

кўрсатилган (Song et al., 1996). Кулранг чизиқ полимер зондлаш йўли билан
олинган натижалар ѐрдамида олинган поранинг профили кўрсатилган.
Пунктир чизиқ билан полимер зондлаш имкони бўлмаган майдонлар
белгиланган. Стрелкалар пора геометриясининг энг муҳим участкаларини
кўрсатади.

Vibrio Cholerae цитолизинидан ҳосил бўлган ион каналининг ички

геометриясининг тадқиқотлари. V. cholerae

EL Tor ва кўпчилик non-O1

штаммлари

ишлаб

чиқарувчи

цитолизинлар

вирулентликнинг

муҳим

факторлари ҳисобланади (Yamamoto et al., 1984; Yamamoto et al., 1986).

V.

cholerae

EL Tor (VCC) цитолизини 63 кДа молекуляр массали сувда эрувчан

оқсил бўлиб, мишен-хужайралар мембранасида нисбатан катта бўлмаган
поралар ҳосил қилади (Zitzer et al., 1993; Zitzer et al., 1995).

13

Бизнинг

тажрибаларимизда порадан ўта олмайдиган (PEG2000)

ноэлектролит каналнинг тескари томонида бўлган ҳолда бошқа ноэлект
ролитлар каналнинг

цис

ѐки

транс

кириш тарафи билан алоқадаги ҳолатда

каналнинг ўтказувчанлиги ўлчанди. Каналнинг аниқ кириш радиусини
аниқлаш ва уни ички геометриясини ўрганиш учун каналнинг тўлиш F(w)
параметри катталигининг ноэлектролитларнинг гидродинамик радиусига
боғлиқлиқлигини таҳлил қилдик (3-расм). Барча олинган натижаларни
таҳлил қилиб, VCC каналнинг моделини таклиф қилдик (4-расм). Бу модел
албатта соддалаштирилган, лекин асосан электрон микроскоп ѐрдамида
олинган натижаларга мос келадики, шунга асосланиб, канал структурасини
воронкасимон тузилишли деб тахмин қилинди (Zitzer et al., 1997).

3-расм. F

cis

ва F

trans

ларнинг

ноэлектролитлар гидродинамик

радиусларига боғлиқлиги.

Горизо


background image

нтал стрелкалар VCC каналининг

цис (~0,3) ва тран свестибюл

ларидаги (~0,1) тўлиш қиймат

ларини кўрсатади. Вертикал стрел

калар VCC каналининг критик нуқ

таларидаги радиус қийматини кўр

сатади. Эритма таркиби қуйида

гича: 150 мМ NaCl, 5 мМ HEPES-NaOH, рН 6,5, 20 % ПЭГ. Хар бир нуқта

полимерлар мавжуд ѐки уларсиз каналларнинг (n=80-150) амплитудасига
қараб тузилган гистограммадан олинган.

4-расм. VCC каналининг схема

тик тузилишининг кўриниши ва

мембранадаги тахминий локали

зацияси.

Торайиш узунлиги (диаме

три

≤

1,2 нм)

≈

6,5 дан

≈

11нм гача.

Каналнинг мембранадаги локализа

цияси бизнинг тадқиқотларимиз

натижаларига ҳамда VCC ва

VCC2лардан ҳосил бўлган ион

каналларининг ўзаро ўхшаш-лигига

асосланган (Krasilnikov et al., 1992;

Zitzer et al., 1995).

VDACнинг очиқ ва ѐпиқ ҳолатдаги ички геометриясини аниқлаш.

Ион

каналларининг энг муҳим хусусиятларидан бири уларнинг потенциалга
боғлиқлигидир. Ҳозирги кунга келиб, каналларнинг бу хусусияти уларнинг
структуралари ўзгариши билан коррелияция қилишини исботловчи кўплаб
маълумотлар тўпланган. Бундай жараѐнни ѐритиш учун ишланган геометрик
моделларни шартли равшда иккита синфга бўлиш мумкин. Бу ''блоклаш'' ва
''қайта қуриш''. Потенциалга боғлиқ K

+

каналлари биринчи моделнинг ѐрқин

вакили ҳисобланади (Gulbis et al., 2000), VDAC (Zimmerberg and Parsegian,

14

1986; Doring and Colombini, 1985) ва коннексонлар (тирқич алоқали каналлар

(Unwin and Ennis, 1984)) эса иккинчи моделнинг вакили ҳисобланади.
Каналнинг ички ҳажм ўзгаришини ўлчаш ушбу икки синф моделлар орасини
чегаралаш учун жуда фойдалидир. Шунинг учун биз юқорида ѐритилган
методдан фойдаландик. Бунда буқа мушакларидаги поринлардан ҳосил
бўлган (Porin-31BM), VDACнинг ички структурасини ўзгаришини ўлчаш
учун асимметрик қўшилган яхши ўтувчи ноэлектролитлардан фойдаландик.

Каналнинг очиқ ва қуйи ўтказувчан (ѐпиқ) ҳолатидаги ички ҳажм

ўзгаришини топиш учуни биз мембранада икки хил потенциални фиксация
қилдик. Каналнинг ички бўшлиғининг геометриясини таҳлилида очиқ
ҳолатида мембранада катта бўлмаган потенциал (10 мВ) фиксацияланди ва
каналнинг ўтказувчанлик спектри йиғилди. Қуйи ўтказувчан ҳолатидаги


background image

тажрибаларда мембранада аввал 10 мВ потенциал фиксацияланди, канал
ҳосил бўлгандан кейин эса потенциал бирданига 50 мВгача кўтарилди. Бу
VDACнинг (ѐпиқ) қуйи ўтказувчан холатига олиб келди.

Экспериментларда ПЭГлардан фойдаланиб, юқорида таърифланган

метод ѐрдамида каналнинг ўтказувчанлиги ўлчанди, бунда мембрананинг бир
томонида каналдан ўтмайдиган PEG (PEG4600), иккинчи томонида эса –
яхши ўтувчи ПЭГлар қўлланилди. Бир хил шароитда алоҳида-алоҳида
каналлар учун олинган натижалар гистограммада умумлаштирилган ва
юқорида ѐзилган каби анализ қилинган.

Каналлар ўтказувчанлиги, каналнинг ноэлектролитлар билан тўлиш

коэффициентини F(w) 1 тенглама ѐрдамида хисоблаш учун ишлатилди.
Олинган натижалар 5-расмда кўрсатилган. Канал

цис

томонидан тўлганда,

ҳамма 0,94 нм радиусдан катта бўлган ноэлектролитлар каналга кирмайди (F
~0), 0,94 нмдан 0,8 нмгача диапазондаF

cis

да тез ўсиш кузатилади. Демак

каналнинг

цис

кириши ~ 0,9 дан 1,0 нмгача радиусли цилиндрсимон формага

эга. Кейинчалик r нинг 0,6 нмгача камайиши F

cis

нинг қўшимча ўсишига олиб

келсада, унинг қиймати 1дан камлигича қолади. Каналнинг

транс

кириш

томонидан

тўлиш

тажрибалари,

VDAC

каналининг

транс

томони

бўшлиғининг геометрияси воронка кўринишли эканлигини кўрсатади.
Каналнинг нисбатан кичик қисми гидродинамик радиуси 1,92 нмдан кичик
бўлган ноэлектролитлар билан тўла бошлайди. r камайиши F

trans

нинг аста

секин ~ 0,2 катталиккача кўпайишига (PEG450 учун, r = 1,05 нм) олиб
келади. r нинг кейинги камайиши F нинг кескин катталашиши билан бирга
кечади. Юқорида қайд қилинганидек, F нинг r га боғлиқлик муносабати,

транс

кириш конуссимон формага эга бўлиб, унинг киришолди радиуси 2,0

нм тенг ва каналнинг ички маълум жойида ~ 0,9 -1,0 нм (VDACнинг

цис

кириш размери)гача торайиб боради.

15

5-расм. VDAC-каналларнинг тўлиқ

очиқ холатида F

cis

ва F

trans

нинг ПЭГ

гидродинамик радиусига боғли

қлиги.

Вертикал стрелклар VDAC

каналининг радиусининг критик

нуқталардаги катталигини белги

лайди. БЛМда +10мВ фиксация

қилинди. Эритманинг таркиби

қуйидагича: 1,15 М KCl, 5 мМ HEPES,

рН 7, 20 % ПЭГ. Ҳар бир нуқта канал

ларнинг полимер бор ѐки йўқ ҳолатидаги амплитудалари (n=70-140) бўйича


background image

тақсимланинш гистограммасидан олинган.

Каналнинг

цис

(g

с

cis

) ѐки

транс

(g

с

trans

) томонидан қўшилган турли

размерли ПЭГ эритмаларида қуйи ўтказувчанлик ҳолатининг ўтказувчанлик
қиймати ўлчанди. Худди, бутунлай очиқ ҳолатдаги каби, катта бўлмаган
ноэлектролитлар VDAC каналининг ѐпиқ ҳолатидаги ўтказувчанлигини
сезиларли

даражада

камайтиради.

ПЭГ

гидродинамик

радиусини

катталаштириш VDAC ўтказувчанлигини янги стационар қийматгача g

сcis

учун

PEG1000дан бошланиб (r = 0,94 нм), g

с

trans

учун эса PEG2000 (r = 1,22 нм)дан

бошланиб ошишига олиб келди. Бу натижалар VDAC каналининг

транс

кириш қисми, унинг икки хил ҳолатидаги

цис

кириш қисмига қараганда кенг

деган тахминга олиб келади. Аммо ѐпиқ ҳолатда поранинг иккала кириш
қисмининг ўлчамлари орасидаги фарқ анча кам. F

сcis

-r боғлиқлик (6-расмдаги

оқ квадратлар) асосида аниқланган VDACнинг ѐпиқ

ҳолатдаги радиуси

катталиги

цис

кириш қисмида (~0,9 нм) каналнинг очиқ

ҳолатидаги

аниқланган катталик (~1,0 нм, 5-расм) билан деярли аналогик қийматга эга.
Бу маълумотлар асосида шундай хулосага келдикки, Porin 31BMдан ҳосил
бўлган каналнинг

цис

кириш қисмидаги ўлчами бир

ҳолатнинг

ўтказувчанлиги иккинчи ҳолатга ўтишида, кучсиз (агар умуман содир бўлса)
ўзгаришга учрайди.

Цис

кириш қисмидан фарқли ўлароқ, қуйи ўтказувчанлик ҳолати учун

F

с

trans

–r нинг боғлиқлиги (6- расм, қора квадратлар), каналнинг очиқ

ҳолатидаги аналогик боғлиқлигидан (5-расм) кескин фарқ қилди, айниқса
катта гидродинамик радиусли полимер молекулалари учун. Агар VDAC ѐпиқ
ҳолатда бўлса, молекулаларнинг радиуси 1,22 нмга тенг (PEG2000) ѐки катта
бўлганда, улар каналга кирмайди. F

с

trans

-r нинг боғлиқлиги F

с

cis

-r нинг

боғлиқлигидан мураккаброқ. Канални

транс

кириш қисмининг максимал

радиуси қуйи ўтказувчанлик ҳолатида ~1,2 нмга яқин. Бу қиймат каналнинг
очиқ ҳолатидаги радиусидан (~2,0 нм) анча кичкина. Шундай қилиб, очиқ ва
ѐпиқ ўтказувчанлик ҳолатидаги

транс

кириш размерининг ўзгариши билан

кечади.

Каналнинг

ѐпиқ

ҳолатидаги

структураси,

унинг

юқори

ўтказувчанликдаги ҳолатига қараганда цилиндр шаклига яқин бўлади. VDAC
каналининг цилиндрик ва конуссимон қисмининг узунлигини ѐпиқ
ҳолатидаги ўтказувчанлигини аниқлаш учун олинган натижаларнинг таҳлили

16

худди каналнинг очиқ ҳолатида олинган натижалар каби амалга оширилган.
Биз каналнинг цилиндрик ва конуссимон қисмининг узунлиги ~2,9 ва ~1,7
нмга тенг эканлигани аниқладик. Олинган натижалар шуни кўрсатадики,
очиқ ҳолатидан ѐпиқ холатга ўтишдаги кузатиладиган геометрик ўзгариш
асосан каналнинг

транс

қисмида содир бўлади.

6-расм. ПЭГнинг гидроди

намик радиуси билан F

c

cis

ва

F

c

trans

(VDAC-каналлларининг


background image

қуйи ўтказувчан холати учун

олинган)нинг боғлиқлиги.

Вертикал стрелкалар VDAC

каналининг критик нуқталардаги

радиуслар катталигини белги

лайди. Ҳар бир нуқта канал

ларнинг полимер бор ѐки йўқ

ҳолатидаги амплитудалари

(n=90-200) бўйича тақсимланинш гистограммасидан олинган.

7-расм. VDAC-каналининг ички

тузилиши.

L

– каналнинг узунлиги, цис

киришдан (0 нм

)

бошланиб транс

кириши билан (4,6 нм) тугайди .

Стрелка ва сонлар кириш қисмини

ѐпиқ ва очиқ ҳолатдаги

диаметрини кўрсатади. Пунктир

чизиқ ва стрелкалар каналнинг

конуссимон қисмининг бошланғич

нуқтасини ѐпиқ ва очиқ

ҳолатларда белгилайди.

Porin-31BM

каналнинг

геометрияси

ҳақидаги

бизнинг

натижаларимиздан ва унинг узунлигига 4,6 нм (Guo et al., 1995) асосоланиб
каналнинг ички ҳажмини ҳисоблаб чиқиш мумкин. Биз очиқ ва ѐпиқ
ҳолатдаги ички ҳажм ~23,3 ва ~13,3 нм

3

га тенг эканлигини аниқладик.

Шундай қилиб, каналнинг бир ҳолатдан иккинчи ҳолатга ўтаѐтганда
ҳажмининг ўзгариши 10 нм

3

атрофида бўлади.

Олинган натижаларимиз асосида Porin 31BM дан тузилган каналнинг

ѐпиқ ва очиқ ҳолатлари учун унинг схематик геометрик тузилишини таклиф
қилиш мумкин (7-расм). Каналнинг очиқ ҳолатида цилиндрсимон қисмининг
радиуси 1,0 нм атрофида бўлиб, узунлиги ~2,5 нмни ташкил қилади.
Конуссимон қисмининг радиуси цилиндрсимон қисмининг радиусидан кичик
бўлади. Каналнинг

транс

кириш қисмида воронканинг энг катта (~2,0 нм)

радиуси кузатилади. Каналнинг бу қисмининг узунлиги тахминан ~2,1 нмга

17

тенг. Ёпиқ холатга ўтиши радиуснинг унча катта бўлмаган қисқариши билан
кечади (~ 1,0 дан ~ 0,9 нмгача) ва каналнинг

транс

конуссимон қисми

ҳисобига цилиндрсимон қисмининг узунлиги ошади (~ 2,5 дан ~ 2,9 нмгача).

Макси-анион канал ва VDACнинг биофизик хусусиятлари орасидаги фарқ

.

Макси-анион канал плазмолеммал VDAC эканлиги, бу икки каналнинг
умумий биофизик хусусиятларга эга деган тахминга асосланган. Шунга
қарамасдан ўхшашлик юзаки бўлиб, бу хусусиятларни физиологик шароитда


background image

текширилганда фарқлари аниқ кўринди. Бунинг учун VDAC (каламуш
жигарининг митохондриясидан ажратилган) билан физиологик шароитга
яқин шароитда тажрибалар олиб бордик. Бу канални БЛМга киритиб, нормал
Рингер эритмасида якка каналларнинг ўтказувчанлиги тахминан 530 пСмга
тенг эканлигини аниқладик. Бу катталик шу эритмада якка макси-анион
каналларнинг ўтказувчанлигидан 30-70% юқори (300-400 пСм), (Sabirov and
Okada, 2009). Маълумки, тузларнинг юқори концентрацияларида макси анион
каналнинг ўтказувчанлиги 580-640 пСм гача K

m

~77-120 мМ билан тўйинади

(Hals et al., 1989; Hurnak and Zachar, 1994; Schlichter et al., 1990). Бундан
фарқли равишда, якка VDAC каналларнинг амплитудаси 1 М KCl муҳитда
4100 пСм бўлиб, туз концентрацияларини янада ошиши VDAC
ўтказувчанлигининг чизиқли ~10 нСмгача ошишини кўрсатди (Zambrowicz
and Colombini, 1993). Каналнинг параметрларидаги бундай катта фарқ ҳар
иккала поранинг ион транспорт механизмининг ҳар хил эканлигидан далолат
беради. Ушбу хулоса бу икки каналнинг ион селективлигини солиштирганда
ҳам тасдиқланди. Бу икки каналнинг ички тузилишидаги фарқи VDACнинг
хлорга нисбатан глутамат учун заиф селективлиги (P

glutamate

/P

Cl

= 0,45 ± 0,03)

худди шу шароитда макси-анион каналининг анча юқори селективлигига
(P

glutamate

/P

Cl

~ 0,2) солиштирганда яққол кўринади.

Макси-анион канал ва VDACнинг яна бир умумий муҳим хусусияти – бу

потенциалга боғлиқлиги ҳисобланади. Икки тип канал ҳам мусбат ҳам
манфий потенциалларда ѐпилади. Бунда вақт константаси +50 мВда 50-100
мсга яқин бўлиб, –50 мВда эса 300-400 мсга тенг бўлди. Шунга қарамасдан,
минимал ўтказувчанлик даражаси муҳим фарқ ҳисобланади. Бу шароитда
макси-анион канал бутунлай ѐпилади, VDAC эса ҳар доим ўтказувчанликни
аҳамиятли қисмини сақлайди (40-50%гача). VDACнинг “ѐпиқ” ҳолати катион
селективлик хусусиятига эгалиги адабиѐтдан маълум (Colombini et al., 1996;
Colombini, 2004).

Бу каналларнинг ички тузилиши ҳам турлича. Агар, бизнинг

натижаларимизга мос равишда (8-расм), VDAC каналининг радиуси

цис

кириш қисмида 1 нмга тенг,

транс

кириш қисмида 2 нмга тенг бўлса ҳам,

лекин макси-анион каналнинг радиусларининг фарқи анча кам:

цис

ва

транс

кириш радиуслари 1,16 нм ва 1,42 нмларга тўғри келади (Sabirov and Okada,
2004).

Юқорида баѐн қилинганларга асосланиб, қуйидагича хулоса чиқариш

мумкин: макси-анион канал ва VDAC митохондриал порини турли
оқсиллардан

ҳосил

бўлади.

Аммо

бу

хулоса албатта VDACнинг

плазмалеммада мавжуд бўлиши мумкинлигини асло инкор қилолмайди.

18

Диссертациянинг

«Нанопора

структураси

ва

ион

ўтказиш

хусусиятини цистеин-сканирлаш мутагенези усулии ѐрдамида тадқиқ
қилиш»

деб номланган тўртинчи бобида цистеин-сканирлаш мутагенези

усули ѐрдамида олинган натижалар мухокама қилинган.

Ион каналлари нанопораларни ўрганиш учун идеал модел система


background image

ҳисобланади,

чунки

улар

ўз-ўзидан

ҳосил

бўлади

ва

уларнинг

структураларини молекуляр-биологик усуллар ѐрдамида ўзгартириш мумкин.
Масалан, сайт-йўналтирилган мутагенез методи канал ичидаги поранинг
кириш яқинидаги асосий зарядларни сони ва жойлашишини ўзгартириш учун
ишлатилиши мумкин. Канал структурасидаги бундай ўзгариши натижасида,
қоидага кўра, ион селективлиги ва ўтказувчанликнинг потенциалга
боғлиқлик (G-V) формасида акс этади (Noskov et al., 2004; Jordan, 2005).

Ион каналлари хусусиятларини аминокислота ѐн занжирининг зарядлари

назорат қилиш механизмини аниқлаш учун биз токсиннинг ѐввойи типидан
ташкил топган ва унинг генетик модифицияланган мутантларининг кимѐвий
модификациялари

ѐрдамида

α-ГЛ

каналнинг

ион-ўтказувчанлик

хусусиятларини ўргандик.

Бизнинг вазифамиз аминокислота қолдиқларининг тури ва асосий

зарядлари жойлашувининг селективликка, ўтказувчанликка (G) ва α-ГЛ
каналининг потенциалга боғлиқлигини аниқлашдан иборат эди. α-ГЛнинг
ѐввойи типининг бирламчи кетма-кетлигида цистеинларнинг йўқлиги учун,
биз бир неча нуқтали цистеинли мутантларни синтезладик ва мутант
каналининг ион-ўтказувчан хусусиятларини аниқладик. Цистеин киртилган
мутантларни,

β

-цилиндрнинг ўзак регионидаги ўрни бўйича, икки гурухга

бўлдик: жуфт ва тоқ.

Каналнинг электростатик профилини ҳоҳлаган тарзда назорат қилиш

учун биз цистеиннинг сульфгидрил группалари билан ўзаро таъсирлашувчи
реагентларни

ишлатдикки,

уларнинг

мусбат

ва

манфий

зарядлари

цистеиннинг ѐн занжирларига боғланади. Бу реагентларнинг цистеин ѐн
занжирлари билан реакцияси -SH группани -SS-R га ўзгартиради, бу ерда -R
–зарядланган қисм: -CH

2

CH

2

SO

3

–

(MTSES) ва -CH

2

CH

2

N(CH

3

)

3

+

(MTSET).

Манфий заряднинг канал ўзагига қўшилганда тоқ аминокислоталар

асимметрияни кучайтирди, мусбат заряднинг қўшилиши эса канал
ўтказувчанлик асимметриясини камайишига олиб келди. Бундан ташқари бу
янги зарядларнинг таъсири канал ичидаги модифицияланган цистеин
қолдиқларининг жойлашишига боғлиқ бўлди (8-расм). G130C дан ташқари
жуфт рақамли мутантлар ҳосил бўлган каналлар реагентлар учун сезгир
бўлмади.

19

8-расм. α-ГЛ цистеинли

мутантлар ўтказувчанлиги

асимметриясининг сульфгид


background image

рил реагентлар таъсирида

ўзгариши.

Мутантлар кетма

кетлиги чапдан ўнгга: T129C,

G130C, K131C, D127C, G133C,

L135C, G137C, N121C, N139C,

S141C и G143C. Эритма

таркиби: 100 мМ KCl, 30 мМ

Трис-HCl, рН 7,5. Масофа

каналнинг транс кириш қисмидан.

Қўшилган зарядларнинг каналлар катион-анион селективлигига таъсири

9-расмда кўрсатилган. Бу экспериментларда сульфгидрил реагентлар липид
мембранага аввалдан критилган каналларга таъсир этилган.

9-расм. Сульфгидрил реагент

ларнининг цистеин мутант

лардан хосил бўлган канал

нинг реверсия потенциалига

таъсири.

Мембрананинг транс ва цис

тарафларида 100 ва 300 мМ KCl

ва иккала тарафида қўшимча 30

мМ Трис-HCl, рН 7,5 мавжуд.

Мутантлар кетма-кетлиги 8-

расмдагидек.

Янги зарядларнинг эффективлиги канал ўкининг узунлиги бўйлаб жой

лашишига боғлик бўлди. Нисбатан кучсиз эффект каналнинг кириш қисмига

яқин бўлган зарядлар учун топилди. Зарядларнинг таъсири масофа бўйлаб

кучайиб, транс киришдан 1-1,5 нмда V

rev

да максимал, ~ +21 мВ (MTSET) ва -

24 мВ (MTSET) катталикга эга бўлди. Ўтказувчанликнинг солиштирма муно

сабати P

K

/P

Cl

~ 0,001 ва ~170ни ташкил этди. Шу вақтнинг ўзида α-ГЛ ѐввойи

типи заиф анион-селектив бўлиб, V

rev

~ +7,6 мВ ва P

K

/P

Cl

~ 0,46га тенг.

Кимѐвий модифицирланган канал учун V

rev

қиймати Нернст потециалига

якин бўлди ва ушбу шароитда Cl ва K

+

учун ~ +22 мВ ва ~ -25 мВни ташкил

этди. Зарядлар V

rev

ва G-V графиклари ассимметриясига турлича таъсир

килди. V

rev

бирламчи ўсишдан кейин максимал даражага эришади ва сўнг

деярли бутунлай доимий бўлиб қолади. (9-расм). Ассимметрия катталиги эса

максимумга етгач тезда

транс

киришдан узоқлашиши билан камаяди (8-

расм). Бу натижалар умумий (интегралланган) заряд катион-анион

каналларининг танлаши учун жавобгар эканлигини кўрсатади. Зарядларнинг

20

канал киришлари орасидаги баланси эса вольт-ампер характеристи


background image

каларининг шакли учун ҳал қилувчи аҳамиятга эга.

Олигомерли нанопоралар стехиометриясини аниқлашнинг янги усули.

Узоқ йиллар давомида α-ГЛ канал 6 та мономердан ташкил топган деб
ҳисобланган, чунки электрон микроскопик тадқиқотлар асосан гексамер
структурадан далолат берарди (Olofsson et al., 1988; Hebert et al., 1992). Аммо
рентгеноструктур тадкикотлар кимѐвий модификация билан биргаликда
шуни кўрсатадики, α-ГЛ канал гептамер бўлса керак (Gouaux et al., 1994).
Атом кучи микроскопия усули ѐрдамида олинган натижалар бир мунча
қарама қарши бўлди. Шундай қилиб гептамер модел битта тажриба
жараѐнида тасдиқланган (Fang et al., 1997) бўлган пайтда, бошқа тажрибалар
натижаси (Czajkowsky et al., 1998) липид мембранага гексамер структура
ҳосил бўлишига гувохлик беради. Бунга боғлик ҳолда биз физиологик
шароитда максимал яқин бўлган ион каналлар стихиометриясини аниқлаш
учун янги усул ишлаб чиқишга уриниб кўрдик. Бу усул асосида бизнинг
экспериментал

кузатув

ѐтади.

Яьни

DTNB

сульфгидрил-специфик

реагентнинг α-ГЛ мутанти билан ўзаро таъсири аввал дифтерал токсинида
кузатилгандек (Mindell et al., 1994; Huynh et al., 1997) бор ѐки йўқ принципи
асосида кетмай, балки зинапоя шаклида олигомер каналнинг алоҳида
молекуласида систеин қолдиғининг модификацияси кетма кетлигини
кўрсатиб беради (10-расм). Зиналар орасидаги вақт жуда фарқли бўлди ва бу
жараѐннинг стохастик характерини кўрсатади.

Канал ўтказувчанлигининг DTNB таъсирида камайиш зиналарининг

максимал сонининг еттига тенг бўлди ва бу ҳолат модифицияланган 38
каналнинг 25% да кузатилди.

10-расм. DTNB

таъсирида 17С мут

ант канали ўтказув

чанлигининг ўзга

риши.

DTNB нинг

якка каналга таъси

ри. Ячейканинг

иккала бўлимидаги

эритма-лар таркиби

100 мМ KCl, 1 мМ

ЭДТА и 30 мМ трис

HCl, рН 7,5.

Кузатилган бошқа ҳолларда зиналар сони тўрт ва олти оралиғида бўлди.

Реагент таъсирида содир бўлган ўтказувчанлик камайиши 6,5 ± 1,6 пСмни
ташкил қилди (ўртача кўрсаткич 226 мартада -100 мВда қайд қилинди). Ҳар
бир тажрибада зиналар сони бир хил бўлишини кутиш керак эмас, чунки


background image

21

пораларнинг олигомер субъединицалар реакциясининг боришини бир неча

йўллари мавжуд (Braha et al., 1997). Шунга қарамасдан, маълум холатлар
оралиғидаги биринчи ва охирги қадамлар ўхшашроқ бўлиши керак. Бу
фикрни текшириш учун алохида зиналарнинг амплитудаларини таҳлили ҳар
бир канал учун кетма-кетликда ўтказилиб, еттита зина кузатилди.
Ҳақиқатдан,

амплитуданинг

ўртача қийматидан стандарт фарқининг

ўзгариши кетма-кетликдаги тартиб рақамига боғлиқлиги қўнғироқ шаклида
бўлди. Кутилгандек, максимал фарқ 3-5 қадам учун кузатилиб, шу вақтнинг
ўзида 1 ва 7 қадамларда катта бўлмаган силжиш кузатилди. Шундай қилиб,
якка канал ўтказувчанлигини етти этапли камайиши бизнинг экспериментал
системамизда α-ГЛ канал гептамер эканлигини исботлайди.

Диссертациянинг

«α-ГЛ каналга полианионларнинг таъсири»

деб

номланган бешинчи бобида α-ГЛ каналларнинг полианионлар билан
блокланиши тўғрисидаги натижалар келтирилган. Глюкозаминогликанлар
полианионларнинг (ПА), структуравий бир хил бўлмаган группасига мансуб
бўлиб физиологик жараѐнларга кенг-кўламли таъсир кўрсатади. Буларга
таниб олиш, адгезия, мембрана транспорти, анти-бактериал ҳимоя киради.
Улар Ca

2+

ионлари иштирокида (Vannucchi et al., 1985) фосфатидил холин

(ФХ) билан ўзаро таъсирлашади ва ион каналлари ва рецепторлар
регуляциясида иштирок этади (Van et al., 2006; Suppiramaniam et al., 2006).
Бундан ташқари, ПАнинг ион каналлар билан ўзаро таъсири ПА
молекуласининг ўлчамига боғлиқ деган фикрлар мавжуд (Chicoine et al.,
2004). Бироқ, ПАнинг ион каналлари функциясига таъсирининг батафсил
механизми яхши ўрганилмаган. Бу масаланинг ечими учун биз турли
ўлчамдаги икки хил ПАнинг α-ГЛ каналлар ўтказувчанлигига таъсирини,
ҳамда шу таъсирнинг эритма таркибига боғлиқлигини ўрганиб чиқдик.

Агар α-ГЛ билан модифицирланган мембранада кучланиш қайд қилинса,

бунда ток бирданига ўсади, чунки ионлар шу пайтда очиқ ҳолатдаги каналлар
орқали ўтади, кейин токнинг секин-аста камайиши каналларнинг

қуйи

ўтказувчан ҳолатига ўтиши билан изоҳланади. Мембранани ювиб турувчи
эритма таркибида (рН 7,5) гепарин ва Ca

2+

ионлари йўқ шароитда хар қандай

белгининг 100 мВ-импульсли потенциал берилиши каналларнинг ѐпилишига
олиб келмайди. Мембрананинг иккала томонига ПА эритмасини қўшилиши
сезиларли эффект бермади. Эритмага CaCl

2

қўйилгандан сўнг

токнинг

сезиларли релаксацияси кузатилди. Бунда ПА ва Ca

2+

нинг эффекти модда

қўшилган томонга ва қайд қилинган кучланишнинг ишорасига боғлиқ бўлди.
Шу билан бирга биз α-ГЛ каналларнинг потенциалга боғлиқлигига бошқа
икки валентли катионлар таъсирини ҳам тадқиқ қилдик. ПАли эритмага Mg

2+

ва Zn

2+

ионлари қўшилганда, кузатилган эффектлар сифат

жихатидан

Са

2+

эффектига аналогик тарзда бўлди. Ягона фарқ турли

ионларнинг

каналнинг потенциалга боғлиқ ўтишига таъсири эффективлигида кузатилди.
Уччала катионларнинг концентрациясини оширилиши ПАнинг қайд қилинган


background image

концентрациясидаги ток релаксация вақтини камайтиради

(11-расм).

Катионларни эффективлиги бўйича қуйидаги кетма-кетликда жойлаштириш
мумкин бўлди: Zn

2+

> Са

2+

> Mg

2+

, бу эса катионларнинг

22

α-ГЛни ҳужайраларга ингибирловчи таъсири қатори билан бир хил (Bashford
et al., 1986; Bashford et al., 1988).

11-расм. Ўтказувчанли

книнг релаксация доимий

лиги вақтининг (

τ

) икки

валентли катионлар кон

центрациясига боғлиқлиги.

Икки валентли катион

хлоридлари (абсцисса ўқида

кўрсатилган концентрация

да) икки томонига бир

вақтда қўшилган. Эритма

таркиби 100 мМ KCl, 6

мкг/мл гепарин ва 10 мМ

Трис-HCl, рН 7,5, n=3-5.

ПАнинг α-ГЛ каналларга таъсир механизмини аниқлаш учун биз, турли

размердаги молекулаларга эга гепарин ва декстран сульфатлар (ДС) билан
тажрибалар ўтказдик. Бу экспериментларда биз гепарин-альбумин (HepAlb,
4,8 гепарин молекуласи битта буқа зардоби альбумини молекуласи билан
боғлиқ); ўртача молекуляр массаси 18000 г/мольга тенг бўлган гепаринлар
(Na-тузлари шаклида), (Hep); 6000 г/моль (Hep6000); 3000 г/моль (Hep3000);
563 г/моль молекуляр массали гепарин дисахаридлар (HepDi); ДС ўртача
молекуляр массаси 500000 г/моль (DS500); 10000 г/моль (DS10); 5000 г/моль
(DS5). Гепаринларнинг канални блок қилиш хусусияти мембрананинг
қўшиладиган томонларига боғлиқ бўлдики, уларнинг эффекти размер ва
концентрациянинг ошиши билан ошиб борди (12-расм). Энг кичик
ҳисобланган гепарин, HepDi, ҳатто 2 мг/мл концентрацияда ҳам α-ГЛ каналга
деярли таъсир қилмади. Шу тариқа, диффузия коэффициентлари кичик
бўлишига қарамасдан, катта ПАлар эффективроқ бўлди ва тезроқ бўлган ток
релаксацияларини

амалга

оширди. Ушбу тадқиқотларда ишлатилган

гепаринларни

қуйидаги

кетма-кетликда

жойлаштириш

мумкин

(эффективлиги камайиш тартибида): HepAlb> Нер> Hep6000> Hep3000>>
HepDi.

Декстран сульфатлар α-ГЛ каналнинг потенциалга-боғлиқлигига ҳам

таъсир кўрсатди. ДС эффективлигининг ошиши уларнинг размерини ошиши
билан бирга кечди: C

50

қиймати 220,0

±

30,0 мкг/мл (DS5), 7,2

±

1,5 мкг/мл

(DS10) ва 1,7

±

0,3 мкг/мл (DS500)ни ташкил этди. ДС гепаринга қараганда

юқорироқ мусбат заряд зичлигига эга, лекин уларнинг α-ГЛ каналга таъсир


background image

эффективлиги пастроқ бўлди. Бу эса, декстран сульфат ва гепарин
молекулаларининг тузилишларидаги фарқ билан боғлиқ бўлиши мумкин.

23

12-расм.

α-ГЛ каналларнинг релаксация вақти доимийлигига ПАнинг

таъсири.

Релаксация вақти доимийлигининг ячейкани цис (

А

) ѐки транс бўлим

(

Б

)идаги гепариннинг концентрациясига боғлиқлиги. Ўтказилган узлуксиз

чизиқлар боғланиш тенгламасига мос равишда ва боғланишнинг ягона сайти
мавжудлиги тахмини асосида чизилган, n=3-5.

ПА α-ГЛ каналнинг кириш жойида унинг ичига ўтади ва уни блоклайди.

Бироқ нима учун ПАнинг молекуляр оғирлиги қанча катта бўлса унинг
эффективлиги ошади деган савол очиқ қолган. Адабиѐтлардан маълумки, ФХ
ва бошқа фосфолипидлар билан ПА фақат икки валентли катионлар
мавжудлигидагина ўзаро таъсирлашади (Sagrista et al., 2000; Huster et al.,
1999), чунки бу катионлар мусбат зарядланган фосфолипидларнинг фосфатли
группалари ва ПАнинг сульфат группалари орасида кўприк ҳосил қилади
(Huster et al., 1999). Бундан ташқари, тадқиқот натижалари гувоҳлик
беришича ҳатто 100 мМ Ca

2+

эритмада хам умуман ПАлар, ва хусусан

гепарин умумий мусбат зарядланишини сақлаб қолади. Гепаринларни
каналга таъсири учун икки валентли катионлар бўлишини талаб қилингани
учун, биз ПА нинг мембрана билан боғланиши адабиѐтларда таклиф
қилинган (Huster and Arnold, 1998; Huster et al., 1999) кальцийли кўприк
механизми билан содир бўлишини тахмин қилдик.

ПАнинг липосома билан боғланиши уларнинг юзасида манфий

ζ

-потенциалнинг пайдо бўлишига олиб келади. Бу ҳолат гепарин учун ҳам

тўғри келишини текшириш учун, ҳамда ПАнинг мембрана билан
боғланишини

миқдорий

бахолаш

учун,

биз

ФХ

липосомаларни

ζ

-потенциалини турли ўлчамли гепаринлар қўшилган ва қўшилмаган

муҳитда ўлчадик. Аниқланишимизча, гепаринлар ФХ липосомаларнинг

ζ

-потенциалини енгил мусбат қийматдан (гепаринсиз муҳитда) ~–24 мВгача


background image

камайтиради (13А-расм). ФХ липосомалардаги

ζ

-потенциалининг гепарин

концентрациясига боғлиқлиги (13А-расм) α-ГЛ каналнинг гепарин
индуцирланган блокадасига ўхшаш боғлиқлигини эслатади (12-расм). Бу
икки системада гепаринлар эффективлиги орасида (C

50

да кўрсатилгандек)

корреляция мавжуд (13Б-расм).

24

13-расм.

Липосома

ζ

-потенциалининг гепаринлар концентрациясига

боғлиқлиги (А) ва

липосомларга ва α-ГЛ каналларга гепарин таъсирининг ярим-эффектив
концентрациялари орасидаги корреляция (Б).

n=3-5.

Бу натижалар, ПАнинг мембрана билан боғланиши канал блокадасининг

ПА молекуляр оғирлигига кучли боғлиқ эканлигини тушунтириб беради.
ПА-иони билан каналнинг ўзаро таъсирининг биринчи этапида ПА мембрана
билан Ca

2+

-кўприклар ѐрдамида боғланади, бу эса уларнинг мембрана

яқинидаги ва каналнинг кириш қисми атрофида локал концентрациясини
ўсишига олиб келади. Каналнинг кириш қисмининг мембрана юзасига
яқинлиги ионлар оқими ПА таъсирида блокланиш эҳтимолини оширади.
ПАнинг стационар концентрацияси мембрана юзасидан узоқлашиши билан
ночизиқли равишда эритма ҳажмидаги кўрсаткичгача камаяди (Peitzsch et al.,
1995). Натижада ПАнинг эритма ҳажмидаги бир хил концентрациясида ҳам
уларнинг эффектив стационар концентрацияси каналнинг

транс

кириш

қисмида (мембрананинг юзасига деярли тегиб турувчи),

цис

кириш


background image

(мембрана юзасидан анча узоқ бўлган) қисмига қараганда анча юқори
бўлиши керак. Бу эса мембран юза қисми ва каналнинг кириш қисми
оралиғидаги масофа қандай қилиб ПА эффективлигининг қайси томондан
қўшилишига боғлиқлигини тушунтириб беради. Эркин полимер молекулалар
тасодифий ҳолда, диффузия натижасида, каналнинг кириш қисмига келиши
мумкин, ва сўнг (ПА/канал ўзаро таъсирлашувининг иккинчи босқичида)
потенциалга боғлиқ холатда порага киради ва канални блоклайди.

Диссертациянинг

«α-ГЛ каналнинг эластик деформациясини тадқиқ

қилиш»

деб номланган олтинчи бобида α-ГЛ каналнинг зарядланган

краун/K

+

комплекси

билан

блокланиш

тадқиқотларининг

натижалари

келтирилган.

Ион канали порасининг ички геометрик тузилишининг асосий

хусусиятлари қоидага кўра каналнинг очиқ холатида потенциалга боғлиқ
бўлмайди деб ҳисобланади. Одатда бу фикр тўғри бўлади, лекин унинг
чегараларини аниқлаш зарур. Потенциал-индуцирланган эластик деформация
каналнинг транспорт хусусиятини ўзгаришида кўзга кўриниши мумкин,
айниқса молекула катталиги канал порасига яқин бўлганда. Табийки, токнинг
қаршиликка боғлиқлиги тўғри чизиқ бўлмаган каналлар электрострикция

25

эффектини

ўзида

мужассамлаштирган

энг

эҳтимоли

катта

номзод

ҳисобланади. Шунга қарамасдан тўғри чизиқ бўлмаган ҳолатининг ўзи
электрострикцияни билдирмайди албатта. Бу муаммони тадқиқ қилиш учун,
структураси яхши ўрганилган якка ион канали ва молекуляр инструментлар
керак бўлади. Шунинг учун биз, α-ГЛ канални танладик, краун-эфирлар
оиласи намоѐндаси 1,4,7,10,13,16-гексаоксациклооктан (18-краун-6) эса
инструмент сифатида танланди, чунки унинг молекуляр размери (диаметри
~1,15 нм) поранинг энг тор қисмининг катталигига жуда яқин (диаметр ~ 1,2
нм).

14-расмда, 4М KCl эритмасига симметрик қўшилган 18-краун-6, –70

мВда канални максимал блоклаши кўрсатилган. 18-краун-6 ни блокловчи
эффекти нихоятда асимметрик. Унинг фақат

транс

бўлимга қўшилиши,

амалий жихатдан симметрик қўшилишдан фарқ қилмайди. Шу вақтда фақат

цис

бўлимга 18-краун-6 қўшилиши ўтказувчанликка жуда заиф таъсир қилди.

Бу хол блокланиш зарядланган краун/K

+

комплекс билан боғлиқлигидан ва

ушбу комплекс боғлашиш жойини

транс

кириш қисмидан осон топишидан

далолат беради. Комплекс берилган потенциал воситасида боғланиш сайтига
қадар транспорт қилинади, потенциалнинг катта қисми эса каналнинг ўқ
қисмига тушади. 15-расмда 18-краун-6 билан банд бўлмаган боғланиш
сайтининг потенциалга боғлиқлик эҳтимоли келтирилган. Бу эҳтимоллик

p I i

n

=

1

−

Δ

/

Δ

бўйича ҳисобланган бўлиб, бу ерда

Δ

I

– краун таъсиридаги ўртача

токнинг ўзгариши,

Δ

i

– каналдан ўтувчи “лахзали” токнинг битта

краун/К

+

комплекси боғланиши билан индуцирланган токнинг камайиши.


background image

14-расм. 4М KCl эрит

масига симметрик қўши

лган 18-краун-6 ни α-ГЛ

каналанинг ўтказувчан

лигига таъсири.

Якка

каналга тегишли типик

экспериментларнинг нати

жалари келтирилган.

Биз блоклаш жараѐнининг анализи учун умумлаштирилган кўринишдаги

Woodhull (Woodhull, 1973; Hille, 1992) моделидан фойдаландик (Tikhonov and
Magazanik, 1998). Бу моделни қўллашда бир нечта шартлар бўлиб, улар
қуйидагилардан иборат: ўтказувчанликнинг реагент ѐрдамида блокланиши
оқсил конформациясининг ўзгаришидаги кооператив аллостерик

эффектларнинг натижаси эмас ва блокловчи молекулалар бир бирига боғлиқ
бўлмаган ҳолда таъсир қилади, лекин бу ҳолдан боғловчи сайт учун рақобат

26

қилувчи молекулалар истисно ҳисобланади. Bezrukov et al. (2004) ишларида
келтирилган кўрсаткичлар ва бизнинг тадқиқотлар 15-расмда келтирилган
натижаларимиз юқоридаги талабларга тўлиқ жавоб беришини тасдиқлайди.

15-расм. Каналнинг 18-

краун-6 таъсирида «блок

ланмаслик” эҳтимолининг

фиксация потенциалига

боғлиқлиги.

Пунктир чизиқ - Woodhull

моделида токни якка

элементар заряд ѐрдамида

блоклашнинг энг яхши

аппроксимациясидир (2-

тенглама). Узлуксиз чизиқ –

модифицирланган моделнинг

аппроксимацияси бўлиб, бунда фиксирланган потенциалга боғлиқ холдаги
таранг деформацияси тахмин қилинган, n=3-5

Тезлик константаларига термодинамик мувозанат берадиган чекланиш

(

0

2

k k k k

, бу ерда 0 индекис берилган потенциалнинг нолига тегишли),


background image

0 0
0

1

1

2

=

− −

микроскопик қайтарилиш ѐки локал мувозанат сифатида маълум. Бу
чекланиш натижасида ток блокаторининг якка элементар заряд сифатида
симметрик қўлланилишида, каналнинг блокланмаслик эҳтимоли, ўлчамсиз
потенциал

ψ

=

ϕ

e

/

kT

(

ϕ

– трансмембран

потенциал,

е

- электрон заряди,

k

- Больцман доимийси,

T

- абсолют температура) функцияси сифатида

қуйидагича ѐзилиши мумкин:

0

( ) ( )

exp exp ( )

δ ψ δ δ δ ψ

+ +

−

A

m m t c

P

+ +

−

+ + +

−

=

(2)

0 0 0 0

(

δ δ δ ψ

) (

δ ψ

) (

δ δ δ ψ

)

B A B A

exp ( ) exp exp ( )

c t m m m t c

қаерда

exp

( )

,

k

1

=

Cb

1

−

δ

t

ψ

exp

(

( )

)

,

k

−

1

=

b

−

1

δ

m

−

δ

t

ψ

exp

(

( )

)

,

k

2

=

b

2

δ

m

−

δ

c

ψ

exp

(

(

δ δ

)

ψ

)

2

Cb

2

c m

k

−

=

−

−

,

0

1

0

/

=

−

0

A k k

,

0

1

0

/

=

−

0

B Ck k

потенциалга боғлиқ

2

1

бўлмаган константалар;

δ

c

,

δ

m

и

δ

t

мембранадаги потенциалнинг бир қисмики,

цис

барьер, минимум ва

транс

барьер жойлашган масофага мос келади;

C

блокатор концентрацияси.

Каналнинг ички геометриясини эътиборга олиб, бошқа авторларнинг

нашр қилинган натижалари (Howorka and Bayley, 2002) ва бизнинг


background image

баҳоларимизни инобатга олган ҳолда,

цис

барьер (

δ

c

) жойлашишини 0,8 деб

қабул қилдик. Агар

транс

барьер (

δ

t

) жойлашиши фиксация қилинмаса, у

одатда нореал манъфий кўрсаткичларни қабул қилади. Шундан келиб чиқиб,

биз каналнинг

транс

кириш қисмига барьер қўйиб,

δ

t

қийматни нолга тенг

27

деб қабул қилдик. Натижада бу функция фақат учта эркин параметрни ўз

ичига олади:

δ

m

– трансмембрана потенциалининг блокловчи комплексига

таъсир қилувчи қисми, ҳамда

А

ва

В

параметрлар. (2)-тенгламани энг яхши

аппроксимациялари 15-расмда пунктир чизиқлар билан кўрсатилган. Бу
назарий эгри чизиқлар экспериментал нуқталарни аниқ таърифлаб
беролмайди ва бу тафовут кичик мусбат кучланишлардаги ўлчашга нисбатан
катта хатоликларга боғлиқ эмас. Модел билан мос келиш учун қуйида
келтирилган таклифлардан биттаси (ѐки иккаласи) қабул қилиниши керак: (I)
краун/K

+

комплексининг заряди бирдан катта; (II) берилган потенциал пора

структурасини деформациясига олиб келади ва натижада 18-краун-6нинг
пора билан ўзаро таъсирларини (2)-формулада ҳисобга олинмаган холда
ўзгариб кетади.

Бу иккита тахминлардан бирини танлаш учун авволо шунга эътибор

бериш керакки, 18-краун-6 ва калий ионлари орасидаги комплекс 1:1
пропорцияда ҳосил бўлиши қатъиян аниқланган (Rounaghi et al., 1997),
шунинг учун «битта заряд – битта блокловчи комплекс учун» тахмини ўзини
оқлайди. 15-расмда келтирилган натижалар 18-краун-6нинг нисбатан кичик
концентрацияларида олинган. Шундай қилиб, бизнинг биринчи таклифимиз
рад қилиниши мумкин. Иккинчиси эса манъфий потенциал каналнинг

цис

томонидан кириш барьерини 18-краун-6 учун торайтиради, бу эса "геометрик
тор қисмининг" ўлчамини ортиши ҳисобига амалга ошади. Ҳақиқаттан, агар
торайиш радиуси 18-краун-6нинг радиусига тенг ѐки кичик бўлса, барьер
чексиз катта ва краун/K

+

комплексининг молекуласи каналдан ўта олмайди.

Агар торайиш радиуси манъфий потенциалда ошса, барьернинг баландлиги
тезда камаяди, бу эса 18-краун-6нинг каналнинг

цис

томонидан чиқишини

осонлаштиради. Моделнинг бу модификациясида

B

параметри доимий

бўлади,

A

нинг қиймати эса энди потенциалнинг функцияси бўлиб, манфий

кучланиш фиксация қилинганда ўсиши кузатилади. Энергетик ўйиқнинг
чуқурлиги ѐки берилган потенциал таъсирида барьернинг ўзгаришини
таърифлашнинг бир имконияти сифатида биз краун/K

+

комплекси ва пора

деворлари ўзаро таъсирининг Ван-дер-Ваальс энергиясини танладик. Бунда
биз радиусга боғлиқ ўзаро таъсирларни водород-водород жуфтлиги (Allen and
Tildesley, 1989) учун Леннард-Джонс потенциали константалари орқали
ифодалашимиз мумкин бўлади. Канал ўтказувчанлигига ўхшаш бўлган
чўзилиш радиусининг потенциалга реалистик боғлиқлигини инобатга олган
ҳолда, биз эксперимент натижалари ва модел башорати ўртасида етарли
даражада мосликка келамиз. Биз бу ѐндашувдан шуни аниқладикки,
барьернинг ўзгариши ҳақидаги дастлабки тахминнинг ўзигина боғловчи


background image

сайтни поранинг тор қисми (

δ

m

~0,7) билан боғлаш имконини беради ва канал

шу қисмидаги радиусининг жуда кичик (~ 0,08 нм) эластик ўзгариши
боғланиш энергиясини тахминан

kT

нинг икки бирлигига ўзгартиришга

қодир ва моделнинг башорати ва экспериментлар орасидаги фарқларни
бартараф қилади. 18-краун-6 ва поранинг ўзаро таъсирининг ўзгаришини
инобатга олиб ўтказилган эгри чизиқ 15-расмда узлуксиз чизиқ шаклида
кўрсатилган. Ҳақиқатдан, потенциал таъсирида чақирилган радиус

28

катталигининг амалдаги ўсиши Ван-дер-Ваальс кучи учун ишлатиладиган

тахминий яқинлашувга боғлиқ бўлади. Масалан, "цилиндр цилиндрда" ѐки
"сфера сферада" геометриялари учун кўрсатилганидек (Parsegian, 2005),
ўзаро таъсир масофанинг иккинчи даражали тескари боғлиқлик бўлиши
мумкин. Бу боғлиқликни ҳисоблаб, радиуснинг катта ўзгаришини кузатиш
мумкин. Шундай қилиб бизнинг α-ГЛ каналнинг транспорт хусусиятларида
электрострикциянинг роли ҳақидаги гипотезамиз кузатилаѐтган потенциалга
боғлиқлик ўтказувчанликнинг қолдиқ асимметрияси ва 18-краун-6нинг
блокланишини тушунтириб бериш имконини беради (15-расм). Иккала
ҳолатда ҳам қўйилган кучга пропорционал, ион канали структурасидаги
узлуксиз эластик ўзгариш мавжудлиги тахмин қилинади. Бу эса маълум
"канал дарвозаси"даги майдон таъсирида индуцирланган конформацион
дискрет ўзгариш ва одатдаги "барчаси ѐки хеч нима" типидаги жараѐнлардан
принципиал фарқ қилади. Бизнинг тадқиқотларимиз натижаларидан берилган
потенциал

таъсиридаги

поранинг

радиуси

ўзгаришлари

локал

электрострикция туфайли содир бўлади дейишимиз мумкин. Биз α-ГЛ
каналнинг торайган зонасининг эластик деформациясини тавсия қилишимиз
мумкин бўлган механистик моделда, потенциал фиксация қилинганда
каналнинг энг тор қисмида жойлашган Lys147 харакатланади. Бу харакат

цис

томонга манфий потенциал берилганда канал диаметрининг кенгайишига ва
натижада 18-краун-6нинг каналдан чиқиб кетишига олиб келади.

Цис

томонга мусбат потенциал берилганда эса канал диаметрининг торайишига
ва ион транспортини қийинлашувига олиб келади. Албатта, бу механистик
модель ҳисобланади. Шунга қарамасдан келтирилган тахлил бизнинг
тадқиқотимизда илгари сурилган электрострикция гипотезаси ҳақиқатга
яқиндлигидан далолат беради.

ХУЛОСАЛАР

1. Илк бор модификацияланган полимер зондлаш усули ѐрдамида

қуйидагилар аниқланди:

а) α-ГЛ каналнинг иккала кириш қисмининг диаметри бир бирига яқин

ва 2,6/2,4 нм га тенг (цис/транс). α-ГЛ каналда 2 та тор жой мавжуд: асосий
торайган жойнинг диаметри 1,3 нм бўлиб, таҳминан, каналнинг марказида
жойлашган. Иккинчи жойнинг диаметри эса 1,8 нм га тенг бўлиб, каналнинг
цис кириш қисми яқинида жойлашган;

б) цитолизин ҳосил қилган каналнинг цис кириш диаметри 1,9 нм га


background image

тенг, транс кириш диаметри эса 1,6 нм га тенг. Канал ичида битта торайган
қисм бўлиб, унинг диаметри 1,2 нмга тенг;

в) VDAC ион каналининг юқори ўтказувчанлик ҳолатида цис ва транс

кириш диаметрлари, мос равишда, 2,0 ва 4,0 нмга тенг. Қуйи ўтказувчанлик
ҳолатига ўтганда иккала кириш қисми диаметри кичраяди ва цис кириш 1,8
ва транс кириш 2,4 нм га тенг бўлади. Канал ҳажмининг умумий камайиши
~10 нм

3

га тенг, бу пора умумий ҳажмининг 40% ни ташкил этади.

29

2. Макси-анион ва VDAC каналларининг биофизик хусусиятларини

мукаммал таққослаш, физиологик шароитларда, бу икки ион каналлари турли
оқсиллардан ташкил топганлигини кўрсатди.

3. Илк марта α-ГЛ каналнинг цистеин-сканирловчи мутагенез усули

структурасига қўшимча манъфий зарядлар қўшилиши унинг кучсиз анион
селективлигини кучли катион селективлигига ўзгартириши исботланди,
мусбат зарядлар қўшилиши эса унинг анион селективлигини сезиларли
даражада оширишини кўрсатди. Бу ўзгаришларнинг даражаси янги
зарядларнинг қўшилиш нуқтасига (бу ион танлаб ўтказувчанлигига кўпроқ
таъсир қилади) ҳамда ушбу зарядлар каналнинг бўйлама ўқи бўйича
жойлашишига боғлиқ (бу асосан вольт-ампер тавсифини ўзгартиради). Бу
натижалар шуни кўрсатадики, пора деворининг йиғинди заряди α-ГЛ
каналининг катион-анион селективлиги учун жавобгар бўлади, заряднинг
пора кириш қисмида жойлашиши эса вольт-ампер эгри чизиқларининг
шаклини белгилаб берувчи асосий омилдир.

4. Олигомер ион каналлари стехиометриясини аниқлашнинг, фақат

электрофизиологик ўлчашларга асосланган янги усули ишлаб чиқилди.
Унинг ѐрдамида, қўшқават липид мембранада ҳосил бўлган α-ГЛ канал
гептамер эканлиги аниқланган.

5. Полианион молекуласи порага электростатик куч ҳисобига кириши ва

ионлар ўтишини физикавий блоклаши аниқланди. α-ГЛ каналнинг
полианионлар билан блокланиш эҳтимоли қуйидаги омилларга боғлиқ:

а) икки валентли катионларнинг иштироки ва концентрациясига, қайси

ки таъсир эффективлиги қуйидаги қатор билан белгиланади: Zn

2+

> Ca

2+

>

Mg

2+

;

б)

полианионларнинг

концентрацияси,

молекуляр

массаси

ва

структурасига; полианионларнинг каналга таъсир эффективлиги, уларнинг
мембрана ζ-потенциалига бўлган таъсири билан корреляция қилинади;

в) полианионлар қўшиладиган томонга полианионларни каналнинг

транс кириш томонидан қўшилиши кўпроқ самара беради, бу эса α-ГЛ
каналнинг асимметрик тузилишига боғлиқ.

6. Илк бор мембранада фиксация қилинган потенциал α-ГЛ каналининг

эластик деформациясини чақириши исботланган, бу KCl тузининг юқори
концентрацияларида вольт-ампер тавсифини қолдиқ асимметриясини ва 18-


background image

краун-6 ҳамда калий катиони комплекси билан блокланишини потенциалга
боғлиқлигини тушунтиради.

30

НАУЧНЫЙ СОВЕТ 16.07.2013.К/В/Т.13.01 ПРИ ИНСТИТУТЕ

БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ И НАЦИОНАЛЬНОМ

УНИВЕРСИТЕТЕ УЗБЕКИСТАНА ПО ПРИСУЖДЕНИЮ УЧЕНОЙ

СТЕПЕНИ ДОКТОРА НАУК

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ, ФЕДЕРАЛЬНЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ ПЕРНАМБУКО

МЕРЗЛЯК ПЕТР ГРИГОРЬЕВИЧ

ХАРАКТЕРИСТИКА ВЗАИМОСВЯЗИ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ В

НАНОСКОПИЧЕСКИХ БЕЛКОВЫХ ПОРАХ

03.00.02 –Биофизика и радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ ДОКТОРСКОЙ ДИССЕРТАЦИИ


background image

Ташкент - 2016

31

Тема докторской диссертации зарегистрирована в Высшей аттестационной
комиссии

при

Кабинете

Министров

Республики

Узбекистан,

за

номером

30.09.2014/В2014.5.В73

Докторская диссертация выполнена в Институте биоорганической химии и Федеральном
Университете Пернамбуко, Бразилия.
Автореферат диссертации на трех языках (узбекский, русский, английский) размещен на
веб-странице Научного совета по адрес http://ss.biochem.uz и Информационно
образовательном портале“ZiyoNet” по адресу www.ziyonet.uz

Научный консультант

:

Красильников Олег Владимирович

доктор биологических

наук, профессор

Официальные оппоненты: Мирходжаев Улугбек 3акирович

доктор биологических

наук, профессор

МадьяровШухратРаимджанович

доктор биологических наук

Турдикулова Шахло Уткуровна

доктор биологических наук

Ведущая организация:

Институт микробиологии АН РУз

Защита состоится «_____»___________ 2016 г. в ___ часов на заседании Научного

совета 16.07.2013.K/B/T.13.01 при Институте биоорганической химии и Национальном
Университете Узбекистана по адресу: 100125, г. Ташкент, ул. Мирзо Улугбека, 83.
Тел.:(99871) 262 35 40, факс: (99871) 262 70 63, e-mail: asrarov54@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-ресурсном центре

Института биоорганической химии по адресу г. Ташкент, ул. Мирзо Улугбека, 83.

Автореферат диссертации разослан «____» __________2016 года

(протокол рассылки ___ от __________2016 года)


background image

А.С. Тураев

Председатель Научного совета по присуждению

ученой степени доктора наук, д.х.н., профессор

М.И. Асраров

Ученый секретарь Научного совета по присуждению

ученой степени доктора наук, д.б.н., профессор

Д.А.Кадырова

Председатель Научного семинара при Научном совете

по присуждению ученой степени доктора наук, д.б.н.

32

ВВЕДЕНИЕ (аннотация докторской диссертации)

Актуальность и востребованность темы диссертации.

Одной из важ

нейших задач современной биофизики является изучение взаимосвязи струк
туры и функций ионных каналов, образованных белками. Ионные каналы яв
ляются наноскопическими порами, обладающими селективностью к ионам,

способностью избирательно пропускать различные молекулы через мем
брану или реагировать на них, изменяя свои свойства. Согласно последним
исследованиям, именно ионные каналы являются сенсорами, которые помо
гают живым организмам измерять температуру, чувствовать запахи, вкус и
свет.

В тоже время, некоторые микроорганизмы (и в их числе высоко пато

генные) продуцируют белки, способные самопроизвольно встраиваться в
мембраны клеток-хозяев и формировать в них ионные каналы, через которые
неконтролируемо выходят как ионы, так и водорастворимые вещества-мета
болиты, что приводит к клеточной смерти. От этих белков-токсинов зависят
не только клинические проявления болезней, но и состав среды, в которой
существуют клетки и бактерии. В связи с этим нанопоры, образованные бел
ками, привлекают пристальное внимание исследователей во всем мире как с
точки зрения фундаментальных физиологических и биофизических принци
пов функционирования живых клеток, так и с практической стороны, так как
существуют идеи по использованию их в качестве нано-секвенаторов, ком
понентов нано-фильтров, биосенсоров и других наноустройств.

Во многих исследованиях, проводимых в мире, отмечается, что знание о

структуре белковых нанопор и влиянии ее на свойства последних может по
мочь как в создании современных лекарств, так и в разработке нано
устройств, используемых в новейших приборах. Наиболее перспективным
ионным каналом в качестве основы нано приборов большинство исследова


background image

телей считает α-гемолизин (α-ГЛ), продуцируемый бактериями

Staphyloccus

aureus

, поэтому большое число работ посвящено исследованию свойств

именно этого канала. Следует отметить, что способность α-ГЛ формировать
водонаполненные трансмембранные поры в бислойных липидных мембранах
была впервые обнаружена более 35 лет назад в Узбекистане.

В свете выше сказанного тема диссертации является весьма актуальной и

востребованной, так как данные о том, какие структурные особенности вли
яют на функционирование ионных каналов, как зависит их селективность от
строения и аминокислотного состава, могут помочь в конструировании нано
пор с заранее заданными свойствами.

Данное диссертационное исследование в определенной степени служит

выполнению задач, предусмотренных Совместным заявлением между
Республикой Узбекистан и Японией, подписанным в феврале месяце 2011г.

Соответствие исследования с приоритетными направлениями раз вития

науки и технологий республики

. Данное исследование выполнено в

соответствии приоритетного направления развития науки и технологий рес-

33

публики V. «Сельское хозяйство, биотехнология, экология и охрана окружа
ющей среды».

Обзор международных научных исследований по теме диссертации.

Научные исследования, направленные на изучение взаимосвязи струк туры и
функций белковых пор с применением современнейших методов,
осуществляются в ведущих научных центрах и высших образовательных
учреждениях мира, в том числе, University of Manitoba (Италия), Columbia
University, University of Chicago, University of Maryland (США), Националь
ном институте физиологии (Япония), Институте биофизики клетки (Россия),
Национальном Университете Узбекистана и других.

В результате исследований, проведенных в мире по структуре белковых

нанопор, получен ряд научных результатов, в том числе: предложены струк
турные модели вольт-зависимого анионного канала (VDAC) (University of
Manitoba (Италия) и изучены его функциональные особенности, (University
of Maryland, США); предложена кристаллическая структура цитолизина

V.

cholerae

El Tor (Columbia University, США); установлено, что α-гемолизин (α

ГЛ) является гептамером и предложена его кристаллическая структура
(University of Chicago, США).

В мире при изучении ионных каналов по ряду приоритетных направле

ний проводятся исследования, в том числе: по изучению взаимосвязи струк
туры и функций механочувствительных, механосенситивных и TRP каналов;
изучается потенциал-зависимое изменение внутреннего строения каналов,
которое можно обнаружить по влиянию различных органических молекул на
свойства нанопоры; при изучений каналов образованных токсическими бел
ками особое внимание уделяется изучению α-ГЛ и порину A

Mycobacterium

smegmatis,

которые являются наиболее перспективными в плане создания но


background image

вейших нано секвенаторов.

Степень изученности проблемы

. Синтезируемый бактерией

Staphylococcus aureus

α-ГЛ в настоящее время является одним из самых изу

ченных и перспективных белков, формирующих нанопору. Поэтому данный
белок является идеальной модельной системой при исследовании нанопор,
структура которых может быть изменена молекулярно-биологическими ме
тодами, например, методом сайт-направленного мутагенеза, с помощью ко
торого можно варьировать число и расположение основных зарядов внутри
нанопоры и/или у входа в нее. В научных работах зарубежных учѐных, проф.
Х. Байли, д-р. Дж. Касиановича, подробно изучается внутреннее строение
нанопоры образованной α-ГЛ и ее влияние на прохождение различных моле
кул, непосредственно в липидной мембране. Цитолизин

V. cholerae

El Tor де

тально исследован под руководством проф. С. Бхакди. Вольт-зависимый
анионный канал природных мембран, играющий важную роль в процессах
транспорта молекул через клеточные мембраны, а также в апоптозе подробно
изучается в работах проф. М. Коломбини. Макси-анионый канал изучается
группой под руководством проф. Я. Окады.

В исследования ионных каналов в нашей стране проводятся под руко

водством акад. Б.А. Ташмухамедова, профессоров П.Б. Усманова и Р.З. Са-

34

бирова, в частности изучаются α-ГЛ, латротоксин из яда паука каракурта,
выделен ряд новых токсинов, действующих на липидный остов мембран и
блокирующих натриевые каналы возбудимых мембран позвоночных и чле
нистоногих.

Связь темы диссертации с планом научно-исследовательских работ

научно-исследовательских учреждений, где выполнена диссертация.

Диссертационное исследование выполнено в рамках плана научно-исследо
вательских работ и прикладных проектов Института биоорганической химии:
номер госрегистрации 01.97.0005431 «Изучение геометрических параметров
водной поры ионных каналов, формируемых некоторыми белковыми
токсинами, а также белками, изолированными из природных мембран и
некоторыми абиогенными факторами» (1997-1999 гг.); Ф-4.1.3 «Изучение
свойств ионных каналов и транcпортеров в искусственных и природных
мембранах и их роли в регуляции клеточного объѐма» (2003-2007 гг.); ФА

Ф3-Т112 «Биофизические механизмы регуляции объѐма животных и

растительных

клеток»

(2007-2011

гг.);

ФА-Ф5-Т080

«Молекулярная

физиология и биофизика объѐм-активируемого анионного транспорта»
(2012-2016). Темами НИР лаборатории биофизики мембран департамента
биофизики и радиобиологии Федерального университета Пернамбуко
(Бразилия), а также в рамках Меморандума о содружестве между Институтом
биоорганической химии и Национальным институтом физиологии (Япония).

Целью исследования

является определение структурно функциональной

взаимосвязи в ионных каналах, сформированных различными белками

.

В соответствии с поставленной целью решались следующие

задачи


background image

исследования:

определение изменения радиуса поры вдоль оси ионного канала;

определение радиусов водной поры, образованной VDAC, в
высокопроводящем и низкопроводящем состояниях;

разработка нового метода определения стехиометрии нанопор;

исследование влияния на ион-проводящие свойства нанопоры различных
аминокислот, входящих в состав молекулы α-ГЛ, методом цистеин
сканирующего мутагенеза;

исследование влияния химической модификации аминокислот на ион

проводящие свойства канала методом цистеин-сканирующего мутагенеза;
исследование влияния полианионов и краун-эфиров на ион-проводящие
свойства нанопоры α-ГЛ;

проверить предположение, что макси-анионный канал принадлежит к

семейству VDAC белков.

Объектом исследования

являлись ион-проводящие нанопоры,

сформированные белками.

Предмет исследования

зависимость свойств нанопоры от структуры и

аминокислотного состава белков.

Методы исследования.

В работе использованы современные

электрофизиологические и биохимические методы исследования, такие как

35

формирование бислойных липидных мембран (БЛМ) по методу Мюллера и
Монталла-Мюллера, измерение электрических параметров мембран в режиме
фиксации потенциала с полным компьютерным контролем, методы
выделения белков, а также метод цистеин-сканирующего мутагенеза.

Использованы компьютерные программы Origin версии 5 и 8.6,

молекулярные модели строились с помощью программ Swiss-PDBViewer,
Ver. 3.7 и CS Chem3D Pro (CambridgeSoft, Cambridge, MA).

Научная новизна диссертационного исследования

заключается в

следующем:

впервые

установлено,

что

методом

асимметричной аппликации

неэлектролитов можно измерить изменение радиуса поры вдоль оси ионных
каналов;

установлено, что радиус ионного канала VDAC изменяется при переходе

из одного состояния проводимости в другое;

установлено, что свойства ионных каналов зависят не только от знака

заряда заряженных групп, распределенных внутри канала, но и от их
местоположения вдоль оси канала;

разработан новый метод определения стехиометрии олигомерных

нанопор;

установлено, что макси-анионный канал не относится к семейству

VDAC белков;

впервые доказано, что блокирование полианионами ионного канала

зависит как от их размера, так и от концентрации двухвалентных катионов;


background image

установлено, что фиксированный на мембране потенциал вызывает
эластическую деформацию α-ГЛ поры.

Практические результаты исследования.

Предложен новый метод

определения стехиометрии олигомерных нанопор

in situ,

позволяющий

определять стехиометрию ионных каналов в условиях максимально близких к
физиологическим.

Достоверность полученных результатов

обосновывается тем, что

экспериментальные

данные

получены

с

применением

современных

высокоточных методов исследования. Выводы в работе сделаны на основе
результатов,

обработанных

с

использованием

современных

методов

математической статистики.

Теоретическая и практическая значимость результатов

исследования.

Данные, представленные в этой работе, имеют, прежде всего,

фундаментальный интерес, поскольку позволяют выявить зависимость
свойств наноскопических белковых пор от их строения и аминокислотного
состава. Полученные результаты будут применены не только в теоретических
исследованиях, но и могут найти практическое применение в нанотехнологии
в качестве основы для создания нано-датчиков, нано-секвенаторов,
компонентов нано-фильтров, биосенсоров и других нано-устройств,
используемых в современных приборах; также они представляют интерес для
фармакологии, биомедицины и исследований с целью разработки блокаторов
наноскопических пор.

36

Внедрение результатов исследования.

Новые биофизические методы

определения структуры ионных каналов в физиологических условиях:
признаны в Университете Сокендай и в Национальном институте физиологии
Японии и использованы при исследовании структуры белковых нанопор
(Справка Университета Сокендай от 10 марта 2016 года, Япония, Канагава).
Новые биофизические методы признаны также Академией наук Республики
Узбекистан (справка АН РУз от 10 мая 2016 года). Эти методы дают
возможность определения радиуса олигомерных ионных каналов и
определять их стехиометрию.

На основе изменения ионного тока через белковые нанопоры, в

Департаменте Биофизики и радиобиологии Федерального университета
Пернамбуко, Бразилия, разработан нано-датчик, позволяющий распознавать
высокотоксичные белки - микроцистины (справка от 2 мая 2016 года
Департамента биофизики и радиобиологиии). Этот нанодатчик дает
возможность определения циклических пептидных токсинов в системе
гемодиализа.

Апробация работы.

Материалы диссертации докладывались на XI

XVIII, ХХ ежегодных заседаниях «Федерации обществ экспериментальной
биологии» (FESBE) (Бразилия, 1996-2003, 2005); на 43, 44, 48-ом ежегодных
совещаниях Биофизического общества (США, 1999, 2000, 2004); IV
Биофизическом конгрессе стран Южного конуса (Кампинас, Бразилия, 2000);


background image

4-ом Международном семинаре по порообразующим токсинам (Тренто,
Италия 2000); 5-ом Международном семинаре по порообразующим токсинам
(Майнц, Германия, 2004); 87-ом Ежегодном съезде общества физиологов
Японии (Мориока, Япония, 2010).

Опубликованность результатов.

По теме диссертации опубликовано

38 научных работ. Из них 14 научных статей в зарубежных журналах,
рекомендованных

Высшей

аттестационной

комиссией

Республики

Узбекистан для публикации основных научных результатов докторских
диссертаций.

Структура и объем диссертации.

Структура диссертации состоит из

введения, шести глав, заключения, списка использованной литературы.
Объем диссертации составляет 198 страниц.

37

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во

введении

обоснована актуальность проблемы и востребованность

проведенных научных исследований, определено соответствие исследования
приоритетным направлениям развития науки и технологий Республики Узбе
кистан, сформулированы цели и задачи, дан обзор международных научных
исследований по теме диссертации, определена степень изученности про
блемы, ее научная новизна, обоснована достоверность полученных результа
тов, предложено их внедрение, а также изложены основные положения, вы
носимые на защиту, приведены сведения по опубликованным работам и
структуре диссертации.

В первой главе диссертации

«Строение и свойства исследованных

белков каналоформеров»

приведен подробный обзор литературы, посвя

щенной исследованным белкам, формирующим нанопоры в мембранах и из
ложены сведения об их строении, функциях и свойствах.

Во второй главе

«Получение белков каналоформеров и методы их ис

следования»

подробно описаны методы получения всех использованных в

работе белков, изложены электрофизиологические методы исследования, а

также методы математической обработки и статистического анализа данных.

В третьей главе

«Полимерное зондирование ионных каналов

» приве


background image

дены результаты исследований по определению радиусов ионных каналов.

Определение изменений радиуса поры вдоль оси α-ГЛ канала.

Синтезируемый

бактерией Staphylococcus aureus экзотоксин α-гемолизин является
водорастворимым мономером. Этот полипептид, состоящий из 293
аминокслотных остатков, имеет молекулярную массу 33,2 кДа и формирует в
мембранах гомогептамерные поры (Gouaux et al., 1994).

Чтобы определить размер каждого отдельного входа в α-ГЛ канал и по

лучить дополнительную информацию о геометрии последнего, нами была
измерена проводимость канала при асимметричном (одностороннем) добав
лении проникающих неэлектролитов с

цис

или

транс

стороны БЛМ. Таким

образом, были установлены средние величины проводимости основных пу
лов одиночных ионных каналов в присутствии тестовых неэлектролитов на

цис

(g

cis

) или

транс

стороне (g

trans

) канала. Для того, чтобы получить более

точные измерения радиуса канала, мы проанализировали зависимость запол
нения канала полимерами от их гидродинамического радиуса. Для адекват
ной характеристики структурных особенностей поры использовался коэффи
циент заполнения полимером, F(w). В условиях равновесия (симметричная
аппликация полимеров) коэффициент заполнения, равный 1, соответствует
полному заполнению, то есть состоянию, в котором концентрация неболь ших
неэлектролитов внутри поры равна их концентрации в растворе.

Коэффициент заполнения F(w) был рассчитан с помощью следующего

уравнения (Krasilnikov et al., 1998):

χ

( ( )) ( )

g g w w

F w

0

−

( )

=

(1)

χ χ

( ( )) ( )

0

−

w g w

38

где g

0

и

χ

0

- проводимость канала и электропроводность раствора в при

сутствии непроникающего полимера; g(w) и

χ

(w) - проводимость канала и

электропроводность раствора в присутствии проникающего полимера. Как и
ожидалось, коэффициент заполнения F (рис. 1.) зависит от гидродинамиче
ского радиуса полимерных молекул. Максимальное значение F наблюдалось
в присутствии небольших молекул неэлектролитов с радиусом, меньшим, чем
0,6. Очевидно, что внутри канала нет сужения, которое бы остановило поток
этих молекул через пору. Для полимеров с большим гидродинамиче ским
радиусом мы получили различные значения для F

cis

и F

trans

, что указы вает на

асимметрию в геометрии канала. В обоих случаях зависимость коэф
фициента заполнения от гидродинамического радиуса полиэтиленгликолей


background image

(ПЭГ) имеет двухфазный характер и свидетельствует о наличии сужения (или
сужений) внутри канала. При исследовании заполнения с

цис

стороны канала

низкий уровень F (F

cis

~ 0) наблюдался для ПЭГ с большим радиусом

молекул. Молекулы с радиусом больше 1,22 нм не входят в канал со стороны

цис

входа, уменьшение размера молекул полимеров приводит к постепен

ному, но двухфазному, увеличению коэффициента заполнения. Эта двухфаз
ность показывает, что размер водной поры канала от

цис

к

транс

входу из

меняется не плавно. Данную зависимость можно описать тремя прямыми.
Первой соответствует выраженный наклон, наблюдаемый для молекул, ради
усы которых варьировали от 0,9 до 1,22 нм. Второй прямой соответствует
относительно длительная промежуточная инвариантная часть с F = 0,36. Тре
тьей - наклон зависимости параметра F для молекул с размерами между гли
церином и PEG300 (r = 0,31 - 0,6 нм).

Рис. 1. Зависимость F

cis

и F

trans

от

гидродинамического радиуса по

лимеров.

Погрешности равны или меньше,

чем символы. Стрелки указывают

на значения радиусов в критических

точках. Раствор содержал 100 мМ

KCl, 5 мМ Трис/цитрат, рН 7,5, 20%

ПЭГ. Каждая точка получена пу

тем построения гистограмм рас

пределения каналов (n=150-300) по

амплитудам в отсутствие и в при

сутствии полимеров.

Мы предполагаем, что пересечение между первой прямой, которая ап

проксимирует зависимость F

cis

от радиуса полимера (r) и прямой самого низ

кого значения инвариантной части (F

cis

≈

0) дает радиус

цис

входа канала, рав

ный 1,26 нм. Пересечение между первой и второй прямыми (0,9 нм) дает ра
диус первого сужения со стороны

цис

входа. Полимеры этого и меньшего

размеров заполняют часть поры между первым и вторым сужением с распре-

39

делением, независимым от их радиуса. Их размер становится меньше, чем
отверстие второго сужения, на пересечении второй и третьей прямых при 0,6
нм. Таким образом, сначала мы имеем уменьшение радиуса канала от 1,25 нм
до 0,9 нм, затем радиус не меняется до основного сужения (r=0,6 нм).
Наличие относительно длинной промежуточной инвариантной части при
F

cis

=0,36 означает, что молекулы ПЭГ с гидродинамическим радиусом от 0,9

до 0,6 нм одинаково эффективны при заполнении этой части поры. Их
проникновение вдоль оси канала сдерживается основным сужением.
Относительное положение этого сужения можно приближенно оценить из


background image

отношения величины заполнения для этого плато и максимального значения
F

cis

: 0,36/0,6=0,6 (Krasilnikov et al., 1998).

В экспериментах по заполнению канала с

транс

входа также наблюда ется

двухфазный характер зависимости F

trans

от гидродинамического радиуса

неэлектролитов (рис. 1), хотя и гораздо менее выраженный. Как и в случае

экспериментов с

цис

заполнением, молекулы с радиусом больше 1,22 нм не

входят в канал со стороны

транс

входа (F

trans

=0). Полное исключение поли

меров из поры наблюдается для тех же ПЭГ, что и при

цис

заполнении. Из

этого следует, что

транс

вход по размеру близок к

цис

входу. Также, как и в

предыдущем случае, уменьшение размера радиуса полимера приводит к про

грессивному увеличению параметра заполнения. Эта зависимость F

trans

от ра

диуса неэлектролитов может быть разделена на четыре области и аппрокси

мирована четырьмя прямыми. Первая (справа налево) соответствует наклону

зависимости для молекул, радиусы которых варьируют от 0,8 до 1,22 нм. Пе

ресечение между этой и нижней, соответствующей инвариантной части зави

симости F

trans

, прямыми дает радиус

транс

входа в канал, равный 1,24 нм.

В диапазоне размеров молекул от глицерина до PEG300 (0,31 - 0,6 нм) по

не вполне понятным причинам F

trans

и F

cis

качественно отличаются. Когда F

cis

еще растет с уменьшением размера молекул зондирования, F

trans

насыщается

до своего максимального значения при размере PEG300. В качестве предва
рительного вывода можно принять существование основного сужения радиу
сом 0,7 нм и (из-за высокого значения F

trans

(0,4) при этом радиусе), что его

позиция на оси поры, скорее всего, находится ближе к

цис

входу.

Наш упрощенный анализ проводимости одиночных каналов в присут ствии

полимерных неэлектролитов позволяет сделать вывод, что радиусы двух

входов канала практически одинаковы и близки к 1,2-1,3 нм. Также можно

заключить, что в канале имеется выраженное основное сужение с ра диусом

0,6 - 0,7 нм. Из экспериментов по

цис

заполнению мы также предска зываем

наличие второго сужения с r=0,9 нм, расположенного между

цис

вхо дом и

основным сужением канала (рис. 2). Интересно сравнить полученные

результаты с кристаллографическими данными о структуре канала (Song et

al., 1996). Авторы этой статьи разделяют структуру канала на три области,

две из которых, шляпка и ствол, формируют отверстия канала и трактуются в

нашем исследовании как

цис

и

транс

входы. Длина поры составляет 10 нм, а

радиус

цис

входа - 1,4 нм. На расстоянии 3,5 нм от

цис

входа канал достигает

своего максимального радиуса 2,3 нм. Узкая часть поры с радиусом 0,7 нм

40

находится вблизи центра канала. Было также обнаружено, что в стволовой
области радиус поры колеблется от 0,7 до 1,2 нм, в зависимости от объема
боковых цепей аминокислот, которые выступают внутрь цилиндра радиусом
1,3 нм. Данное описание канала демонстрирует значительное сходство с
геометрическими особенностями, установленными в нашем исследовании.
Практически все структурные характеристики, полученные полимерным


background image

зондированием, хорошо согласуются с кристаллографическими данными
(рис. 2).

Рис. 2. Эффективный
радиус канала вдоль
оси поры, полученный
из

данных

кристаллогра
фического и полимер

ного

зондирования.

Длина канала представ
лена в нанометрах, начи
ная от цис входа. Сим
волы

(

○

,

•

)

, соединенные

сплошными линиями

,

де

монстрируют приблизи

тельный профиль поры, полученный из анализа кристаллографических дан
ных (Song et al., 1996). Серыми линиями представлен профиль поры по дан
ным полимерного зондирования. Пунктирная линия обозначает участок, не
доступный для измерения полимерным зондированием. Стрелки указывают
на ключевые участки геометрии поры.

Исследование внутренней геометрии ионного канала, сформированного

цитолизином Vibrio Cholerae.

Цитолизины, продуцируемые некоторыми штаммами

V. cholerae

EL Tor,

а также большинством non-O1 штаммов, являются важными факторами ви
рулентности (Yamamoto et al., 1984; Yamamoto et al., 1986). Цитолизин

V.

cholerae

El Tor (VCC) является растворимым в воде белком с молекуляр ной

массой 63 кДа, он формирует небольшие поры в мембране клеток-мише ней
(Zitzer et al., 1993; Zitzer et al., 1995).

Проведя

детальный

анализ

всех

полученных

результатов,

мы

предложили модель VCC канала (рис. 4). Эта модель, конечно же, является
упрощенной, но в основном она согласуется с данными электронной
микроскопии, которые также указывают на воронкообразную структуру
канала (Zitzer et al., 1997).

41

Рис. 3. Зависимость F

cis

и


background image

F

trans

от гидродинамических

радиусов неэлектролитов.

Горизонтальные стрелки ука

зывают на значения запол

нения для цис (~0,3) и транс

вестибюлей (~0,1) VCC кана

ла. Вертикальные стрелки

указывают на значения

радиусов в критических

точках VCC канала. Раствор

содержал 150 мМ NaCl, 5 мМ

HEPES-NaOH, рН 6,5, 20 %

ПЭГ. Каждая точка получена

путем построения гистограмм распределения каналов (n=80-150) по ампли
тудам в отсутствие и в присутствии полимеров.

Рис. 4. Схематичное изобра

жение строения VCC канала

и его возможная локали

зация в мембране.

Протяженное сужение

(диаметром

≤

1,2 нм)

начинается от

≈

6,5 и продол

жается до

≈

11 нм. Локали

зация канала в мембране

предполагается на основе

данных нашего исследования и

сходства между ионными

каналами, образованными

VCC и VCC2 (Krasilnikov et al.,

1992; Zitzer et al., 1995).

Определение внутренней геометрии VDAC в открытом и закрытом со

стояниях.

Одним из известных свойств ионных каналов является их потенциал-за

висимость. К настоящему времени накопилось множество свидетельств в
пользу того, что это свойство каналов коррелирует с их структурными изме
нениями. Все геометрические модели, разработанные для описания такого
поведения, можно условно разделить на два класса: ''блокировка'' и ''пере
стройка''. Потенциал-зависимые K

+

каналы являются ярким примером первой

модели (Gulbis et al., 2000), а VDAC (Zimmerberg and Parsegian, 1986; Doring
and Colombini, 1985) и коннексоны (каналы щелевых контактов (Unwin and
Ennis, 1984)) - представителями второй.


background image

42

Измерение изменения внутреннего объема канала очень полезно для раз

граничения между этими двумя классами моделей. Поэтому мы использовали
описанный выше метод асимметричного добавления проникающих неэлек
тролитов для измерения изменений во внутренней структуре VDAC, сфор
мированного порином, выделенным из мышц быка (Porin-31BM).

Чтобы обнаружить изменения при переходе из открытого в низкопрово

дящее (закрытое) состояние, мы фиксировали два разных потенциала. Для
анализа геометрии просвета канала в высокопроводящем (открытом) состоя
нии на мембране фиксировался небольшой потенциал (+10 мВ) и собирался
спектр проводимости каналов. В случае низкопроводящего состояния на
мембране фиксировалось также 10 мВ и, когда канал появлялся, потенциал
ступенчато повышался до 50 мВ. Это вызывало переход VDAC в закрытое
состояние проводимости.

Эксперименты проводились с различными ПЭГ по методу, аналогич ному

описанному ранее, т.е. измерялась проводимость канала, когда с одной
стороны мембраны находился непроникающий PEG (PEG4600), а с другой
проникающий. Результаты, полученные для различных каналов в одних и тех
же условиях, были обобщены в кумулятивные гистограммы и проанализиро
ваны таким же образом, как было описано выше.

Рис. 5. Зависимость F

cis

и F

trans

, полученных для

VDAC в полностью от

крытом состоянии, от

гидродинамического

радиуса ПЭГ.

Верти

кальные стрелки обозна

чают величины радиусов

в критических точках

VDAC. На БЛМ фиксиро

валось +10мВ. Раствор

содержал: 1,15 М KCl, 5

мМ HEPES, рН 7, 20 %

ПЭГ. Каждая точка получена путем построения гистограмм распределения

проводимости каналов (n=70-140) по амплитудам в отсутствие и в присут
ствии полимеров.

Полученные величины проводимости каналов были использованы для

расчета коэффициента заполнения канала F(w) неэлектролитами по уравне

нию 1, результаты представлены на рис. 5. Когда канал заполняется с

цис

стороны, неэлектролиты с радиусом больше 0,94 нм не входят в канал (F ~0),

а в диапазоне от 0,94 до 0,8 нм мы имеем резкое увеличение F

cis

. Следова


background image

тельно, со стороны

цис

входа канал имеет цилиндрическую форму с радиу

сом ~ от 0,9 до 1,0 нм. Дальнейшее уменьшение r до 0,6 нм приводит к до

полнительному небольшому увеличению F

cis

, которое все же остается

43

меньше, чем 1. Эксперименты по заполнению канала с

транс

входа показы

вают, что на этой стороне VDAC просвет поры имеет воронкообразную гео
метрию. Небольшая часть канала начинает заполняться неэлектролитами с
гидродинамическим радиусом меньше 1,92 нм. Уменьшение r приводит к
плавному увеличению F

trans

до величины ~ 0,2 (для PEG450, r = 1,05 нм).

Дальнейшее уменьшение r сопровождается резким увеличением F

trans

. Как

отмечалось ранее, такое поведение зависимости F от r указывает на то, что

транс

вход имеет коническую форму с радиусом около 2,0 нм у входа и

сужением до ~ 0,9 -1,0 нм (размер

цис

входа VDAC) на определенном участке

внутри канала. Значения проводимости в низкопроводящем состоянии были
также измерены в присутствии в растворах на

цис

(g

с

cis

) или

транс

(g

с

trans

)

стороне канала ПЭГ разного размера. Так же как и в случае полностью от
крытого состояния небольшие неэлектролиты значительно уменьшали про
водимость закрытого состояния VDAC. Увеличение гидродинамического ра
диуса ПЭГ, начиная с PEG1000 (r = 0,94 нм) для g

с

cis

и с PEG2000 (r = 1,22 нм)

для g

с

trans

, вызывало рост проводимости VDAC до нового стационарного

значения. Исходя из этих результатов, можно предположить, что

транс

вход

VDAC шире, чем

цис

вход в обоих состояниях канала. Однако в

низкопроводящем состоянии разница между размерами двух входов в пору
намного меньше. Величина радиуса

цис

входа VDAC в закрытом состоянии

(~0,9 нм), полученная из F

с

cis

-r зависимости (светлые квадраты на рис. 6),

почти аналогична этой величине, установленной для канала в открытом
состоянии (~1,0 нм, рис. 5). На основании этих данных мы пришли к
заключению, что размер

цис

входа канала, образованного Porin 31BM,

подвергается слабым (если таковые вообще имеют место) изменениям при
переходе из одного состояния проводимости в другое.

В отличие от

цис

входа, зависимость F

с

trans

-r для низкопроводящего со

стояния

(черные квадраты на рис. 6), существенно отличалась от аналогич ной
зависимости при открытом состоянии канала (см. рис. 5), особенно в случае
полимерных молекул с большим гидродинамическим радиусом. Когда VDAC
находится в закрытом состоянии, молекулы с радиусом, равным или больше
1,22 нм (PEG2000), не входят в канал. Зависимость F

с

trans

-r более сложная,

чем F

с

cis

-r, и ее ниспадающая часть легко разбивается на два сег мента

прямыми линиями. Максимальный радиус

транс

входа канала в низ

копроводящем состоянии близок к ~1,2 нм. Это значение существенно

меньше, чем радиус канала в открытом состоянии (~2,0 нм). Таким образом,
переход между открытым и закрытым состояниями проводимости, в основ
ном, сопровождается изменением в размере радиуса именно

транс

входа. В


background image

закрытом состоянии структура канала ближе к форме цилиндра, по сравне
нию с состоянием высокой проводимости. Для установления длины цилин
дрической и конусообразной частей VDAC в низкопроводящем состоянии
результаты были проанализированы также как данные, полученные при от
крытом состоянии. Мы установили, что длина цилиндрической и конусооб
разной частей равна ~2,9 и ~1,7 нм, соответственно. Полученные результаты
показывают, что основные геометрические изменения при переходе из от-

44

крытого в закрытое состояние проводимости происходят в

транс

части ка

нала.

На основе полученных нами данных можно предложить схематичное

геометрическое изображение канала, образованного Porin 31BM, в открытом
и закрытом состояниях (рис. 7). В открытом состоянии радиус цилиндриче
ской части составляет около 1,0 нм и имеет длину ~2,5 нм. Меньший радиус
конической части равен радиусу цилиндрической. Наибольший радиус во
ронки (~2,0 нм) наблюдается у

транс

входа. Длина этой части канала при

мерно равна ~2,1 нм. Переход в закрытое состояние проводимости сопро
вождается небольшим уменьшением радиуса (от ~ 1,0 до ~ 0,9 нм) и увели
чением длины (от ~ 2,5 до ~ 2,9 нм) цилиндрической части за счет конусооб
разной

транс

части канала.

Рис. 6. Зависимость F

c

cis

и F

ctrans

(полученных для VDAC в низ

копроводящем состоянии) от

гидродинамического радиуса

ПЭГ.

Вертикальные стрелки обозна
чают величины радиусов в кри

тических точках VDAC. Каждая

точка получена путем построения

гистограмм распределения каналов

(n=90-200) по амплитудам в

отсутствие и в присутствии

полимеров.

Рис. 7. Внутреннее строение

просвета

VDAC.

L

- длина канала, начиная от цис

входа (0 нм) и заканчивая транс

входом (4,6 нм). Стрелки и цифры

обозначают диаметры входов

канала в открытом и закрытом

состояниях. Пунктирные линии со


background image

стрелками указывают на

начальную точку конусной части

канала в открытом и закрытом

состояниях.

Используя наши данные о геометрии Porin-31BM канала и длину самого

канала, равную 4,6 нм (Guo et al., 1995), можно вычислить объем просвета
последнего. Мы определили, что этот объем равен ~23,3 и ~13,3 нм

3

для от

крытого и закрытого состояния, соответственно. Таким образом, изменение

45

объема при переходе канала из одного состояния в другое составляет около

10 нм

3

.

Различия в биофизических свойствах между макси-анионным каналом и

VDAC.

Основной причиной для предположения, что макси-анионный канал -

это плазмалеммальный VDAC, является тот факт, что эти два канала имеют
общие биофизические свойства. Тем не менее, сходство весьма поверхност
ное и более детальная проверка этих свойств при физиологических условиях
показала существенные различия. Для этого мы провели эксперименты с
VDAC (выделенным из митохондрий печени крысы) при условиях, близких к
физиологическим. Мы встроили его в БЛМ и установили, что проводимость
одиночных каналов в нормальном растворе Рингера приблизительно равна
530 пСм. Эта величина на 30-70% выше проводимости одиночных макси
анионных каналов (300-400 пСм) в такой же среде (Sabirov and Okada, 2009).

В симметричных растворах KCl проводимость макси-анионного канала из
клеток C127 насыщается уже при 2220 мМ KCl с K

m

=590+66 мМ. Данная за

висимость проводимости от концентрации очень отличается от аналогичной
зависимости VDAC, унитарная проводимость которого растет линейно с уве
личением концентрации KCl вплоть до 3,5 М и достигает уровня ~10 нСм без
каких-либо признаков насыщения (Colombini, 1986). Такая огромная разница
в поведении каналов предполагает принципиально различный механизм ион
ного транспорта. Этот вывод подтверждается также и при сравнении ионной
селективности. Слабая селективность VDAC для глутамата относительно

ионов хлора (P

glutamate

/P

Cl

= 0,45 ± 0,03) по сравнению с намного более высо

кой

селективностью в этих же экспериментальных условиях макси-анион ного
канала P

glutamate

/P

Cl

~ 0,2 подтверждает наше заключение о существенных

отличиях во внутреннем строении этих двух пор.

Потенциал-зависимость - еще одно важное свойство, которое является

общим для макси-анионного канала и VDAC. Оба типа каналов закрываются
при фиксации положительного или отрицательного потенциала ± 50 мВ с
временными константами около 50-100 мс при +50 мВ и 300-400 мс при -50
мВ. Тем не менее, важным отличием является уровень минимальной
проводимости. В то время как макси-анионный канал закрывается


background image

полностью, VDAC всегда сохраняет значительную часть (до 40-50%)
проводимости. Так называемые «закрытые» состояния VDAC обладают к
тому же катионной селективностью (Colombini et al., 1996; Colombini, 2004).

Внутреннее строение этих каналов также весьма различно. Так, согласно

нашим данным (рис. 7), VDAC имеет радиус

цис

входа 1 нм, а

транс

входа 2

нм, а у макси-анионного канала разница гораздо меньше: 1,16 нм и 1,42 нм
для радиусов

цис

и

транс

входа, соответственно (Sabirov and Okada, 2004).

На основании вышеизложенного можно заключить, что макси-анионный

канал и митохондриальный порин VDAC формируются разными белками.
Однако этот вывод отнюдь не отвергает возможности самого существования
VDAC в плазмалемме.

46

В четвертой главе

«Исследование ион-проводящих свойств и струк туры

нанопор методом цистеин-сканирующего мутагенеза»

приведены данные

по действию сульфгидрильных реагентов на мутанты α-ГЛ канала.

Ионные каналы являются идеальной модельной системой для изучения

нанопор, так как они самоорганизуются и их структуры можно изменять с
помощью молекулярно-биологических методов. Например, метод сайт
направленного мутагенеза может быть использован для изменения числа и
расположения основных зарядов внутри канала и/или вблизи входов в пору.
Последствия таких изменений в структуре канала, как правило, проявляются
в ионной селективности и форме зависимости проводимости от потенциала
(G-V) (Noskov et al., 2004; Jordan, 2005). Чтобы установить механизм того,
как заряды боковых цепей аминокислот контролируют свойства ионных ка

налов, мы изучили ион-проводящие свойства α-ГЛ канала, образованного ди
ким типом токсина и его генетически модифицированными мутантами с по
следующей химической модификацией.

Наша задача заключалась в определении влияния типа и расположения

основных зарядов аминокислотных остатков на селективность, проводимость
(G) и зависимость проводимости от потенциала α-ГЛ канала. Поскольку пер
вичная последовательность дикого типа α-ГЛ не имеет цистеинов, мы синте
зировали несколько точечных цистеиновых мутантов и определили ион-про
водящие свойства мутантного канала. Мутанты, содержащие цистеин, разде
лили на две группы по позиции в

β

-цилиндре стволового региона на четные и

нечетные.

Для того, чтобы контролируемым образом модифицировать электроста

тический профиль канала, мы использовали реагенты, которые взаимодей
ствуют с сульфгидрильными группами цистеина и привносят положительный
или отрицательный заряд в его боковую цепь. Реакция этих реагентов с боко
вой цепью цистеина преобразует -SH группу в -SS-R, где -R – это заряженная
часть: -CH

2

CH

2

SO

3

–

(MTSES), -CH

2

CH

2

N(CH

3

)

3

+

(MTSET).


background image

Рис. 8. Изменение асимметрии

проводимости цистеиновых

мутантов α-ГЛ под действием

сульфгидрильных реагентов.

Последовательность мутантов

слева направо: T129C, G130C,

K131C, D127C, G133C, L135C,

G137C, N121C, N139C, S141C и

G143C. Раствор содержал: 10

0

мМ

KCl, 30

мМТрис

-HCl,

рН

7,5.

По оси

абсцисс

-

расстояниеоттрансвхода канала

.

Добавление отрицательных зарядов в стволовой регион канала в случае

нечетных аминокислот увеличивало асимметрию проводимости канала, а до-

47

бавление положительных зарядов уменьшало ее. Кроме того, влияние этих
новых зарядов зависело от положения модифицируемого цистеинового
остатка внутри канала (рис. 8). Мутанты с четными номерами, за исключе
нием G130C, были недоступны для реагентов в предварительно сформиро
ванных каналах.

Влияние добавленных зарядов на катион-анионную селективность кана

лов показано на рис. 9. В этих экспериментах действию сульфгидрильных
реагентов подвергались каналы, предварительно встроенные в липидную
мембрану.

Эффективность новых зарядов зависела от их расположения вдоль оси

канала. Относительно слабые эффекты были обнаружены для зарядов, распо
ложенных близко ко входу в канал. Влияние зарядов усиливалось с расстоя
нием и на 1-1,5 нм от

транс

входа V

rev

достигал максимальной величины ~

+21 мВ (MTSET) и -24 мВ (MTSES) с относительными отношениями про
ницаемости P

K

/P

Cl

~ 0,001 и ~ 170, соответственно, в то время как дикий тип

α-ГЛ канала был слабо анион-селективен с V

rev

~ +7,6 мВ и P

K

/P

Cl

~ 0,46.

Максимальные значения V

rev

для химически модифицированных каналов

были близки к потенциалу Нернста при этих условиях (~ +22 мВ и ~ -25 мВ

для Cl и K

+

, соответственно). Положение зарядов влияет на V

rev

и асиммет

рию G-V кривых по-разному. После первоначального роста V

rev

достигает

максимума и остается почти постоянным (рис. 9), тогда как величина асим
метрии, достигнув максимума, быстро уменьшается по мере удаления от

транс

входа (рис. 8). Эти результаты показывают, что общий (интегрирован

ный) заряд несет ответственность за катион-анионную избирательность ка
нала, а баланс зарядов между входами имеет решающее значение для опре


background image

деления формы вольт-амперных кривых.

Рис. 9. Влияние сульфгид

рильных реагентов на потен

циал реверсии каналов, обра

зованных цистеиновыми му

тантами.

Мембрана омывалась 100 и 300

мМ водным раствором KCl на

транс и цис стороне, соответ

ственно, все растворы содер

жали 30 мМ Трис-HCl, рН 7,5.

Последовательность мутантов

такая же, как на рис. 8.

Новый метод определения стехиометрии олигомерных нанопор

.

На

протяжении многих лет α-ГЛ канал считали состоящим из 6 мономе ров, так

как электронно-микроскопические исследования свидетельствовали в пользу

именно гексамерной структуры (Olofsson et al., 1988; Hebert et al., 1992).

Однако рентгеноструктурные исследования в сочетании с химической

48

модификацией показали, что, скорее всего, α-ГЛ канал является гептамером

(Gouaux et al., 1994). Данные, полученные с помощью атомно-силовой мик
роскопии, были несколько противоречивы. Так, гептамерная модель была
подтверждена в ходе одного исследования (Fang et al., 1997), тогда как ре
зультаты другого (Czajkowsky et al., 1998) свидетельствовали в пользу обра
зования в липидной мембране гексамерных структур. В связи с этим мы
предприняли попытку разработать новый метод определения стехиометрии
ионных каналов в условиях, максимально приближенных к физиологиче
ским. В основе этого метода лежит экспериментальное наблюдение того, что
взаимодействие сульфгидрил-специфического реагента DTNB с цистеино
выми мутантами α-ГЛ протекает не по принципу «все или ничего», как это
наблюдалось для дифтерийного токсина (Mindell et al., 1994; Huynh et al.,
1997), а ступенчато (рис. 10), что отражает последовательную модификацию
остатков цистеина в отдельных молекулах олигомерного канала. Временные
интервалы между ступенями варьировали от канала к каналу, что отражает
стохастический характер процесса. Максимальное количество ступеней по
этапного уменьшения проводимости канала, наблюдаемое под действием
DTNB, было равно семи, и это зафиксировано у 25% от общего числа моди
фицированных 38 каналов. Число ступеней, наблюдаемых в других случаях,
колебалось от четырех до шести. Средняя величина изменения проводимо
сти, вызванного реагентом, составляла 6,5 ± 1,6 пСм (среднее значение из 226
событий при фиксации -100 мВ). Нельзя ожидать, что ступени будут иден
тичны в каждом эксперименте, поскольку есть несколько способов, кото рыми


background image

может проходить реакция субъединиц олигомерной поры (Braha et al., 1997).
Тем не менее, первый и последний шаги между определенными состо яниями
должны быть более однородными.

Рис. 10. Изменения

проводимости му

тантных каналов

I7C, индуцирован

ные DTNB.

Действие DTNB на

одиночный канал.

Растворы в обоих

отсеках ячейки со

держали 100 мМ KCl,

1 мМ ЭДТА и 30 мМ

трис-HCl, рН 7,5.

Чтобы проверить это предположение, амплитуды отдельных ступеней были
проанализированы последовательно для всех каналов, в которых наблюда
лось семь ступеней. Действительно, зависимость изменения стандартных от-

49

клонений средней величины амплитуды ступени от номера в последователь
ности оказалась колоколообразной. В соответствии с предсказанием, макси
мальное отклонение наблюдалось для шагов 3-5, в то время как шаги 1 и 7
имели небольшие отклонения. Таким образом, семиступенчатое снижение
проводимости одиночного канала в нашей экспериментальной системе одно
значно идентифицирует α-ГЛ канал как гептамер.

В пятой главе

«Влияние полианионов на α-ГЛ канал»

приведены

данные по блокированию α-ГЛ канала полианионами.

Глюкозаминогликаны являются группой структурно-неоднородных по

лианионов (ПА), способных влиять на широкий спектр физиологических
процессов, в том числе таких, как распознавание, адгезия, мембранный
транспорт, анти-бактериальная защита. Они взаимодействуют с фосфатидил
холином (ФХ) в присутствии ионов Ca

2+

(Vannucchi et al., 1985) и участвуют в

регуляции функций ионных каналов и рецепторов (Van et al., 2006;
Suppiramaniam et al., 2006). Кроме того, есть сообщения о том, что взаимо
действие ПА с ионными каналами зависит от размера молекул ПА (Chicoine
et al., 2004). Однако, детальный механизм влияния ПА на функции ионных
каналов еще плохо изучен. Для решения этого вопроса мы изучили эффекты
двух типов ПА разного размера на проводимость α-ГЛ каналов, а также зави
симость их воздействия от состава среды.

Если на мембране, модифицированной α-ГЛ, зафиксировать напряжение, то


background image

ток мгновенно увеличивается, так как ионы проходят через каналы, нахо

дящиеся в этот момент в открытом состоянии, затем ток начинает посте пенно

уменьшаться из-за перехода каналов в низкопроводящее состояние. В

отсутствие в омывающем мембрану растворе (рН 7,5) гепарина и ионов Ca

2+

фиксация 100 мВ-импульсов напряжения любого знака не вызывает значи

тельного закрытия каналов, а добавление ПА в раствор по обе стороны от

мембраны мало эффективно. Значительные токовые релаксации наблюдались

только тогда, когда в раствор добавлялся CaCl

2

, причем эффект ПА и Ca

2+

за

висел как от стороны добавки, так и от знака фиксированного напряжения.

Мы также исследовали влияние других двухвалентных катионов на потен

циал-зависимость α-ГЛ каналов. Когда в раствор добавляли ионы Mg

2+

и Zn

2+

в присутствии ПА, наблюдались эффекты, качественно аналогичные эффек

там Са

2+

. Единственным различием являлась степень эффективности, с кото

рой различные ионы способствовали потенциал-зависимым переходам ка

нала. Увеличение концентрации всех трех катионов уменьшало постоянную

времени релаксации тока в присутствии фиксированной концентрации ПА

(рис. 11). По эффективности катионы можно было расположить в следующей

последовательности Zn

2+

> Са

2+

> Mg

2+

, идентичной той, что наблюдалась при

ингибировании катионами действия α-ГЛ на клетки (Bashford et al., 1986;

Bashford et al., 1988). Для выяснения механизма влияния ПА на α-ГЛ каналы

мы провели эксперименты с гепаринами и декстран сульфатами (ДС),

имеющими разный размер молекул. В этих опытах мы использовали гепарин

альбумин (HepAlb, 4,8 молекулы гепарина связаны с одной молекулой

бычьего сывороточного альбумина); гепарины со средней молекулярной

50

массой 18000 г/моль (в виде Na-солей), (Hep); 6000 г/моль (Hep6000); 3000
г/моль (Hep3000); гепарин дисахариды с молекулярной массой 563 г/моль
(HepDi); ДС со средней молекулярной массой 500000 г/моль (DS500); 10000
г/моль (DS10); 5000 г/моль (DS5).

Рис. 11. Зависимость постоян

ной времени релаксации про

води-мости (

τ

) от концентра

ции двухвалентных катионов.

Хлориды двухвалентных катио

нов были добавлены (в концен

трациях, указанных на оси абс

цисс) в оба отсека одновре

менно. Раствор содержал 100

мМ KCl, 6 мкг/мл гепарина и 10

мМ Трис-HCl, рН 7,5, n=3-5.

Способность гепаринов блокировать канал зависела от стороны мем

браны, с которой они добавлялись и эффект усиливался с ростом их размеров


background image

и концентрации (рис. 12). Наименьший гепарин, HepDi, практически не
влиял на α-ГЛ канал даже при концентрации 2 мг/мл. Таким образом, не
смотря на меньшие коэффициенты диффузии, большие ПА более эффек
тивны и вызывают более быструю релаксацию тока. Гепарины, использован
ные в настоящем исследовании, можно расположить следующим образом (в
порядке убывания эффективности): HepAlb> Нер> Hep6000> Hep3000>>
HepDi.

Рис. 12. Влияние ПА на постоянную времени релаксации α-ГЛ каналов.

Зависимость постоянных времени релаксации от концентрации гепаринов в
цис (

А

) или транс отсеке (

Б

) ячейки. Сплошные линии проведены согласно

уравнению связывания, исходя из предположения о существовании всего од

ного сайта связывания, n=3-5.

Декстран сульфаты также оказывают влияние на потенциал-зависимость

α-ГЛ канала. Эффективность ДС увеличивается с увеличением их размеров:

51

величины C

50

были равны 220,0

±

30,0 мкг/мл (DS5), 7,2

±

1,5 мкг/мл (DS10) и

1,7

±

0,3 мкг/мл (DS500). ДС имеют большую отрицательную плотность за

ряда, чем гепарины, но они значительно менее эффективны по воздействию
на α-ГЛ канал. Это, скорее всего, связано с различиями в строении молекул
декстран сульфатов и гепаринов.

ПА, оказавшись у входа в α-ГЛ канал, входит внутрь и блокирует его.

Однако вопрос, почему, чем больше молекулярный вес ПА, тем более они
эффективны (рис. 12), остается открытым. Из литературы известно, что фос
фолипиды, включая ФХ, взаимодействуют с ПА (Sagrista et al., 2000; Huster et
al., 1999) только в присутствии двухвалентных катионов, так как эти катионы
образуют мостики между отрицательно заряженными фосфатными группами
фосфолипидов и сульфатными группами ПА (Huster et al., 1999). Кроме того,
экспериментальные данные свидетельствуют о том, что ПА вообще и гепа

рин, в частности, продолжают иметь отрицательный общий заряд даже в 100
мМ Ca

2+

растворе. Так как для действия гепаринов на канал требуется при

сутствие двухвалентных катионов, мы предположили возможность того, что


background image

ПА связываются с мембраной в соответствии с механизмом кальциевых мо
стиков, предложенным в литературе (Huster and Arnold, 1998; Huster et al.,
1999).

Связывание ПА с липосомами вызывает появление отрицательного

ζ

-потенциала на их поверхности. Чтобы проверить, является ли то же самое

верным и для гепаринов, а также для проведения количественной оценки свя
зывания исследуемых ПА с мембраной, мы измерили

ζ

-потенциал ФХ липо

сом в отсутствие и в присутствии гепаринов разного размера. Было обнару
жено, что гепарины уменьшают

ζ

-потенциал ФХ липосом от слегка положи

тельного значения (в отсутствие гепарина) до ~ -24 мВ (рис. 13А). Чем
больше были молекулы гепаринов, тем больше оказывалось их влияние на

ζ

-потенциал. Зависимость

ζ

-потенциала липосом (рис. 13А) от концентрации

гепарина напоминает сходную зависимость гепарин-индуцированной бло
кады α-ГЛ канала (рис. 12). Существует корреляция между эффективностью
гепаринов (представленной как C

50

) в этих двух системах (рис. 13Б).

Эти результаты позволяют предположить, что сильная зависимость бло кады

канала от молекулярного веса ПА объясняется связыванием ПА с мем браной.

Похоже, что на первом этапе взаимодействия канала с ПА-ионом, последний

связывается с мембраной с помощью Ca

2+

-мостиков, что приводит к

повышению локальной концентрации ПА вблизи мембраны и, таким обра

зом, вокруг области входа в канал. Близость входа в канал к поверхности

мембраны увеличивает вероятность того, что поток ионов будет заблокиро

ван ПА. Стационарная концентрация ПА уменьшается нелинейно (Peitzsch et

al., 1995) по мере удаления от поверхности мембраны вплоть до ее объемного

значения. В результате, при одной и той же концентрации ПА в объеме рас

твора их эффективная стационарная концентрация должна быть намного

выше у

транс

входа (который практически соприкасается с поверхностью

мембраны), чем у

цис

входа (удаленного от поверхности мембраны) канала.

52

Последнее объясняет, как разница в расстоянии между поверхностью мем
браны и входами в канал может определять зависимость эффективности ПА
от стороны добавки. Свободные полимерные молекулы случайным образом,
в результате диффузии, могут подходить ко входу в канал, а затем (второй
этап взаимодействия ПА/канал), входя потенциал-зависимым образом, бло
кировать последний.


background image

Рис. 13. Зависимость

ζ

-потенциала

липосом от концентрации гепаринов (А) и корреляция между
концентрацией полу эффекта гепаринов при действии на липосомы и на
α-ГЛ каналы (Б).

n=3-5

В шестой главе

«Исследование эластической деформации α-ГЛ ка

нала»

приведены данные, полученные при исследовании блокирования α-ГЛ

канала заряженным краун/K

+

комплексом

.

Геометрические особенности внутреннего строения поры ионных кана

лов в полностью открытом состоянии считаются, как правило, не завися
щими от потенциала. Хотя это предположение обычно верно, желательно
было бы определить его ограничения. Потенциал-индуцированная эластиче
ская деформация может проявляться в изменении транспортных свойств ка
нала, что особенно важно в случае молекул с размерами, сравнимыми с диа
метром поры. Очевидно, что каналы с ярко выраженной нелинейностью за
висимости тока от напряжения являются наиболее вероятными кандидатами

на обладание эффектами электрострикции, хотя, конечно, нелинейность сама
по себе не обязательно означает электрострикцию. Чтобы исследовать эту
проблему, нужен одиночный ионный канал с хорошо известной структурой и
соответствующий молекулярный инструмент. Поэтому мы выбрали α-ГЛ ка
нал, а представитель большой семьи краун-эфиров, 1,4,7,10,13,16-гексаокса
циклооктан (18-краун-6) с молекулярным размером (~ 1,15 нм в диаметре),


background image

очень близким к размеру самой узкой части поры (диаметр ~ 1,2 нм), был

выбран в качестве инструмента для оценки возможных изменений в канале.

На рис. 14 показано, что при симметричном добавлении 18-краун-6 в 4М

раствор KCl максимум блокировки канала наблюдается при фиксации -70 мВ.

Блокирующий эффект 18-краун-6 сильно асимметричен. Когда он

добавляется только в

транс

отсек, эффект практически неотличим от сим-

53

метричного добавления. В то же время, добавление 18-краун-6 только в

цис

отсек влияет на проводимость очень слабо. Такое поведение указывает на то,
что блокирование связано с заряженным краун/K

+

комплексом, который легко

достигает места связывания со стороны

транс

входа в канал. Комплекс

транспортируется до сайта связывания посредством приложенного потенци

ала, большая часть которого падает в стволовой области канала. На рис. 15
приведена зависимость вероятности того, что сайт связывания не занят
18-краун-6, от потенциала. Вероятность была рассчитана, как

p I i

n

=

1

−

Δ

/

Δ

,

где

Δ

I

- краун-индуцированные изменения в среднем токе, протекающем

через канал и

Δ

i

- уменьшение "мгновенного" тока, индуциро ванное

связыванием одного комплекса краун/К

+

.

Рис. 14. Влияние симмет

ричной добавки 18-краун-6 в

4М раствор KCl на проводи

мость α-ГЛ канала.

Представлен результат ти

пичного эксперимента на оди

ночном канале.

Рис. 15. Зависимость вероят

ности «не блокирования» ка

нала 18-краун-6 от фиксиро

ванного потенциала.

Пунк

тирная линия - наилучшая ап

проксимация по модели

Woodhull для блокирования

тока одиночным элементар

ным зарядом (уравнение 2).

Сплошная линия - аппроксима

ция с помощью модифициро

ванной модели, в которой

предполагается упругая де

формация в зависимости от


background image

фиксированного потенциала.

n=3-5

Для анализа процесса блокирования мы использовали модель Woodhull

(Woodhull, 1973; Hille, 1992) в обобщенном виде (Tikhonov and Magazanik,
1998). Некоторые из основных требований к применимости этого подхода
состоят в том, что блокада проводимости реагентом не является результатом
кооперативных аллостерических эффектов при изменении конформации

54

белка и что блокирующие молекулы действуют независимо друг от друга, за

исключением их конкуренции за сайт связывания. Данные, приведенные в
работе (Bezrukov et al., 2004) и наши собственные результаты позволяют
предположить, что зависимость, представленная на рис. 15, находится в пол

ном согласии с этими требованиями. Ограничение, налагаемое равновесной

термодинамикой на константы скорости (

0

2

0 0
0

1

k k k k

, индекс 0 относится к

1

2

=

− −

нулю

приложенного

потенциала),

известно

как

микроскопическая

обратимость или локальное равновесие. Из-за этого ограничения, в случае
симметричного добавления блокатора тока в виде одиночного элементарного
заряда, вероятность того, что канал не заблокирован, может быть описана как

функция безразмерного потенциала

ψ

=

ϕ

e

/

kT

(

ϕ

- трансмембранный

потенциал,

е

- заряд электрона,

k

- постоянная Больцмана,

T

- абсолютная

температура):

0

( ) ( )

exp exp ( )

δ ψ δ δ δ ψ

+ +

−

A

m m t c

P

+ +

−

+ + +

−

=

(2)

0 0 0 0

(

δ δ δ ψ

) (

δ ψ

) (

δ δ δ ψ

)

B A B A

exp ( ) exp exp ( )

c t m m m t c

где

exp

( )

,

k

1

=

Cb

1

−

δ

t

ψ

exp

(

( )

)

,

k

−

1

=

b

−

1

δ

m

−

δ

t

ψ

exp

(

( )

)

,

k

2

=

b

2


background image

δ

m

−

δ

c

ψ

k

−

=

−

−

,

0

1

0

/

=

−

exp

(

(

δ δ

)

ψ

)

2

Cb

2

c m

0

A k k

,

0

1

0

/

=

−

0

B Ck k

- независимые от

2

1

потенциала константы;

δ

c

,

δ

m

и

δ

t

являются долями потенциала, фиксирован

ного на мембране, которые соответствует положению

цис

барьера, минимуму

и

транс

барьера;

C

- концентрация блокатора.

Принимая во внимание внутреннюю геометрию канала, данные, опубли

кованные другими авторами (Howorka and Bayley, 2002) и наши собственные

оценки, расположение

цис

барьера (

δ

c

) было принято равным 0,8. Если ме

сторасположение

транс

барьера (

δ

t

) не фиксировать, то он, чаще всего, при

нимает нереальное отрицательное значение. Так что мы приняли, что

δ

t

равно

нулю, поставив барьер именно у

транс

входа в канал. В результате, эта

функция содержит только три свободных параметра:

δ

m

- доля трансмем

бранного потенциала, который действует на блокирующий комплекс, а также
параметры

А

и

В

. Наилучшие аппроксимации уравнения (2) для данных на

рис. 15 показаны пунктирными линиями. Эти теоретические кривые не точно
описывают экспериментальные точки, но это не связано с относительно
большими ошибками измерений при малых и положительных напряжениях.
Чтобы получить лучшее согласие с моделью, надо принять одно (или оба) из
следующих двух предположений: (I) заряд краун/K

+

комплекса больше, чем

единица; (II) приложенный потенциал приводит к структурным деформациям
поры и, как следствие, к изменениям взаимодействия 18-краун-6 с порой, что
не учитывается формулой (2).

Чтобы выбрать между этими двумя предположениями, заметим сначала:

твердо установлено, что комплекс между 18-краун-6 и ионами калия образу

ется в пропорции 1:1 (Rounaghi et al., 1997), так что предположение «один за

ряд на один блокирующий комплекс» вполне оправдано. Данные, представ-

55

ленные на рис. 15, получены при сравнительно небольшой концентрации
18-краун-6. Таким образом, первое из наших предположений может быть
проигнорировано. Второе заключается в том, что отрицательный потенциал
уменьшает выходной барьер для 18-краун-6 с

цис

стороны канала за счет

увеличения размера "геометрически узкого места". Действительно, если ра

диус сужения в точности равен или меньше, чем радиус 18-краун-6, барьер


background image

бесконечно велик и молекула комплекса краун/K

+

не может пройти канал.

Если радиус сужения увеличивается при отрицательных потенциалах, то вы
сота барьера быстро уменьшается, что облегчает выход 18-краун-6 из канала
с

цис

стороны. В этой модификации модели параметр

B

является постоян

ным, а параметр

A

теперь является функцией потенциала и увеличивается

при фиксации отрицательного напряжения. В качестве одной из возможно
стей описания глубины ямы и/или изменения барьера приложенным потен
циалом мы выбрали энергию взаимодействия Ван-дер-Ваальса между
краун/K

+

комплексом и стенками поры. Тогда радиус-зависимые взаимодей

ствия можно выразить через известные константы потенциала Леннарда
Джонса для пары водород-водород (Allen and Tildesley, 1989). Предполагая
реалистичную зависимость радиуса перетяжки от потенциала, которая каче
ственно совместима с изменениями проводимости канала, мы приходим к ра
зумному согласию между предсказанием модели и результатами эксперимен
тов. При таком подходе нами установлено, что только предположение об из
менении барьера позволяет соотнести сайт связывания с узкой частью поры
(

δ

m

~0,7) и очень маленькое (~ 0,08 нм) эластичное изменение радиуса этой

части канала способно изменить энергию связи примерно на две единицы

kT

и устранить расхождение между предсказаниями модели и экспериментами.
Кривая, проведенная с учетом таких изменений во взаимодействии 18-краун 6
и поры, показана на рис. 15 сплошной линией. Действительно, фактическая
величина увеличения радиуса, вызванного потенциалом, зависит от прибли
жения, которое используется для сил Ван-дер-Ваальса. Например, было пока
зано (Parsegian, 2005) для геометрий "цилиндр в цилиндре" или "сфера в
сфере", что взаимодействие может быть выражено как обратная зависимость
второй степени. Рассчитывая эту зависимость, можно получить большие из
менения радиуса. Таким образом, наша гипотеза о роли электрострикции в
транспортных свойствах α-ГЛ канала позволяет объяснить наблюдаемую по
тенциал-зависимость как остаточной асимметрии проводимости, так и бло
кирования 18-краун-6 (рис. 15). В обоих случаях предполагаются постепен
ные непрерывные эластичные изменения в структуре ионного канала, про
порциональные приложенной силе. Это принципиально отличается от из
вестных "ворот каналов", когда индуцированные полем конформационные
изменения являются дискретными и часто упоминаются как процессы типа
"все или ничего". В нашем исследовании мы предположили, что видимые
изменения в радиусе поры под действием приложенного электрического поля
являются локальной электрострикцией. Мы можем предложить возможную
механистическую модель эластичной деформации в зоне сужения α-ГЛ ка
нала, где Lys147 перемещается при фиксации потенциала, увеличивая диа-

56

метр канала в этой позиции и облегчая, тем самым, выход 18-краун-6, когда

отрицательный знак потенциала фиксируется на

цис

стороне, или уменьшая

диаметр канала и затрудняя транспорт 18-краун-6 при фиксации положи
тельного потенциала. Тем не менее, приведенные оценки показывают, что


background image

гипотеза электрострикции, выдвинутая в нашем исследовании, является до
статочно правдоподобной.

ВЫВОДЫ

1. Впервые модифицированным методом полимерного зондирования

установлено, что:

а) диаметры двух входов α-ГЛ канала близки друг к другу и равны 2,6/2,4

нм (

цис/транс

). α-ГЛ канал имеет 2 узких участка: основное сужение

диаметром 1,3 нм, расположенное примерно в центре канала и второе, диа
метром 1,8 нм, расположенное ближе к

цис

входу в канал;

б) диаметр

цис

входа VCC канала равен 1,9 нм, а

транс

входа 1,6 нм,

внутри канала имеется одно сужение диаметром 1,2 нм;

в) диаметры

цис

и

транс

входов ионного канала VDAC в высокопрово

дящем состоянии равны 2,0 и 4,0 нм, соответственно. При переходе в
низкопроводящее состояние диаметры обоих входов уменьшаются и
становятся равными 1,8 и 2,4 нм, соответственно. Суммарное уменьшение
объема канала равно ~10 нм

3

, что составляет около 40% от общего объема

поры.

2. Детальное сравнение, при физиологических условиях, биофизических

свойств макси-анионного канала и VDAC показало, что они формируются
разными белками.

3. Впервые, методом цистеин-сканирующего мутагенеза, доказано, что

добавление в структуру α-ГЛ канала дополнительных отрицательных зарядов
изменяет его слабо анионную селективность на сильно катионную, а
добавление

положительных

зарядов заметно увеличивает анионную

селективность. Степень этих изменений зависит как от радиуса канала в
точке добавления нового заряда (что преимущественно влияет на ионную
избирательность), так и от расположения зарядов вдоль продольной оси
канала (в основном изменяет вольт-амперную характеристику). Эти
результаты демонстрируют, что суммарный заряд стенки поры несет
ответственность за катион-анионную селективность α-ГЛ канала, а
положение заряда у входа в пору является основным фактором,
определяющим форму вольт-амперных кривых.

4. Разработан новый метод определения стехиометрии олигомерных

ионных

каналов,

основанный

только

на

электрофизиологических

измерениях. С помощью него установлено, что α-ГЛ канал, сформированный
в бислойной липидной мембране, является гептамером.

57

5. Установлено, что молекула полианиона входит в пору за счет

электростатических сил и физически блокирует прохождение ионов.


background image

Вероятность блокирования α-ГЛ канала полианионами зависит:

а) от присутствия и концентрации двухвалентных катионов, которые по

эффективности располагаются в следующей последовательности: Zn

2+

> Ca

2+

> Mg

2+

;

б) от концентрации, молекулярной массы и структуры полианионов;

эффективность влияния полианионов на канал коррелирует с их влиянием на
ζ-потенциал мембран;

в) от стороны добавки полианионов, их добавка со стороны

транс

входа

канала более эффективна, что связано с асимметричным строением α-ГЛ
канала.

6. Впервые доказано, что фиксированный на мембране потенциал

вызывает эластическую деформацию α-ГЛ канала, что объясняет остаточную
асимметрию его вольт-амперной характеристики при высоких концентрациях
соли и зависимость его блокировки комплексом 18-краун-6 с катионом калия
от потенциала.

58

SCIENTIFIC COUNCIL ON AWARD OF SCIENTIFIC DEGREE OF


background image

DOCTOR OF SCIENCES 16.07.2013.K/B/T.13.01 AT INSTITUTE OF

BIOORGANIC CHEMISTRY AND THE NATIONAL UNIVERSITY

OF UZBEKISTAN

INSTITUTE OF BIOORGANIC CHEMISTRY, FEDERAL UNIVERSITY

OF PERNAMBUCO

MERZLYAK PETR GRIGORIEVICH

CHARACTERISTICS OF RELATIONSHIP OF STRUCTURE AND

FUNCTIONS IN PROTEIN NANOSCOPIC PORES

03.00.02 –Biophysics and radiobiology

ABSTRACT OF DOCTORAL DISSERTATION

Tashkent – 2016

59


background image

The subject of doctoral dissertation is registered at Supreme Attestation Commission at the
Cabinet of Ministers of Republic of Uzbekistan under number 30.09.2014/В2014.5.В73

Doctoral dissertation is carried out at Institute of Bioorganic Chemistry, the Federal

University of Pernambuco.

The full text of doctoral dissertation is placed on web page of Scientific council

16.07.2013.K/B/T.13.01 of the Institute of Bioorganic Chemistry and the National University of
Uzbekistan to the address http://ss.biochem.uz

Abstract of dissertation in three languages (Uzbek, Russian, English) is placed on web

page to address http://ss.biochem.uz and on Information-educational portal “ZiyoNet” to address
www.ziyonet.uz.

Scientific Consultant: Krasilnikov Oleg Vladimirovich

doctor of sciences in biology,

professor

Official opponents: Mirkhodjaev Ulugbek Zakirovich

doctor of sciences in biology,

professor

Madyarov Shukhrat Raimdjanovich

doctor of sciences in biology

Turdikulova Shahlo Utkurovna

doctor of sciences in biology

Leading institution: Institute of microbiology AN RUz

Defense will take place on «_____» ___________ 2016 at ___ at the meeting of the

Scientific council 16.07.2013.K/B/T.13.01 of the Institute of Bioorganic Chemistry and the
National University of Uzbekistan at the following address: 100125, Tashkent, 83 M. Ulugbek
street. Phone: 262 35 40, Fax: (99871) 262 70 63

Doctoral dissertation is registered in library at the Institute of Bioorganic Chemistry, it is

possible to review it in library (100125, Tashkent, 83 M. Ulugbek street. Phone: 262 35 40, Fax:
(99871) 262 70 63), e-mail: asrarov54@mail.ru

Abstract of dissertation sent out on«_____» ___________ 2016 year

(mailing report _____ on «_____» ___________ 2016 year)

A.S. Turaev

Chairman of Scientific council

on award of scientific degree of doctor of sciences

doctor of sciences in chemistry, professor

M.I. Asrarov

Scientific secretary of Scientific council

doctor of sciences in biology, professor

D.A. Kadyrova

Chairman of Scientific seminar at Scientific council

on award of scientific degree of doctor of sciences

doctor of sciences in biology, professor


background image

60

ANNOTATION OF DOCTORAL DISSERTATION

Topicality and relevance of the dissertation topics

. One of the major

problems

in modern biophysics is to study the relationship of structure and

function of ion channels formed by proteins. On one hand, the ion channels are
nanoscopic pores which exhibit selectivity to ions, ability to selectively transport
through the membranes different molecules or respond to them by changing their
own properties. On the other hand, some organisms (including highly pathogenic
ones) produce proteins that are capable to spontaneously integrate in the host cell
membrane and form there ion channels

de novo

. Not only clinical symptoms of

various infectious diseases, but also compositions of medium in which the cells
and bacteria exist depend on these proteins. Therefore, nanopores formed by
proteins attracted attention of researchers of all over the world, both in terms of
basic principles of biophysical and physiological functioning of living cells, and
from the practical aspect, as there are ideas for their use as nano sequencers,
components of nano-filter, biosensors and other nanodevices. The data on what
structural characteristics affect nanopore functioning and how selectivity depends
on their structure and amino acid composition may help in designing nanopores
with predetermined properties.

In international publications, scientists noted that knowledge about the struc

ture of protein nanopores and its impact on their properties, can help both in the
development of modern medicine and the development of nanodevices used in
modern devices. Most researchers believe that α-hemolysin (α-HL) is the most
promising ion channel as a basis of these instruments, and therefore, a large num
ber of papers devoted to the studies of the properties of this channel have been
published. The ability of α-HL to form water-filled transmembrane pores in bilayer
lipid membranes was first discovered over 35 years ago in Uzbekistan.

This dissertation research to a certain extent is the implementation of the tasks

stipulated by the Joint Statement between Uzbekistan and Japan signed in
February.

Compliance of the investigation with Priority Directions in Science

and Technology of the Republic of Uzbekistan.

This study was performed

according to the priority directions of development of science and technology of
the Repub lic, V: «Agriculture, biotechnology, ecology and environmental
protection».

Review of international scientific research on the topics of

dissertation.

Research addressing the relationship of structure and function in

protein pores us ing modern methods are being carried out in the world leading
research centers and higher educational institutions including the University of
Manitoba (Italy), Co lumbia University, University of Chicago, University of
Maryland (USA), Na tional Institute for Physiological Sciences (Japan), Institute of
Biophysics of Cells (Russia).

As a result of research carried out in the world on the structure of the protein


background image

nanopore, a number of scientific results have been obtained including: the pro
posed structural model of the voltage-dependent anion channel (VDAC) and its
functional features (University of Manitoba, University of Maryland), a crystal
structure of the cytolysin of

V. cholerae

El Tor (Columbia University), the finding

that the α-HL is a heptamer and its crystal structure (University of Chicago).

61

In the world, the studies on ion channels are being performed in a number of

priority areas including the relationship of structure and function in mechanosensi
tive and TRP channels, studies on the potential-dependent changes in the internal
structure of the channels, which can be found upon the influence of various organic
molecules which affect the properties of the nanopore, the studies of the channels
formed by toxic proteins focused on the study of α-HL and porins of

Mycobacte

rium smegmatis

, which are the most promising in terms of creating new nano se

quencers.

Degree of study of the problem.

Synthesized by the bacterium

Staphylococ

cus aureus

, α-НL is currently one of the most studied and promising proteins that

form a nanopore. Therefore, the protein is an ideal model system in the studies of
nanopores whose structure can be altered by molecular biological techniques, for
example, by site-directed mutagenesis, through which one can alter the number and
location of the main charges inside the nanopores and/or at the pore entrance. The
scientific works of foreign scholars, prof. H. Bayley and Dr. J. Kasianowicz, stud
ied in detail the internal structure of the nanopore formed by α-HL and its influ
ence on the passage of various molecules directly into the lipid membrane. Cytoly
sin

V. cholerae

El Tor has been studied in detail under the guidance of prof. S.

Bhakdi. The voltage-dependent anion channel of natural membranes, which plays
an important role in the transport of molecules across cell membranes, as well as in
apoptosis has been studied in detail by Prof. M. Colombini. The maxi anion
channel has been studied by a team led by prof. Y. Okada.

The study of ion channels in our country have been performed under the lead

ership of akad. B.A. Tashmukhamedov, professors P.B. Usmanov and R.Z. Sabi
rov. Particularly, α-HL and the latrotoxin of the Black Widow Spider venom have
been investigated and a number of new toxins acting on the membrane lipid back
bone and blocking the sodium channels of excitable membranes of vertebrates and
arthropods have been identified.

Relation of the Dissertation to the thematic scientific research plans of the

Institution

. This work has been carried out in accordance with the research themes

of the Laboratory of Molecular Physiology, Institute of Bioorganic Chemistry of
the Academy of Sciences of Uzbekistan within the fundamental research projects:
"The study of geometrical parameters of the water pore of ion channels formed by
several protein toxins and proteins isolated from natural membranes and some abi
ogenic factors" (1997-1999); F-4.1.3 "Studying the properties of ion channels and
transporters in artificial and natural membranes and their role in regulation of cell
volume" (2003-2007); FA-F3-T112 "Biophysical mechanisms of regulation of the
volume of animal and plant cells" (2007-2011); FA-F5-T080 "Molecular Physiol


background image

ogy and Biophysics volume-activated ion transport" (2012-2016). Also, within the

research topics of the Laboratory of Membrane Biophysics of the Department of
Biophysics and Radiobiology of the Federal University of Pernambuco (Brazil) and
within the framework of the Memorandum of collaboration between the Insti tute
of Bioorganic Chemistry of the Academy of Sciences of Uzbekistan and the
National Institute of Physiology of Japan.

62

The aim of research work

is to conduct structural and functional analysis of

nanopores formed by different proteins

.

Tasks of research work

in connection to the purpose of investigation:

determination of the radius of the pores along the axis of an ion channel;
determination of radii of water pores formed by VDAC in its high- and low
conducting states;

development of a new method of determination of the stoichiometry of na

nopores; studying by cysteine-scanning mutagenesis the effects of different amino
acids that constitute the molecule of α-HL on the ion-conductive properties of na
nopores;

probing, by cysteine-scanning mutagenesis, the effects of chemical modifica

tion of amino acids on the channel ion-conductive properties;

studying the effects of polyanions and crown ethers on ion-conducting prop

erties of the α-HL nanopore;

testing the hypothesis that maxi-anion channel belongs to a family of VDAC

proteins.

The object of study

is the ion-conductive nanopores formed by proteins.

Subject of research

- the dependence of the properties of the nanopore on the

protein structure and amino acid composition.

Methods of research.

We used modern electrophysiological and biochemical

methods of research, such as the formation of bilayer lipid membranes by the
method of Mueller and Montal-Muellerl, measuring the electrical parameters of the
membranes in a voltage-clamp mode with full computer control, methods for iso
lating proteins, as well as the method of cysteine-scanning mutagenesis. Computer

program Origin, versions 5 and 8.6 were used for data analysis; for building the
molecular models, we used the programs Swiss-PDBViewer, Ver. 3.7 and CS
Chem3D Pro (CambridgeSoft, Cambridge, MA).

Scientific novelty

of the dissertation work includes the followings: for the

first time, using the method of asymmetric application of non-electro lytes, it has
been shown that the changes in the pore radius along the axis of the ion channels
can be detected;

it was found that the radius of the VDAC ion channel changes upon transition

from one to other conduction state;

it was found that the properties of ion channels depend not only on the sign of

the charge of the charged groups distributed within a channel, but also by their lo
cation along the longitudinal axis of the channel;


background image

a novel method for determining the stoichiometry of channels formed

in situ

has been proposed;

it is established that the maxi-anion channel does not belong to the family of

VDAC proteins;

for the first time, it was demonstrated that blocking of ion channel by poly

anions depends on their size and concentration of divalent cations; it was found
that the potential clamped on the membrane causes an elastic de formation of the
α-HL pore.

63

Practical results of the study.

A new method of determining the

stoichiometry of oligomeric nanopores in situ, which allows to determine the
stoichiometry of the

ion channels in conditions as close as possible to the

physiological has been proposed.

Reliability of the results

is based on the fact that the experimental results

were obtained by using modern methods of investigation. The conclusions were
made based the results processed using the modern methods of mathematical
statistics.

The scientific and practical value the study results.

The data presented in

this work are primarily of fundamental interest because they allow identification of
protein-dependent properties of nanoscopic pores and their relation to the structure
and amino acid composition, and thus help to create nanopores with properties re

quired for the creation of various nanosensors. The results obtained will find prac
tical application in nanotechnology as a basis for development of nanosensors,
nano sequencer components, nano-filters, biosensors and other devices used in
modern devices; they are of interest for the pharmaceutical, biomedical research to
develop nanoscopic pore blockers.

Implementation of results into practice.

The new biophysical methods of

determination of structure of ion channels under physiological conditions: have
been acknowledged by the SOKENDAI University and the National In stitute for
Physiological Sciences and employed for the studies of structure of pro tein
nanopores (Reference of the SOKENDAI University of March 10, 2016, Ja pan,
Kanagawa). The new biophysical methods have also been acknowledged by the
Academy of Sciences of Uzbekistan (Reference of the Ac. Sci. RUz of March 10,
2016). These methods allow determination of the radius of oligomeric ion channels
and establishing their stoichiometry.

Base on the changes of ionic current through protein nanopores, at the De

partment of Biophysics and Radiobiology of the Federal University Pernambuco,
Brazil, a nano-sensor has been developed, which allows detection of highly toxic
proteins – microcystins (Reference of May 2, 2016 of the Department of Biophys
ics and Radiobiology). This nano-sensor gives a possibility of determination of cy
clic peptide toxins in hemodialysis systems.

Approbation of the work.

The results of the studies were presented at the XI

XVIII and XX Annual Meetings of the "Federation of Societies for Experimental


background image

Biology» (FESBE) (Brazil, 1996-2003, 2005); 43

rd

, 44

th

and 48

th

Annual Meetings

of the American Biophysical Society (USA, 1999, 2000, 2004); IV Biophysical
Congress of the Southern Cone (Campinas, Brazil, 2000); 4

th

International Work

shop on pore-forming toxins (Trento, Italy 2000); 5

th

International Seminar on the

pore-forming toxins (Mainz, Germany, 2004); 87

th

Annual Meeting of Japan Soci

ety of Physiologists (Morioka, Japan, 2010).

Publication of the research results.

On the dissertation theme, 38 publica

tions including 14 primary research papers, all in international journals recom
mended by the Supreme Attestation Commission of the Republic of Uzbekistan for
publication of basic scientific results of doctoral dissertations.

The structure and volume of the thesis.

The dissertation consists of an In

troduction; six Chapters, Conclusion, and the List of the used references. The vol
ume of the thesis is 198 pages.

64

MAIN CONTENT OF DISSERTATION

In

Introduction,

the urgency and demand of the theme of dissertation is em

phasized, the purpose and problems, and also an objects of research are formulated,
conformity of research to Priority Directions of Development of Science and
Technologies in the Republic of Uzbekistan is stated, scientific novelty and practi
cal results of research are formulated, reliability of obtained results is proved, the
theoretical and practical importance of the obtained results is described, practical
applications of the research results are noted, and information on previously pub
lished works and dissertation structure is presented.

In the first chapter,

"Structure and properties of the investigated channel

forming proteins"

, a detailed review of the literature dealing with all the na

nopores studied in this thesis is presented, the information about their structure and
functions is provided, and the modern data on the structure and properties of pro
tein channels studied in this thesis is given.

The second chapter,

"Preparation of channel-forming proteins and meth

ods of their investigation",

describes in details methods for obtaining of all used

proteins and clearly outlines the employed electrophysiological methods.

In the third chapter,

"The polymer probing of ion channels"

, the results of

research to determine the ion channel radius are presented.

Synthesized by the bacterium

Staphylococcus aureus

, the exotoxin α- hemoly

sin is a water-soluble monomer. The polypeptide constitutes a 293-residue single
chain protein with a molecular mass of 33.2 kDa. Seven molecules of α -toxin form
one transmembrane channel (Gouaux et al., 1994).

To gauge the size of each entrance of the α -toxin channel and to probe the

geometry of the channel lumen, we measured the channel conductance with poly
meric nonelectrolytes added to the

cis

or

trans

side of the BLM. With this purpose,

we calculated the averaged conductivities of major pools of single ion channels in
the presence of test non-electrolytes at

cis

(g

cis

) or

trans

side (g

trans

) of the channel.

For more precise estimation of the pore size, we analyzed the dependence of pore


background image

filling on the polymer hydrodynamic radius. To deduce pore structural features, we
introduced the polymer filling factor, F(w), which describes the ratio of the pore
length that is accessible to a polymer of a given molecular weight, w, to the total
pore length L. Under equilibrium conditions (symmetrical application of poly

mers), a filling factor of 1.0 would correspond to equipartitioning, that is, to a large

pore in the presence of small polymers that occupy all of the volume of the pore
with a concentration equal to that in the bulk. Filling factor F (w) was calculated
by the following equation (Krasilnikov et al., 1998):

χ

( ( )) ( )

g g w w

F w

0

−

( )

=

(1)

χ χ

( ( )) ( )

0

−

w g w

where g

0

and

χ

0

is the channel conductance and solution conductivity in the

presence of impermeant polymers, g(w) and

χ

(w) is the channel conductance and

solution conductivity in the presence of polymers of different molecular weight, w.
As expected, the filling, F (fig 1.), is dependent on the hydrodynamic radius of
polymer molecules. In both cases, the maximum values of F observed in the pres-

65

ence of the smallest nonelectrolyte are close to 0.6. In this case, there is no con

striction inside the channel lumen that is narrow enough to stop the flux of glycerol
molecules through the pore. When polymers with larger hydrodynamic radii were
used, we observed significantly different values for F

cis

and F

trans

, indicating an

asymmetry in the α -toxin channel geometry. In both cases, the dependence of
filling on the hydrodynamic radius of polyethylene glycols (PEG) shows a biphasic
behavior, which, in the case of a cylindrical geometry, suggests the presence of a
constriction(s) in the channel lumen.

Fig. 1. Dependence of F

cis

and F

trans

on polymer hydrodynamic radii.

The error bars are equal to or smaller

than the symbols used. Arrows indicate

the radii values at critical points. The

solution contained 100 mM KCl, 5 mM

Tris / citrate, pH 7.5, 20% PEG. Each

point is obtained by plotting histo

grams of the distribution of the channel

amplitudes (n = 150-300) in the ab

sence and presence-polymers.


background image

In the

cis

filling experiments, the lowest level of filling (F

cis

~ 0) is observed

for the largest PEG used. Molecules with radii larger than 1.22 nm do not enter the
channel from the

cis

entrance at all. It can be seen (Fig. 1) that a decrease in poly

mer size leads to a progressive, but biphasic, increase in filling. This behavior sug
gests that the size of the channel pore does not change smoothly from

cis

to

trans

opening. Three straight lines can fit this part of the dependence (from right to left).
The first line fits a pronounced slope observed for molecules, the radii of which
varied from 0.9 nm to 1.22 nm. The second line fits a relatively long plateau of the
dependence with F

cis

=0.36. The third line fits the slope of the dependence that is

measured for molecules with sizes between those of glycerol and PEG300 (r
=0.31– 0.6 nm) when filling increases from 0.36 to its maximum value of 0.6. We
argue that the interception between the first line that fits the slope of the falling
part of F

cis

dependence and its lowest invariant part (F

cis

= 0) gives the radius (1.26

nm) of the channel

cis

opening. The interception between the first and second lines

(0.9 nm) gives the radius of the first constriction as seen from the

cis

side opening.

Polymers of this and smaller sizes fill the part of the pore between this and the
second (with a smaller aperture) constriction, with partitioning independent of
their size. Their size gets smaller than the aperture of the second constriction at the
intersection of the second and third lines at 0.6 nm. Thus, we first deduce the
decrease in the channel radius from 1.25 nm to 0.9 nm; then after this point, the ra
dius stops decreasing until the main constriction (r =0.6 nm) is reached. The pres

ence of a relatively long intermediate invariant part of the dependence with F

cis

=0.36 means that molecules of PEG with hydrodynamic radii varying from 0.9 nm
to 0.6 nm are equally effective in filling the channel pore. Their penetration

66

along the pore axis is restrained by the major constriction. The relative position of

this constriction, as seen from the

cis

side opening, can be approximately estimated

by the ratio of filling value for this plateau and its maximum value (Krasilnikov et
al., 1998) as 0.36/0.6= 0.6.

In the

trans

filling experiments, polymer partitioning also shows biphasic be

havior (Fig. 1), although it is much less expressed. As in the case of

cis

filling ex

periments (see above), molecules with radii larger than 1.22 nm do not enter the
channel from the

trans

opening at all (F

trans

=0). Complete polymer exclusion from

the pore is observed for almost the same PEGs as for the

cis

filling. This demon

strates that the size of the

trans

opening is close to the size of the

cis

opening.

Again, a decrease in polymer size leads to a progressive increase in filling. The de
creasing part of the dependence F

trans

can be divided into four regions approxi

mated by four straight lines. The first (from right to left) line fits an extended slope
observed for molecules, the radii of which varied from 0.8 nm to 1.22 nm. The in
terception between this line and the lowest invariant part of the dependence F

trans

indicates the radius (1.24 nm) of the

trans

opening of the channel.

In the range of sizes between glycerol and PEG300 (r 0.31– 0.6 nm), for the


background image

reasons that we do not know, F

trans

and F

cis

differ qualitatively. While cis filling still

grows as probing molecule size decreases,

trans

filling saturates to its maximum

value at the size of PEG300. The biphasic features of the

trans

filling are poorly

expressed. Among the tentative conclusions would be the existence of the main
constriction of 0.7 nm radius. Its position along the pore axis would be predicted as
close to the

cis

opening of the pore because of the high filling value (0.4) at this

radius.

Our simplified analysis of the single-channel conductance in the presence of

polymeric nonelectrolytes allows us to conclude that the radii of two openings of
the channel are practically equal and are close to 1.2–1.3 nm. We also infer that the
channel has a main constriction with a radius of 0.6 – 0.7 nm. From the

cis

filling

experiments, we predict the presence of the second constriction (with r=0.9 nm),
which is situated between the

cis

opening and the main constriction.

Let us compare our findings with crystallographic data on the channel struc

ture (Song et al., 1996). The authors divide the channel structure into three do
mains, two of which, Cap and Stem, form the channel openings defined, respec
tively, as

cis

and

trans

in our study. The channel pore length is 10 nm and the ra

dius of the

cis

opening is 1.4 nm. At 3.5 nm from the

cis

opening, the channel pore

reaches its maximum radius of 2.3 nm. The narrowest part of the pore, with a ra
dius of 0.7 nm, was established to be near the channel center. It was also found that
in the stem region, the pore radius varies from 0.7 to 1.2 nm, depending on the
volume of the side chains that protrude into the 1.3-nm-radius cylinder. Just from
this description of the channel one can see a significant likeness with the geomet
rical features established in our study (Fig. 2).

67

Fig. 2. The apparent ra
dius

of

the

α-HL

channel pore along the
pore

axis

from

crystallographic

and

polymer

probing

studies

.

Channel length

is shown in nanometers,
starting from the cis
opening. Symbols

(

○

,

•

)

,

joined by solid lines mark

the approximate profile

of


background image

the pore deduced from analysis of crystallographic data of Song et al. (1996) for
Cap and Stem regions. Striped lines visualize the pore profile from polymer prob
ing. Arrows indicate key points of the pore geometry.

Study of the internal geometry of the ion channel formed cytolysin Vibrio

Cholerae.

Cytolysins produced by some strains of

V. cholerae

EL Tor, and a ma

jority of non-O1 strains are potential virulence factors (Yamamoto et al., 1984;
Yamamoto et al., 1986). Cytolysin

V. cholerae

El Tor (VCC) is a water soluble

protein with a molecular mass of 63 kDa, and forms small pores in the membrane
of target cells (Zitzer et al., 1993; Zitzer et al., 1995).

Fig. 3. The dependence of F

cis

and

F

trans

on the hydrodynamic radii of

nonelectrolytes

.

Horizontal arrows

indicate filling values for the cis

(~0.3) and the trans (~0.1) vestibules

of the VCC channel. Horizontal ar

rows indicate the values for filling of

the cis (~0.3) and trans entrance

(~0,1) VCC channel. Vertical arrows

indicate the values of the radii at the

critical points VCC channel.

The solution contained 150 mM NaCl, 5 mM HEPES-NaOH, pH 6.5, 20% PEG.

Each point is obtained by plotting the histograms of the distribution of channels
amplitudes (n = 80-150) in the absence and presence of polymers.

In our experiments, we measured conductance of the channel in the solutions of

non-electrolytes in contact with the

cis

or

trans

entrance of the channel, while the

non-penetrating non-electrolyte (PEG2000) is on the opposite side of the chan nel.

For exact values of the radii of the channel entrances and examining its inter nal

geometry, we analyzed the dependence of the parameter of channel filling

F (w)

on the hydrodynamic radius of non-electrolytes (Fig. 3). After the detailed analysis

of these results, we proposed a model VCC channel (Fig. 4). This model,

68

of course, is simplified, but basically it is consistent with the data of electron mi
croscopy, which also assumed a funnel-like channel structure (Zitzer et al., 1997).

Fig. 4. An inside view on the VCC1

channel lumen and possible chan

nel localization in membrane.

The

stretched constriction (diameter

≤

1.2

nm) is appeared from

≈

6.5 nm to

≈

11


background image

nm of the channel length. Channel

localization in membrane was de

duced based on the similarity be

tween ion channels formed by VCC1

and VCC2 (Krasilnikov et al., 1992;

Zitzer et al., 1995).

Determination of the intrinsic geometry of VDAC in the open and closed state.

Protein pores (ion channels) possess several properties such as conductance, selec
tivity and gating. There are growing indications that the electrical properties of
single ion channels, called „„gating‟‟, are correlated with its structural modifica
tions. All geometric models developed to describe this behavior can be roughly di
vided into two classes: „„blocking‟‟ and „„rearrangement‟‟. It appears that voltage
dependent K

+

channels are a striking example of the first model of gating (Gulbis

et al., 2000), while VDAC (Zimmerberg and Parsegian, 1986; Doring and
Colombini, 1985) and gap junction (Unwin and Ennis, 1984) are representatives of
the second model of gating.

Measurement of changes in the internal volume of the channel is very useful

in distinguishing between these two classes of models. Therefore, we used the ap
proach described above, which is based on the distribution of non-electrolytes, for
measuring the changes in the internal structure of the VDAC channel formed by a
porin from bovine muscles (Porin-31BM). To find the changes in the interior of the
open channel and its low-conducting (closed) state, we applied two different po
tentials. To analyze the geometry of the lumen of the channel in a highly conduct
ing (open) state, we applied relatively small potential of 10 mV and spectrum of
channel conductance was collected. In order to analyze the channel lumen geome
try in a low-conductance state, the bilayer was initially clamped at 10 mV. When a
channel appeared, its conductance was measured and the potential was changed to
50 mV. This caused VDAC to switch to its low-conductance state.

Experiments were conducted with different PEGs according to the method

similar to that described above, i.e. channel conductivity was measured when one
side of the membrane was exposed to an impermeant PEG (PEG4600), and the
other one – to a test PEG. The results obtained for the various channels in the same
conditions were summarized in cumulative histograms and analyzed in the same
manner as described above. The obtained channel conductances were used to cal
culate the Filling factor of the channels F (w

)

for non-electrolytes using Equation

1. The results are shown in Fig. 5.

69

Fig. 5. The dependence of F

cis

and

F

trans

, (obtained for VDAC-channels

in fully open state) on the hydrody

namic radii of PEGs

.

Vertical ar

rows indicate the radii values at criti

cal points of VDAC-channel. On BLM


background image

was fixed +10mV. The solution con

tained: 1.15 M KCl, 5 mM HEPES,

pH 7, 20% PEG. Each point is ob

tained by plotting histograms of the

distribution channel amplitudes

(n = 70-140) in the absence and pres

ence of polymers.

When the channel is filled from its

cis

side, adding smaller PEGs (at PEG hy

drodynamic radii of 0.94 to 0.8 nm) leads to a sharp increase in F. Hence, from the

cis

opening, the channel lumen appears to be a cylinder with a radius of ~ 0.9 to

1.0 nm. However, if this cylinder is the narrowest part of the VDAC channel, the
method used here cannot reveal the structural features of the channel behind this
constriction. A further decrease in

r,

up to 0.6 nm, leads to an additional small in

crease in F

cis

that continues to be much smaller than 1.

The

trans

filling experiments suggest that the

trans

side of VDAC lumen has

a funnel-like geometry. A small part of the channel is filled when the hydrody
namic radius of PEG is less than 1.92 nm. The decrease in

r

leads to a smooth in

crease in F

trans

which reaches ~ 0.2 for PEG1450 (

r

= 1.05 nm). A further decrease

in

r

leads to a sharp increase in F. As noted above, such behavior of the F - r de

pendence suggests that the

trans

opening of the channel lumen has a conic geome

try with radius of about 2.0 nm at the opening tapering to ~ 0.9 -1.0 nm (the size of
the

cis

side of VDAC lumen) somewhere inside the channel.

We then examined the apparent radius of each opening of the channel in low

conductance state in the presence of differently sized PEGs in the

cis

(g

с

cis

) or in

the

trans

(g

с

trans

) side of the channel. As for the fully open state, small PEGs con

siderably decreased the conductance of the „„closed‟‟ states of VDAC. Increasing
the hydrodynamic radius of PEG caused the VDAC conductance to increase until a
new steady-state value was reached at PEG1000 (r = 0.94 nm) for g

с

cis

and at

PEG2000 (r = 1.22 nm) for g

с

trans

. These results suggest that the

trans

opening of

the VDAC channel is wider than the

cis

opening at both the low and high conduct

ance states. However, in the low conductance state, the difference between the two
pore opening sizes is much smaller. The apparent value for the radius of VDAC

cis

opening in low conductance state, (~0,9 nm), obtained from F

с

cis

-r dependence

(open squares in Fig. 6), is almost similar to that determined for this opening in the
high conductance state (~1,0 nm, fig. 5). We conclude that the size of the

cis

opening of the Porin 31BM channel undergoes a weak (if any) alteration during the
transition between the two conductance states.

70

Fig. 6. The dependence of F

cis

and F

trans

, (obtained for


background image

VDAC-channels in low con

ductance state on the hydro

dynamic radii of PEGs.

Vertical arrows indicate the ra

dii values at critical points of

VDAC-channel. Each point is

obtained by plotting histograms

of the distribution channel am

plitudes (n = 90-200) in the ab

sence and presence-polymers.

The

trans

F

с

trans

-r relation for the closed state (filled squares in Fig. 6), how

ever, is

significantly different from that determined for the channel in the high
conductance state (see Fig. 5), especially for polymer molecules with large hydro
dynamic radii. When VDAC is in its low conductance state, molecules with r equal
to and larger than 1.22 nm (PEG2000) are not able to fill the channel. The relation
F

с

trans

-r is more complex than the F

с

cis

-r, and its decreasing part was fitted with two

straight lines. The maximum radius of the

trans

opening of Porin 31BM chan nel in

low conductance state was estimated to be ~1.2 nm. This value is considera

bly smaller than that for the channel in the high conductance state (~2.0 nm).
Hence, the transition between the high and low conductance states is mainly ac
companied by a change in the

trans

opening. In this state, the channel structure

looks more cylindrical than it appears to be in its high conductance state. To estab
lish the lengths of the cylindrical and funnel-like parts of VDAC channel in the
low conductance state, the results were analyzed as the results obtained for the
high conductance state. In this way, we found that the tentative lengths of the cy
lindrical and funnel-like parts are ~ 2.9 and ~1.7 nm, respectively. Cumulative re
sults demonstrate that the main geometrical change takes place at the

trans

part of

the channel during transition from high to low conductance state. Using our data
on the geometry of the Porin-31BMchannel and taking the length of the channel as
4.6 nm (Guo et al., 1995), the volume of the channel lu men can be calculated. We
found it to be ~23.3 and ~ 13.3 nm

3

for the high and the low conductance states,

respectively. Hence, the volume change during channel transition between these
two states is around 10 nm

3

.

From these data, the model depicted in Fig. 7 emerges as a geometrical repre

sentation of high and low conductance states of the Porin 31BM channel. In high

conductance state, the radius of the cylindrical part is about 1.0 nm and the length

is ~ 2.5 nm. The smaller radius of the conic portion is equal to the radius of the cy

lindrical part. The larger radius of the funnel (~ 2.0 nm) is observed at the

trans

opening of the channel. The length of this portion of the channel is estimated to be

2.1 nm. It appears that the channel transition to low conductance state is accompa

nied by a small decrease in the radius (from ~1.0 to ~ 0.9 nm) and an increase in

71


background image

the length (from ~ 2.5 to ~ 2.9 nm) of the cylindrical part of the channel at the ex

pense of the

trans

funnel-like part.

Fig. 7. An inside view on the

VDAC channel lumen at high

and low conductance states

.

L is

the channel length starting from

the cis entrance (0 nm) and end

ing at the trans entrance (4.6 nm).

Dashed line represents the central

axis of the lumen. Arrows and

numbers indicate apparent diam

eters of the channel openings in

high and low conductance states.

Dotted lines with arrows indicate

the starting point of the funnel

part of the channel in high and

low conductance states.

Differences in the biophysical properties between maxi-ion channel and

VDAC.

The main reason for considering the maxi-anion channel as plasmalemmally

expressed VDAC was that the two channels shared common biophysical proper
ties. However, the similarity is very superficial and more detailed inspection of
these properties under physiological conditions showed significant differences. For
this purpose, we carried out experiments with VDAC (isolated from rat liver mito
chondria) under conditions close to physiological. We reconstituted it into the
BLM and found that the conductivity of single channels in normal Ringer's solu
tion is approximately 530 pS. This value is about 30-70% higher than the conduc
tivity of single-maxi anion channels (300-400 pS) in the same medium (Sabirov
and Okada, 2009). At higher salt concentrations, the maxi-anion channel conduct
ance is known to saturate at 580–640 pS with K

m

of 77–120 mM (Hals et al., 1989;

Hurnak and Zachar, 1994; Schlichter et al., 1990). Meanwhile, we recorded the
single VDAC amplitude of 4100 pS in 1 M KCl, and it is well known that further
increase in salt concentration leads to a linear increase in VDAC conductance up to
the level of ~10 nS without any saturation (Colombini, 1986). Such an immense
difference in channel behavior suggests a principally different mechanism of ionic
transport in these two pores. This inference is supported by comparison of the ionic
selectivity of these two channels. In many cell types, the maxi-anion channel ex
hibits superb discrimination for anions over cations. Poor selectivity of VDAC for

glutamate over chloride (P

glutamate

/P

Cl

= 0.45 ± 0.03) compared to much better dis

crimination with P

glutamate

/P

Cl

~ 0.2 observed under the same experimental condi

tions for the maxi-anion channel confirms our conclusion on crucial differences in
the interior of the two channels.

Voltage-dependent gating is yet another important property which is common


background image

for the maxi-anion channel and VDAC. Both channels inactivated at positive and

72

negative voltages above app. ± 20 mV with time-constants of about 50-100 ms at

+50 mV and 300-400 ms at −50 mV. However, an important difference is the de
gree of inactivation. While the maxi-anion channel closes completely, VDAC al
ways retains a large portion (up to 40-50%) of its amplitude. The so-called
“closed” state has preferential selectivity for cations (Colombini et al., 1996;
Colombini, 2004).

The internal structure of these channels is also quite different. Thus, according

to our data (Fig. 7), VDAC channel has a radius of

cis

entrance 1 nm and

trans

en

trance 2 nm, while maxi-anion channel difference is much smaller: 1.16 nm and
1.42 nm radii

cis

and

trans

input respectively (Sabirov and Okada, 2004).

Based on the above considerations, we conclude that maxi-anion channel and

VDAC are unrelated proteins. However, this conclusion by no means rejects the
possibility of the plasmalemmal VDAC expression itself.

In the fourth chapter,

"The study ion-conductive properties and structure

of the nanopore by cysteine-scanning mutagenesis

", presents data obtained by

cysteine-scanning mutagenesis.

Ion channels are an ideal model system for the study of nanopores because

they self-assemble and their structures can be altered using molecular biological
techniques. For example, site-directed mutagenesis can be used to change the
number and location of fixed charges inside the channel and/or near the pore en
trances. The effects of such changes to the channel structure are generally reflected

in the ion selectivity and the shape of the G-V relationship (Noskov et al., 2004;
Jordan, 2005). To learn more about how charged amino acid side chains control the
properties of ion channels, we studied the conducting properties of the channel
formed by

α

-HL and genetically engineered mutants.

Our objective here was to determine the significance of the type and location

of fixed charges for the selectivity, conductance (

G

) and

G-V

dependence of the

α

-

HL channel. Because the primary sequence of wild-type

α

-HL has no cysteines,

we produced a number of point cysteine mutants and determined their effects on
the conducting properties of the α-HL channel. We subsequently chemically modi
fied these novel cysteine side chains with water-soluble sulfhydryl-specific rea

gents. Mutants containing cysteine were divided into two groups according to their
position in the

β

-cylinder stem region into even and odd.

In order to modify, in a controlled manner, the electrostatic channel profile,

we used reagents which react with sulfhydryl groups of cysteine and introduce a
positive or negative charge in its side chain. The reaction of these reagents with a
reduced cysteine side chain converts the –SH group to –SS-R, where R is the
charged moiety: -CH

2

CH

2

SO

3

–

(MTSES), -CH

2

CH

2

N(CH

3

)

3

+

(MTSET)

.

Addition of negative charges inside the channel region of the stem in the case of

odd amino acids increased the asymmetry, and the addition of positive charge re
duced the asymmetry. Furthermore, the impact of these new charges depended on
the position of a cysteine residue to be modified within the channel (Fig. 8). Mu


background image

tants with even numbers, except for G130C, were inaccessible to reagents in the
preformed channels. Effect of added charges on the cation-anion selectivity of

73

channels shown in Fig. 9. In these experiments, the preliminarily reconstituted in a
lipid membrane channels were subjected to the action of sulfhydryl reagents. The
effectiveness of the novel charges was dependent on their location along the
channel axis. Relatively weak effects were found for charges located close to the
channel opening. The effect of charges increased with distance, and, at a dis tance
of 1 nm to 1.5 nm from the

trans

opening,

V

rev

was maximal at ~ +21 mV

(MTSET) or at -24 mV (MTSES), with relative permeability relationship P

K

/P

Cl

~

0.001 and ~ 170, respectively. These values are close to the Nernst potentials (~
+22 mV and ~ -25 mV for Cl and K

+

, respectively). Note that the wild-type α-HL

channel was weakly anion-selective with V

rev

~ +7,6 mV and P

K

/P

Cl

~ 0.46. Thus,

the derivatized

α

-HL channels are highly selective for anions or cations depending

on the sign of the introduced charge. Charges located further in the pore interior
have a greater and stronger influence on selectivity.

Fig. 8. The effect of sulfhy

dryl reagents on the

α

-HL

cysteine mutant channel rec

tification.

The sequence of

mutants from left to right is

T129C, G130C, K131C,

D127C, G133C, L135C,

G137C, N121C, N139C,

S141C, and G143C. The dis

tance from the trans pore en

trance.

Fig. 9. Effects of sulfhydryl

reagents on the reversal poten

tial of channels formed by sin

gle cysteine

α

-HL mutants.

The membrane is bathed by 100

mM and 300 mM KCl aqueous

solution on the trans and cis

sides, respectively, and all so

lutions contained 30 mM Tris

HCl, pH 7.5. Mutant sequence

is the same as in Fig. 8.

The position of the novel charge affects

V

rev

and the asymmetry of

G-V

curves


background image

differently. After an initial increase,

V

rev

remains large and nearly constant (Fig. 9).

In contrast, the change in the asymmetry vanishes quickly with distance from the

trans

pore entrance (Fig. 8). The results suggest that the net (integrated) charge is

responsible for cation-anion selectivity of the

α

-HL channel whereas the balance

of charges between the openings is crucial for determining the

G-V

curves.

74

The new method of determining the stoichiometry of oligomeric nanopores.

For many years, α-HL channel has been considered to consist of six monomers, as
electron-microscopic studies mainly testified in favor of the hexamer structures
(Olofsson et al., 1988; Hebert et al., 1992). However, X-ray crystallography
studies in combination with chemical modification have shown that, most likely, α
HL channel is a heptamer (Gouaux et al., 1994). Data obtained with atomic force
microscopy have been somewhat contradictory, however. Thus, whereas the hep
tamer model was confirmed in one study (Fang et al., 1997), results from another
investigation (Czajkowsky et al., 1998) favored dominance of toxin hexamers in
lipid bilayers. Therefore, we attempted to develop a new method to determine the
stoichiometry of the ion channels under conditions as close to physiological as
possible. The grounds of this method are based on the experimental observation
that the interaction of sulfhydryl-specific reagent, DTNB, with cysteine mutant α
HL does not occur on the principle of "all or nothing", as observed for diphtheria
toxin (Mindell et al., 1994; Huynh et al., 1997), but rather happens in steps (Fig.
10) which reflect the sequential modification of the cysteine residues in a single
oligomeric channel molecules. Time intervals between the steps varied from chan
nel to channel, reflecting the stochastic nature of the process. The maximum num
ber of steps in the gradually decreasing channel conductivity observed under the
action of DTNB was equal to seven, and this was observed in 25% of the total
number of 38 modified channels.

Fig. 10. Change in

the conductivity of

the mutant channels

I7C, induced by

DTNB.

Action of

DTNB on a single

channel. The solutions

in both compartments

of the cell contained

100 mM KCl, 1 mM

EDTA and 30 mM

Tris-HCl, pH 7.5.

The number of steps observed in other cases ranged from four to six. The


background image

mean magnitude of the changes in conductance produced by the reagent was 6.5
±1.6 pS (mean of 149 events at -100 mV fixed). The steps are not expected to be
identical in each experiment because there are several ways in which subunits can
be permutated about the multiple-fold axis in heteromeric pores (Brahaet al.,
1997). However, the first and the last steps are between defined states and should
be more homogeneous. To test this prediction, the amplitudes of the individual
steps were analyzed consecutively for all channels in which seven downward steps

75

were observed. Indeed, there was a bell-shaped dependence of standard deviation
on the step sequence. In accordance with prediction, the maximal standard devia
tion was observed for the steps # 3-5, whereas steps 1 and 7 showed the smallest
deviations. Thus, the seven-step reduction of the conductivity of single channel in
our experimental system unequivocally identifies the

α

-HL channel as the hep

tamer

.

In the fifth chapter,

"The Effects of polyanions on the alpha-HL chan

nel",

described the effect of polyanions on the conductivity of α-HL channel.

Glycosaminoglycans, structurally heterogeneous polyanions (PAs), are known to
contribute to a wide range of physiological processes including recogni tion,
adhesion, membrane transport, anti- bacterial defense. They interact with
phosphatidylcholine in the presence of Ca

2+

(Vannucchi et al., 1985) and are impli

cated in ion channel and receptor regulation (Van et al., 2006; Suppiramaniam et
al., 2006). Moreover, there are reports indicating a size-dependent interaction of
PAs with ion channels and membranes (Chicoine et al., 2004). However, the de
tailed mechanism of PA influence on ion channel function is poorly understood. To
address this issue, we studied the effects of two types of differently sized PAs on
the ionic conductance of a mesoscopic ion channel formed by α-HL in planar lipid
bilayer membranes, and the dependence of their activities on the composition of
the medium.

When α-HL-modified membrane clamped at certain voltage, the current in

stantaneously increases as the increased voltage drives ions through the channels,
and then the current diminishes as the channels transited to lower conductance
states. If buffer (pH 7.5) does not contain neither heparin nor Ca

2+

, application of

100 mV-voltage pulses of either sign to the

cis

compartment failed to induce sig

nificant channel closure. Heparin alone added to solutions on both sides of the bi

layer had no detectable effect. Only when CaCl

2

was also added, there were note

worthy current relaxations observed in response to voltage pulses. Other divalent
cations were employed to examine the ionic specificity of heparin effect on volt
age-dependent gating of ST channels. When Mg

2+

and Zn

2+

were used (Fig. 11),

heparin exhibited effects that were qualitatively same as those seen in the presence
of Ca

2+

. The only difference observed was the efficiency with which different ions

facilitated the transition. The efficiency follows the sequence Zn

2+

> Ca

2+

> Mg

2+

,

identical to that observed for inhibition of the effects of ST on cells (Bashford et
al., 1986; Bashford et al., 1988).


background image

76

Fig. 11. Dependence of the

relaxation time of the conduc

tion (

τ

) on the concentration

of divalent cations.

Chlorides

of divalent cations were added

(at the concentrations indicated

on the horizontal axis) to both

compartments simultaneously.

The solution contained 100 mM

KCl, 6 mg/ml heparin and 10

mM Tris-HCl, pH 7.5, n=3-5.

To clarify the mechanism of PA effects on α-HL channels, experiments with

differently sized heparins and dextran sulfates (DS) were performed. All PAs used
demonstrated potent inhibitory activities against α-HL channel. In these experi
ments, we used a heparin-albumin (HepAlb, 4.8 heparin molecules linked to one
molecule of bovine serum albumin); heparins with average molecular weight
18000 g/mol (as Na-salts), (Hep); 6000 g/mol (Hep6000); 3000 g/mol (Hep3000);
heparin disaccharides of molecular weight of 563 g /mol (HepDi); DS with an av
erage molecular weight of 500,000 g/mol (DS500); 10000 g/mol (DS10); 5000 g /
mol (DS5). The ability of heparins to block the channel depended on the side of
the membrane to which they were added, and the effect increased with in creasing
their concentration and size (Fig. 12).


background image

Fig. 12. Influence of PA on α-HL

channel current relaxation time constant.

Relaxation time constants for the α-HL

channel blockage are plotted as a function of heparin’s concentration in the (A) cis
or (B) trans compartment of the chamber. Solid line, best-fit of a one-site-binding
equation, n=3-5.

The smallest heparin, HepDi, virtually had no effect on α-HL channel even at

a concentration of 2 mg/ml. Thus, despite the smaller diffusion coefficients, large
PA cause more effective and faster relaxation of currents. Heparins used in the pre
sent study could be ranked as follows (in order of effectiveness): HepAlb> Hep>
Hep6000> Hep3000 >> HepDi.

77

DS also caused the α-HL channel current decrease. The effectiveness of DS

species increases with their size: the IC

50

values were 220.0

±

30.0 mg/mL (DS5),

7.2

±

1.5 mg/mL (DS10), and 1.7

±

0.3 mg/mL (DS500). DS have a larger negative

charge density than the heparins, but they were significantly less effective against
the α- HL channel. The difference between PAs topologies most likely accounts
for this result.

PA appears to enter and occlude the α-HL channel. However, the question of

why the larger molecular weight PA is more effective at reducing the channel con
ductance (Fig. 12) remains unclear. It is known that phospholipids, including PC,
interact with PA (Sagrista et al., 2000; Huster et al., 1999). Binding PA with phos
pholipids does not occur in the absence of divalent cations. These cations form


background image

bridges between negatively charged phosphate groups of the phospholipids and the
sulfate groups on PA (Huster et al., 1999). Moreover, the data suggest that PA, and
heparins in particular, continue to possess a negative net charge even in 100 mM
Ca

2+

solution. Because heparins also require the presence of divalent cations in the

bulk to affect the channel, we considered the possibility that heparins bind to the
membrane, in agreement with the calcium-bridge mechanism suggested in (Huster
and Arnold, 1998; Huster et al., 1999).

Polyanion-binding to liposomes confers them a negative

ζ

-potential. To verify

whether the same is true for heparins and to quantify the binding of these PAs to
the membrane, we measured the

ζ

-potential of PC liposomes in the absence and

presence of differently sized heparins. We found that heparins decreased the PC
liposome

ζ

-potential from slightly positive value (in the absence of PA) up to ~–24

mV (Fig. 13A). The larger heparins were more effective. The dependence of
liposome

ζ

-potential (Fig. 13A) on heparin concentration resembles that for hepa

rin-induced

α-

HL channel current blockade (Fig. 12). There is a strong correlation

between the effectiveness of heparins (presented as the IC

50

) in these two systems

(Fig. 13B).

Fig. 13.

ζ

-Potential of liposomes in the

presence of growing concentrations of heparins (A) and the correlation between
equi-effective concentration of hep arins against liposomes and α-HL channels (B).

n=3-5.


background image

78

These results suggest that the binding of PA with the membrane might ac

count for the strong dependence of the channel blockade on PA molecular weight.
It appears that at the first step of PA-ion channel interaction, PA binds to mem
brane via Ca

2+

-bridges, resulting in higher local concentrations on and near the

membrane and thus around the α-HL pore entrance area. This proximity to the pore
entrance increases the probability that, at the right polarity, the pore ion flux would
be inhibited by the polyanion. The steady-state polyanion concentration decreases
nonlinearly (Peitzsch et al., 1995) with distance from the surface, down to their
bulk value. As a result, at the same bulk concentration, the effective steady-state
polyanion concentration should be much higher at the

trans

(which is closer to the

membrane surface) than

cis

(which is far from the membrane surface) entrance of

the channel. The latter clarifies how the difference in the distance between the
membrane surface and the entrances of the channel may determine the sidedness in
PA effectiveness. Unbound polymer can occasionally approach the channel en
trance by diffusion and then (at the second step of PA/ion channel interaction) en
ter the pore in a voltage-dependent manner and block it.

In the sixth chapter "

Investigation of elastic deformation α-HL channel"

presents data obtained with blocking α-HL channel charged crown / K

+

complex.

Geometrical features of the channel lumen in the fully open state are usually
assumed to be voltage-independent. Although this assumption generally works, it
is desirable to realize its limitations. Voltage-induced elastic deformations may
manifest themselves in the changes of the channel transport properties that are par
ticularly important in the case of molecules with a close fit to the channel pore di
mensions. It is clear that channels with a profound non-linearity of their current
voltage characteristics are likely candidates for the electrostriction effects, though
the non-linearity

per se

does not necessarily mean electrostriction. To approach this

problem, one needs a single ion channel with a well-known structure and
appropriate molecular tools. For this purpose, we chose the channel formed by
α-HL and a representative of a large family of crown ethers,
1,4,7,10,13,16-hexaoxacyclooctane (18-crown-6), as a tool to evaluate a possible
change in the α-HL pore because its molecular size (~1.15 nm in diameter) is very
close to the size of the narrowest part of the α-HL pore (diameter of ~1.2 nm). Fig.
14 shows that at 4 M KCl, for symmetric crown application, the major blockage is
observed when the applied voltage was close to –70 mV. Blocking ef fect was very
asymmetric. When the crown is present in the

trans

compartment only, the effect is

practically indistinguishable from symmetrical addition. In con trast, the presence
of the crown on the

cis

side was felt only slightly and only at high positive

potentials (data not shown). This behavior indicates that the blockage was due to
the charged crown/K

+

complexes, which easily reach the binding site from the

trans

side. The complex is driven onto the binding site by the applied po tential most of
which drops in the area of the channel stem.

Fig. 15 gives the voltage dependence of the probability that the binding site is


background image

not occupied by the crown for 4 M KCl solutions. The probability was calculated
as

p I i

n

=

1

−

Δ

/

Δ

, where

Δ

I

is the crown-induced change in the average current

79

through the channel and

Δ

i

is the reduction of the “instantaneous” current induced

by binding of a single crown molecule.

Fig. 14. Effect of symmet

rical (to both sides of the

membrane) addition of the

crown to 4 M KCl mem

brane-bathing solutions on

α-HL channel conductance

.

Result of typical experiment

with the same single channel

is presented

.

We applied the Woodhull model (Woodhull, 1973; Hille, 1992) in its gener

alized form (Tikhonov and Magazanik, 1998) to analyze the voltage dependence of
the crown block. Some of the main requirements for the validity of this approach
are that the blockage of the conductance by a reagent is not a result of cooperative
allosteric effects of changing protein conformation and that the blocking molecules
are independent from each other, except for their competition for the same binding
site. The data presented in (Bezrukov et al., 2004) and our own results suggest that
the data in Fig. 15 are in perfect agreement with these requirements.

Fig. 15. Probability that the

channel is “not blocked” by

the crown as a function of

applied voltage at three

crown concentrations.

Dashed lines are best fits by the

Woodhull model (in its gener

alized form) for a blocker car

rying a single elementary

charge, Eq. (2). Solid lines are

best fits of a modified model

that included the elastic defor

mation. n=3-5.

The restriction imposed by equilibrium thermodynamics on the rate constants

(

0

2

0 0


background image

0

1

k k k k

, where subscript

0

refers to zero applied voltage) is known as micro

1

2

=

− −

scopic reversibility and local equilibrium. Because of this restriction, in the case of

symmetrical application of a blocker carrying a single elementary charge, the
probability that channel is not blocked can be described as a function of dimen

sionless voltage

ψ =ϕ

e

/

kT

(

ϕ

– the transmembrane

potential,

e

– the elementary

charge,

k

– the Boltzmann constant,

T

– the absolute temperature):

80

0

( ) ( )

exp exp ( )

δ ψ δ δ δ ψ

+ +

−

A

m m t c

P

+ +

−

+ + +

−

=

(2)

0 0 0 0

(

δ δ δ ψ

) (

δ ψ

) (

δ δ δ ψ

)

B A B A

exp ( ) exp exp ( )

c t m m m t c

where

(

δψ

)

Cb

t

k

−

=

−

−

,

exp

(

(

δ δ

)

ψ

)

2

b

2

m c

k

1

=

1

exp

−

,

exp

(

(

δ δ

)

ψ

)

1

b

1

m t

exp

(

(

δ δ

)

ψ

)

2

Cb

2

c m

k

−

=

−

−

,

0

1

k

=

−

,

0

/

=

−

A k k

,

0

1

0

/

=

−

B Ck k

,

b

i

is voltage independent con

0

2

0

1

stant;

δ

c

,

δ

m

and

δ

t

are fractions of the membrane field which correspond to the lo

cation of the

Cis

barrier, energy minimum and the

Trans

barrier;

C

is the blocker

concentration, same on both sides of the channel.

Taking into consideration the inner channel geometry, data published by oth

ers (Howorka and Bayley, 2002) and our own estimation, the location of the

cis

barrier,

δ

c

,

was taken to be equal to 0.8. If the

Trans

barrier location (

δ

t

) was al

lowed to be free, it take unrealistic negative values. Therefore, we need to assume

δ

t

to be equal to zero by placing the barrier exactly at the

Trans

opening. As a re

sult, this function contains only three free parameters:

m

δ

, a fraction of transmem

brane potential that is assumed to be felt by the blocker molecule,

A

, and

B

.


background image

The best fit of Eq. (2) to the data in Fig. 15 is shown by dashed lines. It is seen that

the theoretical curves do not accurately describe the experimental points. Rel

atively large error bars at small and positive voltages do not jeopardize this conclu

sion. To obtain better agreement with the model, one has to accept one (or both) of

the two assumptions: (i) the charge of the crown/K

+

complex is larger than one; (ii)

the applied field introduces structural deformations of the pore interior thus

changing the crown-pore interactions in a way that is not accounted for by Eq. (2).

To choose between these two assumptions, we first note that it is firmly es tablished

that a 1:1 complex is formed between the crown and potassium ion (Rounaghi et

al, 1977), so that assuming one elementary charge per blocker mole cule is well

justified. Moreover, the data in Fig. 15 represent rather small crown

concentrations. Therefore, the first explanation can be safely ruled out. The second

possibility is to assume that the negative voltage reduces the barrier for the crown

exit to the

cis

side of the channel by increasing the size of the “geometric bottle

neck”. Indeed, if the radius of the constriction is exactly equal to or smaller than

the radius of the crown, the barrier is infinite and crown molecules can not cross

the channel. As the constriction radius is increased by negative voltages, the height

of the barrier quickly decreases thus allowing crowns to exit the channel from the

cis

side. In this modification of the model, parameter

B

is constant, but parameter

A

is now a function of voltage, increasing towards negative voltages. As one of the

possibilities to describe the depth and/or the barrier variation with the applied

voltage, we choose the energy of van der Waals interactions between the crown/K

+

complex and the pore wall. Then, we express the radius-dependent interaction

through the known constants of Lennard-Jones potential for hydrogen-hydrogen

pairs (Allen and Tildesley, 1989). Assuming realistic dependences of the con

striction radius on voltage that are qualitatively compatible with the channel con

ductance change, we arrive at a reasonable agreement between the model predic-

81

tion and experiment. Using this approach, we found that the only assumption about

the barrier variation allows to correlate the binding site with the narrowest part of
the channel pore (

δ

m

~0.7) and that a very small (~0.08 nm) field-induced elastic

change in the radius of this part of the channel is able to change the energy of
binding by a couple of

kT

‟s and to remove the discrepancies between the model

predictions and the experiment. The curves accounting for such changes in the
crown-pore interactions are shown in Fig. 15 as solid lines. In fact, the actual value
for the voltage-induced increase in the radius depends on the approximation that
one uses for van der Waals forces. For example, it was shown (Parsegian and
Weiss, 1974; Parsegian, 2005) that for “cylinder in a cylinder” or “sphere in a
sphere” geometryб the attractive term of the interaction can be expressed as the
inverse second power of the separation. Assuming this dependence, we can obtain
larger radius changes. So, our hypothesis on the role of electrostriction in the α-HL
transport properties allows us to explain the observations on voltage-dependence of
both the asymmetry of the residual conduction and blocking by the crown (Fig. 15)
in a unified manner. In both cases, the supposed elastic changes in the ion channel


background image

structure are gradual, continuous, and proportional to the applied force. This is
principally different from the well-known “gating” where the field-induced
conformational changes are discrete and frequently mentioned as “all or none”
processes. In our study, we assumed that the apparent change in the pore radius
under the applied electric field is the result of local electrostriction. We can suggest
a possible mechanistic model of the elastic deformation at the constriction zone of
α-HL channel where Lys147 could be displaced under voltage thus increasing the
channel diameter at this position and facilitating the crown exit when a negative
voltage is applied on the

cis

side or decreasing the channel diameter and make the

crown transport difficult when a positive sign of voltage is applied. Certainly, this
is only a mechanistic model. Nevertheless, these estimates show that the
electrostriction hypothesis put forward is plausible.

CONCLUSIONS

1. Using the modified method of polymer probing, it was shown for the first

time that:

a) the diameters of the two entrances of the α-HL channel are close to each

other and equal to 2.6-2.4 nm (

cis/trans

); the channel has two narrow portion: the

main constriction has a diameter of 1.3 nm and is located approximately in the
center of the channel, whereas the second one has a diameter of 1.8 nm and is lo
cated closer to the

cis

entrance of the pore;

b) the diameter of the

cis

entrance of VCC channel is 1.9 nm, and that of the

trans

entrance is 1,6 nm; there is a constriction inside the channel with a diameter

of 1.2 nm;

c) the diameters of the

cis

and

trans

entrance of VDAC ion channel in its

high-conductance state are 2.0 nm and 4.0 nm, respectively. Upon transition to the
low-conductance state, the diameters of both entrances decrease and become equal

82

References

Сабиров Р.З., Красильников О.В., Терновский В.И. Мерзляк П.Г. Влияние неэлектролитов на подвижность ионов в объеме водного раствора и в полости канала. Определение радиуса поры из электрических измерений.// Биологические мембраны. -1991. -Т.8, №.3 -С. 280-291. (№ 40, ResearchGate, IF - 0.094)

Sabirov, R. Z., Krasilnikov, О. V., Tcmovsky, V. L, and Merzliak, P. G. Relation between ionic channel conductance and conductivity of media containing different nonelectrolytes - a novel method of pore-size determination.// Gen. Physiol. Biophys. -1993. -V.12.-P. 95-111. (№ 40, ResearchGate, IF - 0.567)

Krasilnikov, О. V., Yuldasheva, L. N., Merzlyak, P. G., Capistrano, M. F. P., and Nogueira, R. A. The hinge portion of the S-aurcus alpha-toxin crosses the lipid bilayer and is part of the trans-mouth of the channel.// Biochim. Biophys. Acta.-1997.-V.1329.-P. 51-60. (№40, ResearchGate, IF-2,41)

Krasilnikov, О. V., Merzlyak, P. G., Yuldasheva, L. N., and Nogueira, R. A. Channel-sizing experiments in multichannel bilayers.// Gen. Physiol. Biophys. -1998.-V.17.-P. 349-363. (№ 40, ResearchGate, IF - 0.71)

Merzlyak, P. G., Yuldasheva, L. N., Rodrigues, C. G., Camciro, С. M. M., Krasilnikov, О. V., and Bezrukov, S. M. Polymeric nonelectrolytes to probe pore geometry: Application to the alpha-toxin transmembrane channel.// Biophys. J. -1999. -V.77.-P. 3023-3033. (№ 40, ResearchGate, IF -4,58)

Krasilnikov, О. V., Merzlyak, P. G., Yuldasheva, L. N., Rodrigues, C. G., and Nogueira, R. A. Heparin influence on alpha-staphylotoxin formed channel.// Biochim. Biophys. Acta. -1999. -V.1417.-P. 167-182. (№ 40, ResearchGate, IF - 2,59)

Krasilnikov, О. V., Mcrzlyak, P. G., Yuldasheva, L. N., Rodrigues, C. G., Bhakdi, S., and Valeva, A. Electrophysiological evidence for hcptameric stoichiometry of ion channels formed by Staphylococcus aureus alpha-toxin in planar lipid bilayers.// Mol. Microbiol. -2000. -V.37.-P. 1372-1378. (№ 40, ResearchGatc, IF -6.339)

Yuldasheva, L. N., Merzlyak, P. G., Zitzer, A. O., Rodrigues, C. G., Bhakdi, S., and Krasilnikov, О. V. Lumen geometry of ion channels formed by Vibrio cholcrac EL Tor cytolysin elucidated by nonelectrolyte exclusion.// Biochim. Biophys. Acta. -2001. -V.1512.-P. 53-63(№40, ResearchGate, IF -2.371)

Camciro, С. M. M., Mcrzlyak, P. G., Yuldasheva, L. N., Silva, L. G., Thinncs, F. P., and Krasilnikov, О. V. Probing the volume changes during voltage gating of Porin 31BM channel with nonelectrolyte polymers.// Biochim. Biophys. Acta. -2003. -V.1612.-P. 144-153. (№ 40, ResearchGatc, IF - 2.557)

Merzlyak, P. G., Capistrano, M. F., Valeva, A., Kasianowicz, J. J., and Krasilnikov, О. V. Conductance and ion selectivity of a mesoscopic protein nanoporc probed with cysteine scanning mutagenesis.// Biophys. J. -2005. -V.89.-P. 3059-3070. (№ 40, ResearchGate, IF -4.507)

Krasilnikov, О. V., Merzlyak, P. G., Yuldasheva, L. N., and Capistrano, M. F. Protein electrostriction: a possibility of clastic deformation of the alphahemolysin channel by the applied field.// Eur. Biophys. J. -2005. -V.34.-P. 997-1006. (№ 40, ResearchGate, IF -1.81)

Teixeira, L. R., Merzlyak, P. G., Valeva, A., and Krasilnikov, О. V. Interaction of heparins and dextran sulfates with a mesoscopic protein nanoporc.// Biophys. J. -2009. -V.97.-P. 2894-2903. (№ 40, ResearchGate, IF -4.39)

Sabirov, R. Z. and Merzlyak, P. G. Plasmalcmmal VDAC controversies and maxi-anion channel puzzle.// Biochim. Biophys. Acta. -2012. -V.1818.-P. 1570-1580. (№ 40, ResearchGate, IF - 3.848)

Sabirov R.Z., Merzlyak P.G., Islam M.R., Okada T., and Okada Y. The properties, functions, and pathophysiology of maxi-anion channels.// Pflugers Arch. -2016. -V.468, N 3. -P. 405-420. (№ 40, ResearchGate, IF -4.1)

Krasilnikov, О. V., Sabirov, R. Z., Tcmovsky, V. I., Mcrzliak, P. G., and Muratkhodjacv, J. N. A Simple method for the determination of the pore radius of ion channels in planar lipid bilayer-mcmbrancs.// FEMS Microbiol. Immunol. -1992. -V.105.-P. 93-100.

Krasilnikov, O.V., Merzlyak, P.G., Yuldasheva, L.N., Nogueira, R. A., Rodrigues, C.G. Protein induced ion Channels. Evidence of interaction in planar lipid bilayers.// Abstracts of the IV Simposio da Socicdadc Brasileira de Toxinologia, -Recife, 1996. - P.63.

Krasilnikov, O.V., Merzlyak, P.G., Yuldasheva, L.N., Nogueira, R. A. Properties of the high and low conductance states of Channels formed by S. Aureus alpha-toxin in lipid bilayer membranes.// Abstracts of the XI Reuniao Anual da FESBE, -Caxambu, 1996. -P.107.

Yuldasheva, L.N., Zitzer, A.O., Merzlyak, P.G., Krasilnikov, O.V., Nogueira, R. A., Bhakdi, S. Geometry of the aqueous pore of Channels formed by Vibrio Cholcrac cytolysin in planar lipid bilayers .// Abstracts of the XII Reuniao Anual da FESBE, -Caxambu, 1997. - P.298.

Merzlyak, P.G., Krasilnikov, O.V., Nogueira, R. A. Heparin influence on voltage gating of alpha-staphylotoxin induced channel .// Abstracts of the XIII Reuniao Anual da FESBE, -Caxambu, 1998. -P.318.

Merzlyak, P.G., Krasilnikov, O.V., Rodrigues, C.G., Barbosa, С. T., Valeva, A., Bhakdi, S. Secondary structure of the stem domain of the ST-channcl revealed by scanning cysteine mutagenesis.// Abstracts of the XIV Reuniao Anual da FESBE, -Caxambu, -1999. P.222.

Marques, E. J., Yuldasheva, L.N., Merzlyak, P.G., Krasilnikov, O.V. Heparin influence on mitochondrial channel, VDAC.// Abstracts of the VII Simposio Regional de Biofisica e II Encontro Nacional de Biociencias Nuclears, -Recife, 1999.-P.31.

Merzlyak, P.G., Krasilnikov, O.V., Yuldasheva, L.N., Rodrigues, C.G., Nogueira, R. A. Divalent cation dependent effects on voltage gating of alphastaphylotoxin channel in lipid bilayers.// Forty-third Annual Meeting of Biophysical Society, Baltimore, 1999. -Biophys. J., -V.76. -P.A442.

Merzlyak, P.G., Krasilnikov, O.V., Rodrigues, C.G., Valeva, A., Bhakdi, S. Electrophysiology in the estimation of the subunit stoichiometry of oligomeric ion Channels in their native environment. An ion Channel formed by Staphyloccus Aureus alpha-toxin in planar lipid bilayers.// Abstracts of the Mini-Symposium: Cellular and Molecular Physiology of Ion Channels and Transporters, -Tashkent, 1999.- P. 18-19.

Krasilnikov, O.V., Merzlyak, P.G., Yuldasheva, L.N., Rodrigues, C.G., Valeva, A., Bhakdi, S. Employment of electrophysiological monitoring of single Channel function and cysteine-substitution mutant to accurate determination of the subunit stoichiometry of the oligomer Channel in situ.// 4th International Workshop on Pore-Forming Toxin, -Trento, 2000, -Med. Microbiol. Immunol., -V.189. -P.39.

Yuldasheva, L.N., Merzlyak, P.G., Zitzer, A.O., Rodrigues, C.G., Krasilnikov, O.V. Cup-shaped lumen geometry of ion Channels formed by Vibrio Cholcrac cytolysin.// 4th International Workshop on Pore-Forming Toxin, -Trento, 2000. -Med. Microb. Immunol., -V. 189. -P.53.

Mcrzlyak, P.G., Yuldasheva, L.N., Rodrigues, C.G., Valcva, A., Bhakdi, S., Krasilnikov, O.V. Electrophysiological evidence of hcptamcric organization of ion Channel formed by Staphyloccus Aureus alpha-toxin in planar lipid bilayers.// 44th Annual Meeting Biophysical Society, -New Orleans, 2000, -Biophys. J.-V.78.-P.474A.

Mcrzlyak, P.G., Yuldasheva, L.N., Rodrigues, C.G., Valcva, A., Bhakdi, S., Krasilnikov, O.V. Dependence of selectivity and current-voltage relationship on the localization of the intruded charges along the longitudinal axis of the ST-channel.// IV Congresso de Biofisica do Cone-Sul, -Campinas, 2000. -P.47.

Maria F.P. Capistrano, Mcrzlyak, P.G., Yuldasheva, L.N., Krasilnikov, O.V. The mechanism of Crown ethers influence on ion Channels.// Abstracts of the XVII Reuniao Anual da FESBE, -Salvador, 2002. - Abstract № 28.046.

Cameiro, C.M.M., Mcrzlyak, P.G., Yuldasheva, L.N., Silva, L.G., Rodrigues, C.G., Thinnes, F.P., Krasilnikov, O.V. VDAC lumen geometry in two conductance state.// Abstracts of the XVII Reuniao Anual da FESBE, -Salvador, 2002. - Abstract № 28.048.

Luciana Teixeira, Mcrzlyak, P.G., Krasilnikov, O.V. Structural requirements of polyanions responsible for change in kinetic behavior of ion Channel in Planar Lipid Bilayers.// Abstracts of the XVII Reuniao Anual de FESBE, Curitiba, 2003.- Abstract № 20.030.

Krasilnikov, O.V., Bezrukov, S. M., Merzlyak, P.G., Yuldasheva, L.N., Maria F.P. Capistrano. Elasticity of ion Channel in fully open state.// Abstracts of the XVII Reuniao Anual de FESBE, Curitiba, 2003.- Abstract № 20.031

Krasilnikov, O.V., Merzlyak, P.G., Yuldasheva, L.N., Rodrigues, C.G., Bezrukov, S.M. Interaction of 18crown6 with aqueous pore of staphylococcal Alpha-Hemolysin.// 48th Annual Meeting, -Baltimore, 2004. -Biophys. J. -V.86.-P.338a.

Krasilnikov, O.V., Merzlyak, P.G., Yuldasheva, L.N., Maria F.P. Capistrano Does the electric field evoke an elastic deformation of ion channel being in high conductance state? Experimental approach.// Materials of 5th Workshop on Pore-Forming Toxins, -Mainz, 2004. -P.42.

Merzlyak, P.G., Capistrano, M. F., Valcva, A., Krasilnikov, O.V. The Channel properties in light of the cysteine scanning mutagenesis. Alphahemolysin Channel in planar bilayers.// Abstracts of the XX Reuniao Anual da FESBE, -Aguas Lindoia, 2005. -P.194.

Teixera L.R., Cordeiro M.N., Merzlyak P.G., Krasilnikov O.V. Influencia da constituiQao lipidica da membrana sobre о funcionamento dos canais ionicos formados por a-hemolisina.// II Reuniao Regional da FESBE, -Recife, 2007. -Anais do II Reuniao Regional da FESBE. - Abstract № 06.003.

Мерзляк П.Г., Тойчиев A.X., Окада Я. Очистка и реконструкция макси-анионного канала из культуры клеток рака молочной железы С127.// Современные проблемы физиологии и биофизики: Тез. докл. Респ. науч, конф. 24-25 октября 2007 - Ташкент, 2007. - С. 79.

Мерзляк П.Г., Красильников О.В. Зависимость эффективности действия природных гепаринов на ионные каналы от их структуры и молекулярной массы.// Актуальные проблемы химии природных соединений: Тез. конф. 18-19 марта 2009. - Ташкент, 2009. - С. 53.

Merzlyak Р., Okada Y. and Sabirov R.Z. Maxi-anion channel activity in membrane blebs and after reconstitution in artificial membranes.// The 87th Annual Meeting of the PSJ, - Marioka, 2010. - J. Physiol. Sei. -V.60 (SuppL) -S123.

inLibrary — is a scientific electronic library built on the paradigm of open science (Open Science), the main tasks of which are the popularization of science and scientific activities, public quality control of scientific publications, the development of interdisciplinary research, a modern institute of scientific review, increasing the citation of Uzbek science and building a knowledge infrastructure.

CONTACTS:

Republic of Uzbekistan, Tashkent, Parkent street 51, floor 2

(+998) 99-006-61-10

info@inscience.uz

NAVIGATION:

Journals
Conferences
Organizations
Authors
Blog
Contact
© Copyright 2025 in Science All Rights Reserved | Developed by in Science | Site create by in Designer