Биология ва тиббиёт муаммолари, 2016, №4 (91) 141
УДК: 617.138-318/79:534
ФУЛЛЕРЕНЫ С
60
УСИЛИВАЮТ ТОКСИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ ТОЛУОЛА НА ИММУННЫЙ
СТАТУС ОРГАНИЗМА
Л.М. ПАЛИЦА, М.М. КОРДА
Тернопольский Государственный медицинский университет им. И.Я. Горбачевского,
Украина, г. Тернополь
ОРГАНИЗМ ИММУН ҲОЛАТИГА ФУЛЛЕРЕН С
60
ВА ТОЛУОЛНИНГ ТОКСИК ТАЪСИРИ
Л.М. ПАЛИЦА, М.М. КОРДА
И.Я. Горбачевский номидаги Тернополь Давлат медицина университети, Украина, Тернополь
FULLERENES C
60
ENHANCE THE TOLUENE TOXICITY ON THE IMMUNE STATUS OF
ORGANISM
L.M. PALYTSIA, M.M. KORDA
I.Ya. Horbachevsky Ternopil State Medical University
Охирги ўн йилда нанотехнологияларнинг шиддат билан ривожланиб бориши ҳисобига кимёвий
воситалар билан организмга наноқисмларнинг токсикологик хусусиятларини фундаментал тушиниш
кераклиги муҳим аҳамиятга эга. Ушбу тадқиқотдан мақсад тажрибада фуллерен С
60
ва толуол
кимёвий токсикантини иммун тизим гуморал занжири ва цитокинларда ўзгариш чақиришини
текшириш. Толуол интраперитонеал юборилган каламушлар қон зардобида G синфидаги
иммуноглобулинлар, циркуляциядаги иммун комплекслар, TNF-α, IL-1β, IL-6 яллиғланишга қарши
цитокинлар миқдорининг ошиши ва IL-4, IL-10 яллиғланишга қарши цитокинлар миқдорининг
камайганлиги аниқланди. Гуморал звено кўрсаткичларининг ўзгаришлари ва яллиғланишга қарши ва
қарши бўлмаган цитокинлар ўртасидаги дисбаланс толуолни фуллерен билан юборилган ҳайвонларда
яққол ривожланган бўлди. Демак, фуллерен С
60
карбонли наноқисмлар толуолнинг кимёвий
токсиклигини гуморал иммунитет ва цитокинларга оширади.
Калит сўзлар:
фуллеренлар, толуол, иммуноглобулинлар, цитокинлар.
Due to the rapid development of nanotechnology in the last decade, it is now an urgent need to under-
stand the toxicological properties of nanoparticles ingested together with chemicals. The aim of this study was
to investigate the ability of fullerenes C60 and chemical toxicant toluene to cause changes in the state of hu-
moral immune system and cytokine profile. A significant increase in the concentration of immunoglobulin G,
circulating immune complexes, pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β, IL-6 as well as a decrease in anti-
inflammatory IL-4 and IL-10 in the serum of rats which were injected intraperitoneally with toluene were
found. Changes in humoral immunity and imbalance between pro- and anti-inflammatory cytokines were signif-
icantly more pronounced in animals treated with toluene together with fullerenes.
It has been concluded that
that carbon nanoparticles fullerenes C60 potentiate toxic effects of chemical toxicant toluene on the humoral
immunity and cytokine profile.
Key words:
fullerenes, toluene, immunoglobulins, cytokines.
Актуальность.
Развитие нанотехнологий
способствует появлению новых ультравысоко-
дисперсных форм веществ (наноматериалов),
многие свойства которых, в том числе действие
на живые системы, отличаются от свойств соеди-
нений макроскопических размеров [1]. Среди раз-
нообразных видов продукции наноиндустрии
особое место занимают фуллерены, представля-
ющие собой новую аллотропическую форму уг-
лерода [2]. Сравнительная простота производства
фуллеренов, возможность их получения в высо-
коочищенной (99% чистоты и выше) форме дела-
ет их одним из наиболее популярных современ-
ных нанопродуктов. Однако, это приводит к по-
степенному превращению фуллеренов в значимые
для окружающей среды контаминанты, а также к
постоянному возрастанию рисков экспозиции че-
ловека этими наночастицами [3, 4]. Более того,
предыдущие иссследования показали, что для на-
ночастиц и, в частности, для фуллеренов харак-
терна способность проникать через биологиче-
ские мембраны и физиологические барьеры орга-
низма и служить «проводниками» в организм тя-
желых металлов, пестицидов, соединений галоге-
нов и тому подобное. Поэтому возникает вопрос о
необходимости фундаментального понимания
токсикологических свойств наночастиц при их
попадании в организм вместе с «классическими»
химическими токсикантами.
Целью данной работы было исследование
особенностей влияния комбинации фуллеренов
С
60
с известным химическим токсикантом толуо-
лом на состояние гуморального иммунитета и ци-
токинового профиля белых крыс.
Материалы и методы.
Эксперименты вы-
полнены на 104 крысах-самцах массой 150-180 г.
Всех животных разделили на 4 группы: 1-я кон-
троль (интактные крысы). Этой группе животных
интраперитонеально вводили физиологический
раствор в дозе 0,5 мл/кг; 2-я – животные, которым
Фуллерены С
60
усиливают токсический эффект толуола на иммунный статус организма
142 Проблемы биологии и медицины, 2016, №4 (91)
интраперитонеально вводили 0,5 мл/кг суспензии
фуллеренов С
60
в дозе
60 мг/кг; 3-я – животные,
которые получали интраперитонеально толуол в
дозе 0,5 мл/кг; 4-я – животные, которым вводили
фуллерены (60 мг/кг), разведенные в толуоле (0,5
мл/кг). Животных выводили из эксперимента под
тиопенталовым наркозом через 3, 6, 24 и 72 часа
от начала эксперимента. Для исследований ис-
пользовали сыворотку крови. Все эксперименты
проводились в соответствии с правилами «Евро-
пейской конвенции по защите позвоночных жи-
вотных, используемых в экспериментальных и
других научных целях».
Определение количества иммуноглобули-
нов классов А, М и G и циркулирующих иммун-
ных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови прово-
дили согласно методикам [5, 6].
Определения уровня цитокинов TNF-α, IL-
1β, IL-6, IL-4, IL-10 в сыворотке крови крыс про-
водили методом иммуноферментного анализа
(ИФА) с использованием коммерческих наборов
"Bioscience" производства "Bender MedSystems
GmbH", Австрия. Абсорбцию проб измеряли на
аппарате “StatFax 303 Plus” в соответствии с про-
токолом производителя.
Статистическую обработку результатов вы-
полняли в отделе системных статистических ис-
следований Тернопольского государственного
медицинского университета имени И. Я. Горба-
чевского в программном пакете Statsoft
STATISTICA. Результаты выражали как среднее ±
SEM с 8 экспериментов. Сравнивали полученные
величины с использованием непараметричного
критерия Манна-Уитни. Изменения считали ста-
тистически достоверными при р<0,05.
Результаты исследования и обсуждение.
Введение животным 60 мг/кг фуллеренов С
60
не
вызывало изменений со стороны гуморальной си-
стемы иммунитета и уровня цитокинов в сыво-
ротке крови во все сроки эксперимента (таблица
1).
Как видно из результатов исследований,
приведенных в таблице 2, при интоксикации то-
луолом гуморальное звено иммунной системы
испытывало определенные изменения. В частно-
сти, через 3 часа после введения токсиканта кон-
центрация Ig G в сыворотке крови увеличивалась
в 1,8 раза по сравнению с интактными животны-
ми. Еще в большей степени (в 1,9 раза) этот пока-
затель поднялся через 6 часов после начала экспе-
римента. Через 24 и 72 часа после интоксикации
уровень Ig G в сыворотке крови несколько
уменьшался и составлял соответственно 163 и 144
% от уровня контроля.
Что касается других иммунологических по-
казателей (Ig A и Ig М), то они, при введении жи-
вотным толуола, достоверно не отличались от
аналогичных показателей интактных крыс во все
сроки исследования.
Поскольку именно Ig G являются основным
представителем антител, повышение их содержа-
ния при химической интоксикации, вероятно, яв-
ляется следствием активации эффекторного звена
иммунной системы в ответ на воспалительные
или деструктивные изменения тканей организма
[7]. Известно, что при интоксикации толуолом
происходит перекисная деградация макромолекул
белковой природы и усиление протеолитических
процессов в клетках, что создает предпосылки для
возникновения аутоиммунных реакций и появле-
ния противоорганных антител. Активации ауто-
иммунных реакций будут способствовать и нару-
шения со стороны функционального состояния
микросомальной монооксигеназной системы, ко-
торые неизбежно развиваются при воздействии
химических веществ на печень.
Таблица 1.
Влияние фуллерена С
60
на показатели гуморального иммунитета и на уровень цитокинов в сыворотке
крови крыс (М±m, n=8)
Показатель
Группы животных
Интактные
Толуол
Время после введения (ч)
3
6
24
72
Ig A, г/л
0,17±0,02
0,18±0,04
0,19±0,03
0,20±0,02
0,15±0,03
Ig М, г/л
0,79±0,06
0,84±0,07
0,81±0,06
0,78±0,05
0,74±0,05
Ig G, г/л
10,18±1,03
18,50±1,32*
19,84±1,46*
16,65±1,18*
14,71±1,25*
ЦИК, ум.од.
59,07±3,75
94,72±5,80*
89,67±5,06*
124,04±6,03*
82,69±4,90*
TNF-α, пг/мл
6,08±0,59
15,28±1,22*
25,53±1,80*
21,28±1,34*
18,30±1,02*
IL-1β, пг/мл
7,44±1,07
37,95±2,44*
31,29±1,86*
29,76±1,50*
24,18±1,20*
IL -4, пг/мл
17,76±2,30
13,25±1,62*
10,66±1,02*
11,84±1,34*
15,22±2,20
IL-6, пг/мл
5,25±0,37
8,76±0,54*
16,80±1,23*
8,13±0,72*
6,98±0,35*
IL-10, пг/мл
13,87±1,20
9,20±0,90*
7,70±0,68*
5,82±1,02*
6,93±1,50*
Примечание. * - изменения достоверны по сравнению с показателями интактных животных (p<0,05).
Л.М. Палица, М.М. Корда
Биология ва тиббиёт муаммолари, 2016, №4 (91) 143
Таблица 2.
Влияние толуола на показатели гуморального иммунитета и на уровень цитокинов в сыворотке крови
крыс (М±m, n=8)
Показатель
Группы животных
Интактные
С
60
Время после введения (ч)
3
6
24
72
Ig A, г/л
0,17±0,02
0,14±0,03
0,16±0,03
0,19±0,02
0,15±0,04
Ig М, г/л
0,79±0,06
0,76±0,05
0,82±0,06
0,75±0,05
0,73±0,06
Ig G, г/л
10,18±1,03
9,78±1,12
10,08±1,09
10,21±1,18
9,37±1,02
ЦИК, ум.од.
59,07±3,75
56,73±3,99
58,33±3,57
61,67±4,05
60,18±3,82
TNF-α, пг/мл
6,08±0,59
6,68±0,40
7,02±0,61
7,15±0,68
45,01±5,94
IL-1β, пг/мл
7,44±1,07
8,09±1,20
7,90±0,78
8,40±0,95
9,03±0,87
IL -4, пг/мл
17,76±2,30
14,70±2,59
15,84±2,10
13,76±1,92
13,90±2,40
IL-6, пг/мл
5,25±0,37
5,70±0,46
5,69±0,30
6,08±0,43
5,99±0,39
IL-10, пг/мл
13,87±1,20
14,70±2,49
15,84±2,10
13,76±1,92
13,90±2,33
В норме данная система способна транс-
формировать эндогенные продукты с антигенны-
ми свойствами. Подавление монооксигеназной
системы приведет к длительной персистенции
сенсибилизирующих агентов в организме. Оче-
видно, что вышеназванные причины и обуслови-
ли зарегистрировано нами достоверное повыше-
ние в сыворотке крыс, которым вводили толуол,
содержания иммуноглобулинов класса G. В поль-
зу такого предположения свидетельствует и за-
фиксированное нами увеличение концентрации
циркулирующих иммунных комплексов в сыво-
ротке крови животных, которым вводили толуол.
Так, через 3 часа после начала эксперимента со-
держание ЦИК в сыворотке крыс составило 159%
от уровня интактных животных, через 6 часов –
152%, через 24 часа – 210% и через 72 часа –
140% (табл. 2). Известно, что перед тем как эли-
минировать из организма, ЦИК оказывают опре-
деленное патогенное влияние на ткани.
Интересно, что в отличиии от животных 3-й
группы, при введении крысам толуола вместе с
наночастицами фуллеренов С
60
в сыворотке крови
достоверно увеличивался уровень Ig A и Ig М че-
рез 6 и 24 часа. Уровень иммуноглобулинов клас-
са G при комбинированном воздействии химиче-
ского токсиканта и наночастиц повышался в
большей степени по сравнению с группой крыс,
которым вводили толуол отдельно. Более того, в
сыворотке крови животных IV группы содержа-
ние Ig G было достоверно выше (в 1,3 раза) тако-
вого у животных III группы через 3 и 6 часов от
начала эксперимента.
Содержание циркулирующих иммунных
комплексов в сыворотке крови животных, кото-
рым вводили толуол и фуллерены, также повы-
шалось во все сроки эксперимента в большей сте-
пени по сравнению с аналогичным показателем у
крыс, которым вводили только толуол (табл. 3).
О том, что фуллерены усугубляют эффект
химического токсиканта свидетельствует тот
факт, что концентрация ЦИК при комбинирован-
ной интоксикации через 6 и 24 часа после начала
эксперимента была в 1,4 раза выше (P<0,05), чем
при поражении самим толуолом.
Токсическое поражение тканей приводит к
формированию медиаторов воспаления, основ-
ными из которых являются цитокины. Как видно
из результатов, приведенных в таблице 2, в сыво-
ротке крови животных, которым вводили толуол,
концентрация TNF-α, участвующего в системном
воспалении и являющегося членом группы цито-
кинов, которые стимулируют реакцию острой фа-
зы, резко повышалась во все сроки эксперимента,
достигая максимума (в 4,1 раза) через 6 часов от
момента интоксикации. В этой же группе живот-
ных содержание других провоспалительных ци-
токинов (IL-1β и IL-6) также существенно возрас-
тало по сравнению с контролем, при этом уровень
IL-1β достигал максимума (в 5,1 раза) уже через 3
часа от начала эксперимента, а IL-6 – через 6 ча-
сов (в 3,2 раза). Концентрация противовоспали-
тельных цитокинов при действии толуола, наобо-
рот, снижалась по сравнению с контролем. Так,
уровень IL-4 достиг своего минимума (в 1,6 раза)
через 6 часов, а IL-10 через 24 часа (в 2,3 раза) от
момента интоксикации.
У крыс, которым вводили толуол вместе с
карбоновыми наночастицами, уровень провоспа-
лительных цитокинов повышался в значительно
большей степени по сравнению с контролем, чем
у животных, которые подвергались воздействию
только химического токсиканта (табл. 3). Более
того, содержание TNF-α, IL-1β и IL-6 во все сроки
эксперимента в сыворотке животных 4-й группы
было достоверно выше, чем в 3-й группе крыс.
Концентрация противовоспалительных IL-4 и IL-
10, наоборот, понижалась в сыворотке крови жи-
Фуллерены С
60
усиливают токсический эффект толуола на иммунный статус организма
144 Проблемы биологии и медицины, 2016, №4 (91)
вотных, подвергшихся комбинированному воз-
действию чужеродных веществ, в большей степе-
ни, чем у крыс, которым вводили только толуол.
Таблица 3.
Влияние комбинированного применения С
60
и толуола на показатели гуморального иммунитета и на
уровень цитокинов в сыворотке крови крыс (М±m, n=8)
Показатель
Группы животных
Интактные
Толуол + С
60
Время после введения (ч)
3
6
24
72
Ig A, г/л
0,17±0,02
0,24±0,05
0,27±0,02*
0,25±0,01*
0,21±0,03
Ig М, г/л
0,79±0,06
0,86±0,07
1,12±0,09*
0,98±0,06*
0,85±0,05
Ig G, г/л
10,18±1,03
24,33±1,70*
#
25,99±1,55*
#
23,37±1,90*
19,52±1,73*
ЦИК, ум.од.
59,07±3,75
96,50±6,21*
121,68±7,24*
#
177,21±7,44*
#
135,86±6,46*
TNF-α, пг/мл
6,08±0,59
21,45±1,38*
#
34,35±2,03*
#
29,80±1,85*
#
26,16±1,30*
#
IL-1β, пг/мл
7,44±1,07
48,36±2,32*
#
44,64±2,10*
#
40,93±1,78*
#
32,75±2,08*
#
IL -4, пг/мл
17,76±2,30
9,65±1,28*
#
5,92±1,10*
#
6,20±1,08*
#
9,85±2,06*
IL-6, пг/мл
5,25±0,37
12,08±0,94*
#
22,11±1,26*
#
14,19±0,80*
#
9,97±1,05*
IL-10, пг/мл
13,87±1,20
6,09±0,54*
#
4,91±0,62*
#
4,07±0,90*
4,62±1,30*
Примечание. * - изменения достоверны по сравнению с показателями интактных животных;
#
- изме-
нения достоверны по сравнению с группой животных, которым вводили толуол (p<0,05).
Таким образом, можна констатировать, что
при попадании в организм химического токсикан-
та толуола имеют место нарушения гуморального
иммунитета и возникает дисбаланс между про- и
противовоспалительными цитокинами. При вве-
дении толуола вместе с карбоновыми наночасти-
цами фуллеренами С
60
изменения иммунного ста-
туса проявляются у достоверно большей степени,
чем при введении только химического токсикан-
та. Касательно механизма таких изменений, то,
вероятно, что в ответ на воспалительные и де-
структивные изменения в тканях, вызванных то-
луолом, активируется эффекторное звено иммун-
ной системы и усиливается продукция провоспа-
лительных цитокинов [8].
Вполне вероятно, что толуол вызывает
угнетение микросомальной монооксигеназной
системы, что способствует персистенции сенси-
билизирующих антигенов в организме. Возмож-
но, имеет также значение ингибирование под вли-
янием токсина функциональной активности Т-
лимфоцитов, особенно Т-супрессоров и, как след-
ствие, увеличение соотношения Т-хелпери/Т-
супрессори [9].
Такой сдвиг клеточного иммунитета в сто-
рону угнетения супрессорного звена приводит к
интенсификации выработки аутоантител на ауто-
антигены, которые в повышенном количестве
освобождаются в кровь в результате деструкции
тканей. Определенную роль в повышении уровня
иммуноглобулинов и иммунных комплексов при
интоксикации может играть также изменение их
катаболизма. Нарушение выведения ЦИК с орга-
низма способствует их длительной циркуляции в
кровяном русле, что создает условия для их по-
вреждающего действия на ткани.
Потенцирующий токсичный эффект фулле-
ренов наиболее вероятно обусловлен способно-
стью последних абсорбировать на своей поверх-
ности большое количество токсинов и способ-
ствовать их транспорту к тканям и клеткам живых
организмов. Возможно также, что фуллерены
непосредственно проходят через мембраны в
клетки и взаимодействуют с ДНК, РНК и другими
биополимерами, что приводит к изменениям экс-
прессии генов, транскрипции и трансляции белка.
В результате возможны изменения ряда фермент-
ных систем, в том числе ферментов метаболизма
ксенобиотиков, что приводит к аккумуляции
большого количества химических токсикантов и
продуктов их метаболизма, то есть имеет место
так называемая токсификация ксенобиотиков хи-
мической природы.
Выводы.
Карбоновые наночастицы фулле-
рены С
60
потенциируют токсическое воздействие
химического токсиканта толуола на гуморальный
иммунитет и цитокиновый профиль. Для безопас-
ного использования нанотехнлогий необходимы
дальнейшие биохимические и иммунологические
исследования, направленные на изучение меха-
низмов синергического влияния наноматериалов
и ксенобиотиков химической природы на орга-
низм.
Л.М. Палица, М.М. Корда
Биология ва тиббиёт муаммолари, 2016, №4 (91) 145
Литература:
1.
Онищенко Г.Г., Тутельян В.А. О концепции
токсикологических исследований, методологиио-
ценки риска, методов идентификации и количе-
ственного определения наноматериалов // Вопро-
сыпитания. – 2007. – Т.76, № 6. – С.4–8
2.
Пиотровский Л.Б., Киселёв О.И. Фуллерены в
биологии // СПб: ООО Издательство «Росток». –
2006. – 336 с.
3.
Andrievsky G., Klochkov V., Derevyanchenko L.
Is C60 fullerenemoleculetoxic? // Fullerenes, Nano-
tubes, CarbonNanostruct. – 2005. – V.13. – P.363–
376.
4.
Хотимченко С.А., Гмошинский И.В., Тутельян
В.А. Проблема обеспечения безопасности нано-
размерных объектов для здоровья человека // Ги-
гиена и санитария. – 2009. – № 5. – С.7–11.
5.
Чернушенко Е.Ф., Когосова Л.С. Иммунологи-
ческие методы исследования в клинике. - К.: Здо-
ров’я, 1978. - 159 с.
6.
Гриневич Ю.А. Определение иммунных ком-
плексов в крови онкологических больных/Ю.А.
Гриневич, А.М. Алферов//Лабораторное дело. —
1981. — № 8. — С. 493—495.
7.
Яхонтова О.И., Дуданова О.П. Роль иммунных
комплексов при хронических заболеваниях пече-
ни и их динамика в процессе лечения // Тер. ар-
хив. - 1992. - № 2. - С. 10 - 15.
8.
Ешану В.С. Цитокины и их биологические эф-
фекты при некоторых болезнях печени // Клини-
ческие перспективы гастроэнтерологии, гепатоло-
гии. – 2004. – № 5. – С. 11-16.
9.
Klein A., Pappas S.C., Gordon P. The effect of
nonviral liver damage on the T-lymphocyte help-
er/suppressor ratio // Clin. Immunol. and
Immunopathol. - 1998. - 46, № 2. - P. 214-220.
ФУЛЛЕРЕНЫ С
60
УСИЛИВАЮТ
ТОКСИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ ТОЛУОЛА НА
ИММУННЫЙ СТАТУС ОРГАНИЗМА
Л.М. ПАЛИЦА, М.М. КОРДА
Тернопольский Государственный медицинский
университет им. И.Я. Горбачевского, Украина, г.
Тернополь
В связи с бурным развитием в последние де-
сятилетия нанотехнологий, сейчас остро стоит
вопрос о необходимости фундаментального по-
нимания токсикологических свойств наночастиц
при их попадании в организм вместе с химиче-
скими веществами. Целью настоящей работы
было исследовать в эксперименте способность
фуллеренов С
60
и химического токсиканта толуо-
ла вызывать изменения состояния гуморальной
цепи иммунной системы и цитокинового профи-
ля. В сыворотке крови крыс, которым интрапе-
ритонеально вводили толуол, установлено зна-
чительное увеличение концентрации иммуногло-
булинов класса G, циркулирующих иммунных ком-
плексов, провоспалительных цитокинов TNF-α,
IL-1β, IL-6 и снижение уровня противовоспали-
тельных IL-4 и IL-10. Изменения показателей гу-
морального звена иммунитета и дисбаланс меж-
ду про- и противовоспалительными цитокинами
были значительно более выраженными у живот-
ных которым вводили толуоле вместе с фуллере-
нами. Сделан вывод, что карбоновые наночасти-
цы фуллерены С
60
потенциируют токсическое
воздействие химического токсиканта толуола на
гуморальный иммунитет и цитокиновый про-
филь.
Ключевые слова:
фуллерены, толуол, имму-
ноглобулины, цитокины.
