Цкстнш^лрака,
ЗОД 5W-
1, Сммрх^кд
' !•?
УДК: 618.15-022-616.34-097-036.22-616.9
СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ОЦЕНКИ БИОЛОГИИ ГЕНИТАЛЬНЫХ
ЛАКТОБАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ У ЖЕНЩИН ФЕРТИЛЬНОГО ВОЗРАСТА
Ташкентская медицинская академия
Проблема
инфекционных
заболеваний
и
дисбиоза влагалища приобретает в наши дни всё
большую значимость, что связано с действием
различных неблагоприятных факторов, влияющих
как на иммунный статус в целом, так и на
микробиоценозы человеческого организма [5,7,3].
Установлено, что патологические сдвиги в
вагинальном микробиоценозе происходят при
лечении антибиотиками, гормонами, цитостатиками,
рентгенотерапии
и
возникают
на
фоне
эндокринопатий. анемии, при врождённых пороках
развития
половых
органов,
использовании
контрацептивов [1].
Микробы - симбионты в организме человека
представлены сотнями видов с общим количеством
10
12
-10
14
клеток и формируют относительно
стабильную
структуру
микробного
пейзажа.
Нормальная
микрофлора,
как
совокупность
микробиоценозов разных областей организма, играет
важную роль и включает представителей облигатной
(индигенной), факультативной' и транзигорной
флоры. Инди- генная микрофлора принимает участие
в регулировании оптимального уровня метаболиче-
ских процессов организма хозяина, создании
высокой
колонизационной
резистентности
к
патогенным
и
условно-патогенным
микроор-
ганизмам [2,4,9].
У здоровых женщин фертильного возраста
доминирующими бактериями влагалищной среды
являются Lactobacillus spp (95-98%). Меньшую долю
составляют
бифидобактерии
[4,8,10]
Среди
транзиторных микроорганизмов влагалища чаще
других удаётся выделить коагулазоотрицательные
стафиллококи, в первую очередь St. epidermidis,
кроме того, Corynebac- terium spp., Bacteroides -
Prevotclla spp. и My- coplazma hominis, которые
обычно присутствуют в умеренном количестве.
Столь же часто, но в меньшем количестве
встречаются Micro- ccocus spp., Propionibacterium spp.
Сравнительно редко обнаруживают Clostridium spp.,
Actinomyces spp, Gardnerella vaginalis, Candida spp и
др. [6].
Видовое разнообразие вагинальной микрофлоры
велико, и возможные сочетания микроорганизмов
очень многочисленны, поэтому, в целях изучения
чистоты влагалища необходима разработка методик
микробиологических
и
иммунологических
исследоваиий.
Для проведения микробиологических на-
следований по определению количественна: о и
качественного состава выделений из влагалища и
цервикального канала. Забор материала проводится
стерильной ложкой Фолькмана, из полученного
материала готовится ряд серийных разведений. В
последствие
из
соответствующих
разведений
производится
посев
на
высокоселективные
дифференциально-диагностические
питательные
среды (табл. 1).
Таблица 1
Микробиологические методы исследования
№
Питательные среды
Условия культивирования
Выделено
1
Агар для бифидобактерий «Блаурок- ко»
Анаэроб
Бифидобактерии
2
МРС-4
Анаэроб
Лактобактерии
3
Кровяной агар
Аэроб
Общее количество аэробов,
стрептококки
4
Желточно-солевой агар, агар для
стафиликокков
Аэроб
Стафилококки
5
Среда Эндо
Аэроб
Энтеробактерии, эшерихии
6
Среда Сабуро
Аэроб
Г рибы
7
Эскулиновый агар
Аэроб
Стрептококки гр D
8
Агар для вагиналис
Аэроб
Гарднерелла
Учёт результатов посева проводится путём подсчёта
количества
выросших
колоний
каждого
вида.
Идентификацию выделенных микроорганизмов до рода
и вида проводят на основании морфологических,
тинкториальных, культуральных и биологических
свойств, в соответствии с определителем микроорганиз-
мов Берги (15)97). Количество бактерий каждого вида
выражают в lg M±m КОЕ\мл.
Способность микроорганизмов прикрепляться к
эпителиальным клеткам генитального тракта, то
есть:адгезивный процесс чаще всего изучают по методу
ВфЕ.Брилиса (1984). Где объектом адгезии служат
эритроциты крови человека 1-ой группы. В качестве тест
микробов используют штаммы St. aureus, St. haemoli-
ticus, E.coli, C.albicans и др. Готовится исходная взвесь
тест культур в концентрации 10
9
, а взвесь эритроцитов в
концентрации 10
s
. В пробирки объединяют по 0,5 мл
взвесей и инкубируют в течение 30 минут на
Назирова М.Б.
(Вестнш^врача, 2011, № 1, Самарканд
встряхивателе при температуре 37°С. После чего готовят
мазок и смотрят под световым микроскопом, оп-
ределяют признак адгезивности микроорганизмов.
Существенные различия считаются при > 20%
адгезированных микробов.
Активность лизоцима в вагинальном отделяемом в
настоящее время определяется при помощи способа,
предложенного Алиевым Ш.Р. (1994), который включал
использование стерильных бумажных дисков. Эти диски
(схожие с антибиотиковыми дисками) берут пинцетом и
тщательно пропитывающих в выделениях из влагалища.
Затем их укладывают на поверхность питательного агара
(агар Диф- ко) в чашках Петри, засеянных газоном
суточной культурой М. luteus (штамм 003596М26,
национальная коллекция микроорганизмов инфекций
человека НИИЭМИЗ М3 РУз), посевы инкубируются в
термостате при температуре 37°С, активность лизоцима
определяется по методу диффузии в агаре.
Антагонистическую активность лактобацилл в
отношении условно патогенных бактерий чаще изучают
по методу отсроченного антагонизма (А.Ю. Лихачёва,
1992). С этой целью 2-х суточную культуру
лактобацилл, выращенную на среде МРС-4 засевают
совместно с 0,1 мл односуточной тест - культурой. Об
антагонистической активности судят по зоне отсутствия
роста тест штаммов, выдержанных 24 часа при
температуре 37°С.
Антагонистическая активность лактобактерий в
отношении ряда патогенных и условно патогенных
микроорганизмов связана с их высоким биологическим
потенциалом; лиганд- рецепторным взаимодействием с
эпителиальными клетками; конкуренцией за источник
питания, путём изменения pH, а также секрецией
лизоцима, перекиси водорода и бакте- риоцинов.
Фагоцитарная активность определяется по методу
Темурбаева (1984), в модификации А.В. Антонова
(1996). Для этого отобранный материал очищают,
промывают забуферным раствором и центрифугируют
при 1000 об\мин, надосадочную жидкость сливают, а к
осадку добавляют 0,5 мл физиологического раствора. К
0,2 мл полученной смеси,, в пробирке прибавляют 0,1 мл
взвеси частиц латекса диаметром 0,8 мкм. Смесь
инкубируется во влажной камере 30 мин при 37
с
С
постоянно встряхивается. В последующем из этой смеси
готовятся мазки по типу мазка крови, окрашиваются по
Романовскому-Гимзе.
Подсчитываются
под
микроскопом не менее 100 нейтрофилов с Латексом и
без него в каждом препарате и onjbe-
;
деляется
показатель уровня фагоцитоза.
Определение
секреторного
иммуноглобулина
класса A (slgA) основан на методе Мап- chini (1984),
который заключается в измерении диаметра кольца
преципитации, образующего при внесении исследуемой
сыворотки в лунки, вырезанные в слое агара, в
котором'предварительно
диспергированная
моноспецифичёская антисыворотка. В стандартных
условиях опыта диаметр кольца преципитации прямо
пропорционален
концентрации
иммуноглобулина.
Содержание
иммуноглобулина
определяли
относительно стандартной сыворотке человека с
известной концентрацией иммуноглобулинов.
Для оценки состояния микрофлоры влагалища чаще
всего используют Amsel test, именуемый в литературе
«золотым
диагностическим
стандартом»,
предложенный Amsel. В. В 1983 г., и включает в себя
следующие простые,, диагностические тесты:
1.
Характер выделений.
2.
Наличие
«ключевых
клеток»
в мазках,
окрашенных по Грамму.
3.
Положительный аминный тест с 10% КОН.
4.Определение pH отделяемого.
Эти тесты могут быть выполнены в кабинете
лечащего врача.
1.
Выделения у женщин с бактериальным вагинозом
(БВ) пенистые, обильные, с неприятным запахом,
тягучие, равномерно распределяются по стенкам
влагалища. Количество выделений примерно
составляет 20 мл в сутки, тогда как в норме не более
2 мл.
2.
Значение pH вагинального выделяемого при БВ
превышает нормативные показатели (> 4,5), что
определяется элиминацией лактофлоры или резким
снижением её содержания. Чувствительность и
специфичность теста относительно высока (89 и
95% соответственно).
<Вестниқврача, 2011, № 1, Самарканд
3.
Появление неприятного запаха обусловлено выработкой
диаминов (путресцин, кадаверин, триметиламин) в
процессе реакции декарбоксилирования аминокислот
облигатными анаэробами. Соли этих соединений
превращаются в летучие амины при Щелочном значении
pH.
Чувствительность
и
специфичность
этого
диагностического теста 79 и 97% соответственно. Для
постановки аминного теста в равных количествах
смешивают выделения из влагалища и 10% раствор
гидроокиси калия.
4.
Наиболее
информативным
лабораторным
методом
диагностики БВ является обнаружение в мазках,
окрашенных
по
Грамму,
ключевых
клеток
с
адгезированными
на
,,
них
микроорганизмами,
ассоциированны-
Литература
1.
Анкирская.А.С. Инфекция и антимикробная терапия - 1999. - № 3. - с. 89-91.
2.
Бондаренко В.М.,Воробьёв А.А. Дизбиозы и препараты с пробиотической функцией. Журнал микробиол. 2004, 1:84 -92.
3.
Бондаренко В.М, Рубакова Э.И, Лаврова В,А. Иммуностимулирующее действие лактобактерий, используемых в качестве препаратов
пробиотиков. Журнал микробиол. 1998,5: 107 -1 12.
4.
Бр'илис В.И., Брилене Т.А., Ланцнер Х.П., Ланцнер А.А. - Открытия, 1984, №8
5.
Забилова Т.М. Биологические свойства лактобацилл биотопов человека в норме и при дисбиозах. Дисс. канд.мез.наук. Оренбург, 2001.
6.
Ланцнер А.А., Ланцнер Х.П., Тоом М.А. Особенности лактобацилл микрофлоры человека продуцировать лизоцим. «Журнал
микробиологии». 1987, 8: 77-81.
7.
Лихачёва А.Ю., Поспелова В.В. Биологическая характеристика некоторых лактобацилл. Медицинские аспекты микробной экологии. М.,
1992.
8.
Муравьёва В.В. Лабораторная диагностика урогенитальных инфекций. «Акушер, и гинек»., 1987, №2 стр.61. Определитель бактерий
Берги. Дж. Хоулт и др. изд № 9. М., 1997.
9.
Сгибнёв А.В. Регуляция активности бактериальной каталазы в межмикробиых взаимодействиях. Автореф. дисс. канд. биол. наук.
Оренбург, 2002.
ми с БВ. Чувствительность и специфичность
данного метода близка к 100%.
По-видимому, между организмом и инди- генной
микрофлорой
влагалища,
ведущими
представителями которой являются бактерии
рода Lactobacillus, складывается сложная система
взаимоотношений. В связи с этим изучение
механизмов их действия требует более глубокого
подхода.
Вышеперечисленные
микробиологические
и
иммунологические
методы на данный момент являются наиболее
современными, практичными, специфичными и
высоко
чувствительными,
а
полученные
результаты могут быть использованы в клиниче-
ской практике микробиологов.
