Биология ва тиббиёт муаммолари, 2015, №4.1 (85) 133
УДК
:
611.839: 611.77-08
МОРФОЛОГИЯ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА КРИОФРАКТОГРАФИЧЕСКИМ И ЭЛЕКТРОННО-
МИКРОСКОПИЧЕСКИМ МЕТОДАМИ
Ш.О. КОРЖАВОВ, Ж.К. АСЛАМОВ, С.И. ХОТАМОВ
Самаркандский Государственный медицинский институт, Республика Узбекистан, г. Самарканд
КРИОФРАКТОГРАФИЧЕК ВА ЭЛЕКТРОННОМИКРОСКОПИК УСУЛЛАР ЁРДАМИДА ОДАМ
ТЕРИСИНИНГ МОРФОЛОГИЯСИ
Ш.О. КОРЖАВОВ, Ж.К. АСЛАМОВ, С.И. ХОТАМОВ
Самарқанд Давлат медицина институти, Ўзбекистон Республикаси, Самарқанд
MORPHOLOGY OF SKIN AND HUMAN KRIOFRAKTOGRAFICHESKIM ELECTRON METHODS
Sh.O. KORZHAVOV, J. ASLAMOV, S.I. KHOTAMOV
Samarkand State Medical Institute, Republic of Uzbekistan, Samarkand
Sublimatsion metod yordamida olingan odam qorin sohasi terisining ultra ingichka kesimlar, elektronmikroskop
ostida o’rganildi. Transmembranali oqsillar, xuddi - 7 mm diametr o’lchamdagi membrane bo’lakchalari ko’rinishida
membranalarning yuzasi bo’ldi.
Ultrathin slices from the human abdominal skin and platinum – carbonic replicas, obtained by means of the
freeze – fracture method have been studied electron microscopically. Transmembranous proteins are revealed on the
membrane surface as membranebinded particles with the diameter 5 – 7 mm.
Актуальность.
Барьерные функции эпидерми-
са, в основном, обусловлены мембранными структу-
рами клеток и их взаимоотношением при помощи
специфических соединений – десмосом, которые, по
мнению некоторых исследователей(Цветкова Г.М.,
1993), кроме механической выполняют функции пе-
редачи сигналов между клетками эпидермиса. Фик-
сация, дегидратация, пропитывание смолой и окраска
вносят химико – морфологические изменения в стро-
ение изучаемой ткани. Новую информацию о строе-
нии клеток, особенно их мембранных компонентов,
дает исследование реплик, полученных после глубо-
кого и быстрого охлаждения ткани до ультранизких
температур.
Цель настоящей работы
– сравнительный
анализ мембранных компонентов и межклеточных
контактов кератиноцитов эпидермиса человека мето-
дами электронной микроскопии ультратонких срезов
и реплик, полученных при замораживании – травле-
нии.
Материал и методика.
Методом реплик изу-
чена кожа живота взрослых людей, погибших в ре-
зультате травмы, с посмертным периодом до 24 ч.
Это же материал заливали в смолу и исследовали в
просвечивающем электронном микроскопе. Образцы
кожи погружали для криопротекции в изотонический
раствор 20% и 30% глицерина на 1 ч при температуре
4
0
С, быстро замораживали во фреоне – 22, охла-
жденном жидким азотом (-145
0
С), или в тающем
твердом азоте (-210
0
С). Затем в жидком азоте (-196
0
С) их монтировали на золотые столики и переносили
в высоковакуумную установку BAF– 400 для получе-
ния сколов. Последние делали металлическим ножом
при температуре держателя – 105
0
С и давлении 5 х
10
-6
mbar. После этого в течении 5 минут проводили
травление образца при температуре (-105
0
С) для
сублимации льда с плоскости скола. Полученную
поверхность напыляли платиной и углеродом под
углом 45
0
и 90
0
. Образцы извлекали из установки и
при комнатной температуре реплики отделяли от
ткани гипохлоридом натрия и промывали в дистил-
лированной воде. Очищенные реплики монтировали
на сетки и просматривали в микроскопе FhilipsEM-
420 с гониометром при ускоряющем напряжении 80 –
100 кВ. При замораживании – скалывании обнажают-
ся не только мембраны клеток и органелл, но и про-
исходит расщепление мембран по их не полярной
области (Aumailley M., Rousselle P. 1999). В результа-
те образуются две комплементарные (добавочные)
поверхности мембран. Таким образом, этот метод
позволяет изучать 4 поверхности мембраны. По об-
щепринятой номенклатуре (BrantonD., BullivantS.,
GilulaN.B. etal. 2010) эти поверхности имеют следу-
ющие обозначения: ES – экзоплазматическая поверх-
ность мембраны, PS – протопалзматическая поверх-
ность мембраны, EF–дополнительная поверхность
скола протоплазматической мембраны. Кроме того,
органеллы могут раскалываться поперек, обнажая
при этом внутреннее строение.
Результаты
исследования
и
их
обсуждение.
ES поверхность мембраны клеток эпи-
дермиса гладкая, а сами клетки имеют округлую
форму с множеством коротких выростов неправиль-
ной формы с плоской площадкой на их вершине. По-
следняя содержит множество микровыростов диамет-
ром 5 – 7 нм. По – видимому, этими площадками со-
седние клетки контактируют друг с другом. Микро-
выросты, вероятно, представляют собой остатки во-
локон неясной природы (BrennerS., PolitiY. 1995),
которые соединяют десмосомальные пластинки со-
седних клеток. На поперечных сколах эпидермиса
клетки плотно прилежат друг к другу, разделены из-
вилистым межклеточным пространством шириной 18
– 23 мм. На комплементарной (PF) поверхности кле-
точной мембраны выявляется незначительное коли-
чество мембраносвязанных частиц(МСЧ) диаметром
5 – 7 нм. Десмосомы представлены площадками не-
правильной формы, заполненными на PF – поверхно-
Морфология кожи человека криофрактографическим и электронномикроскопическим…
134 Проблемы биологии и медицины, 2015, №4.1 (85)
сти плотно расположенными структурами, по форме
и размеру напоминающими МСЧ. В некоторых слу-
чаях можно отчетливо проследить агрегацию тоно-
фибрилл в пучки в области десмосом. В основной
своей массе они равномерно распределяются по всей
клетке, а в отличие от типичной картины на элек-
тронной микрофотографиях, где они образуют слож-
ную сеть тонофибриллярных пучков. Иногда десмо-
сома представлена в виде плоского диска, вставлен-
ного как бы между внешними мембранами соседних
клеток. В цитоплазме, наряду с тонофибриллами, вы-
является множество округлых образований различно-
го размера. В основном это митохондрии, меланосо-
мы и различные вакуоли. Цистерны эндоплазматиче-
ской сети и комплекса Гольджи в кератиноцитах эпи-
дермиса обнаруживаются редко. Митохондрии, как
правило, представлены выпуклыми или вогнутыми
структурами. При этом на вогнутой PF – поверхности
обнаруживается незначительное количество мем-
браносвязанных частиц, а на выпуклой EF – поверх-
ности количество этих частиц несколько больше. Ме-
ланосомы обычно вытянутой овальной формы и их
поверхность довольно ровная. Вакуоли имеют глад-
кую поверхность и различные размеры. Как правило,
у органелл редко представлены поперечно сколотые
поверхности.
Ядра кератиноцитов эпидермиса скалываются
произвольно, нуклеоплазма на криофрактограммах
представлена в виде мелкозернистого вещества, рав-
номерно заполняющего ядро. Ядерная оболочка хо-
рошо выявляется, и в ней различаются различные
поверхности, образующиеся при скалывании образ-
ца. Наружная поверхность внутренней ядерной мем-
браны довольно гладкая, с небольшим количеством
мембраносвязанных частиц диаметром 5 – 7 нм. До-
полнительная поверхность (PF) содержит значитель-
ное количество равномерно расположенных МСЧ,
придающих ей шероховатый вид. При этом, как и на
электронных микрофотографиях, на репликах отчет-
ливо выявляются мембраны ядерной оболочки и за-
ключенное между ними перинуклеарное простран-
ство шириной 15 – 20 нм. На поверхности ядра обна-
руживаются округлые структуры диаметром 80 – 100
нм, расположенные произвольно. Эти образования
соответствуют ядерным порам.
По периферии поры выявляются округлые об-
разования диаметром 15 – 20 нм, выступающие над
оболочкой. Обычно их 8, в центре поры глобула не
всегда обнаруживается. Идентичные структуры вы-
являются и на электронных микрофотографиях, если
срез проходитчерез ядро тангенциально.
Базальная мембрана, зона дермо – эпидермаль-
ного сплетения и дерма являются довольно сложным
участком кожи для анализа и интерпретации крио-
фрактограмм. Базальная мембрана, которая отчетливо
видна на ультратонких срезах, на репликах обычно не
определяется. В этой зоне кожи на репликах удается
идентифицировать базальные кератиноциты и их
внешнюю мембрану, а также нижележащие коллаге-
новые фибриллы, которые не всегда хорошо выявля-
ются. Последние плотно прилежат друг к другу, их
толщина 50 – 60 нм, а между собой они связаны мик-
рофибриллами диаметром 8 – 10 нм. Помимо попе-
речной исчерченности, на криофрактограммах колла-
геновых фибрилл хорошо прослеживается их спи-
ральная структура, сформированная микрофибрилла-
ми диаметром 8 – 10 нм. Между фибриллами распо-
лагаются вакуоли и фрагменты соединительноткан-
ных клеток. Основное вещество дермы на репликах
имеет ямки и бугорки неправильной формы и различ-
ной величины. Эластика представлена обширными
полями с гомогенной структурой.
Таким образом, полученные данные, коррели-
рующие с ранее опубликованными (Алексеев А.Г.,
Банин В.В. и Ноздрин В.И., 2010; AumailleyM., Rous-
selleP. 1999). Наличие МСЧ на протоплазматической
поверхности мембраны и их малое количество на эк-
зоплазматической свидетельствует о том, что инте-
гральные или трансмембранные белки более прочно
связаны с внутренней поверхностью внешней мем-
браны клетки. По – видимому, незначительное коли-
чество МСЧ на E – поверхности обусловлено пери-
ферическими белками, не полностью погруженными
в бислой липидов (Chen J.D., Zhang K. Et al., 1993).
Хотя некоторые (LinM.S., MascaroJ.M.Jr., LiuZ. etal.,
1997) исследователи полагают, что мембранные бел-
ки, несущие иммунные, гормональные, ферментатив-
ные и транспортные функции, имеют сродство к
наружной поверхности внешней мембраны клетки.На
ультратонких срезах десмосомы удается изучать в
основном поперечных срезах, где они имеют лямел-
лярное строение.
Изучая криофрактограммы, можно предполо-
жить, что МСЧ, выявляемые на поверхностях десмо-
сом, соответствуют трансмембранным или адсорби-
рованным гликопротеидам, присутствие которых в
этой области клеточной мембраны показано многими
авторами (NordlundJ.J. andBoissyE., 2001; Виноградо-
ва Е.В., 2005), а некоторые (Калантаевская К.А. 2002)
полагают, что межклеточное пространство между
соседними десмосомами пронизано волокнами поли-
сахаридной природы.
На криофрактограммах и электронных микро-
фотографиях выявляется различное пространственное
расположение тонофибриллярного каркаса кератино-
цитов. Не исключено, что это объясняется различны-
ми методами подготовки материала. Вполне вероят-
но, что предварительная фиксация, основанная на
химической сшивке белковых молекул, приводит к
искаженной картине распределения тонофибрилл в
клетке.
При изучении ядерного аппарата клеток мето-
дом замораживания - скалывания можно более де-
тально исследовать ядерную оболочку и пронизыва-
ющие её поры. Глобулярные структуры по периферии
ядерных пор можно наблюдать на электронных мик-
рофотографиях, если срез проходит тангенциально.
По мнению ряда авторов (AlbertsB., JohnsonA.,
LewisJ.
etal.?
2002;
AgacheP.Q.,
MonneurC.,
LevequeJ.L., DeRigalJ.; 2008), они являются макромо-
лекулами из свернутых молекулярных цепей и, по
всей видимости, идентичны интегральным белкам
ядерной оболочки, но выполняют более специфиче-
ские функции.
Ш.О. Коржавов, Ж.К. Асламов, С.И. Хотамов
Биология ва тиббиёт муаммолари, 2015, №4.1 (85) 135
Литература:
1.
Алексеев А.Г., Банин В.В. и Ноздрин В.И. Мела-
ноциты кожи. // Морфология, 2009, Том 136, № 5, С –
81 – 89
2.
Виноградова Е.В. Структурные основы прочности
и растяжимости кожи человека по данным световой и
растровой электронной микроскопии. // В кн.: Биоме-
ханика. Профилактика, патогенез и лечение травм и
ортопедических деформаций. Труды Рижского
НИИТО. Рига, 2005, вып. 13, С. 169 – 174.
3.
Калантаевская К.А. Морфология и физиология
кожи человека. // Киев, Здоровье, 2002.
4.
Цветкова Г.М. Морфология нормальной кожи че-
ловека. // В кн.: Патология кожи. М., Медицина, 1993,
С – 5 – 115.
5.
Agache P.Q., Monneur C., Leveque J.L., De Rigal J.
Mechanical properties and Young’s modulus of human
skin in vivo. // Arch Dermatology Res, 2008, v. 269, p.
221 – 232.
6.
Alberts B., Johnson A., Lewis J. et al. Molecular biol-
ogy of the cell. // 4 th – ed., N.Y. Garland Science, 2002.
7.
Aumailley M., Rousselle P. Laminins of the dermal –
epidermal junction. // Matrix Biol. 1999, Vol 18, P – 19
– 28.
8.
BrantonD.,BullivantS., GilulaN.B. etal. Freeze – etch-
ingnomenclature. Science, 2010, v. 190, p. 54-55
9.
Brenner S., Politi Y. Dermatologic diseases and prob-
lems of women throughout the life cycle. // Int. J. Derma-
tology, 1995, v. 34, p. 369 – 379.
10.
Chen J.D., Zhang K. Et al. Epidermal growth factor
(EGT) promotes human keratinocyte locomotion on
collagen by increasing the alpha-2 integrin subunit. //
Exp. Cell. Res., 1993, v. 209 № 2, p. 216 – 223.
11.
Lin M.S., MascaroJ.M.Jr., Liu Z. et al. The desmo-
some and hemidesmosome in cutaneous autoimmunity. //
ClinExp Immunology, 1997, v. 137, p. 9 – 15.
12.
Nordlund J. J. and Boissy E. Biology of melanocytes.
In: The biology of skin. // Pearl River, N.Y., Parthenon
Publishing, 2001, p. 113 – 131.
МОРФОЛОГИЯ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА
КРИОФРАКТОГРАФИЧЕСКИМ И
ЭЛЕКТРОННОМИКРОСКОПИЧЕСКИМ
МЕТОДАМИ
Ш.О. КОРЖАВОВ, Ж.К. АСЛАМОВ, С.И.
ХОТАМОВ
Самаркандский Государственный медицинский ин-
ститут, Республика Узбекистан, г. Самарканд
Ультратонкие срезы от человека кожи живота
и платины - угольной реплики, полученные с помо-
щью сублимационной - методом гидроразрыва были
изучены под микроскопом электрона. Трансмембран-
ного белка выявлены на поверхности мембраны, как
мембранных частиц с диаметром 5 - 7 мм.
Ключевые слова:
эпидермис, кожа, крио-
фрактограмма.
