Влияние клеточных препаратов пуповинной крови на морфологию кожи крыс

148 2017, №4 (97) Проблемы биологии и медицины

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

УДК: 615.361:612.689;632.118.7:57.085.2

ВЛИЯНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ПРЕПАРАТОВ ПУПОВИННОЙ КРОВИ НА МОРФОЛОГИЮ КОЖИ

КРЫС

Ш.О. КОРЖАВОВ, Э.У. ХУСАНОВ, М.М. ЮСУПОВ, Н.А. МУХАММАДОВ, О.Т. ШОДМОНОВ

Самаркандский государственный медицинский институт, Республика Узбекистан, г. Самарканд

КАЛАМУШ ТЕРИСИ МОРФОЛОГИЯСИГА КИНДИК ҚОНИ ҲУЖАЙРАЛАРИ

ПРЕПАРАТЛАРИНИНГ ТАЪСИРИ

Ш.О. КОРЖАВОВ, Э.У. ХУСАНОВ, М.М. ЮСУПОВ, Н.А. МУХАММАДОВ, О.Т. ШОДМОНОВ

Самарқанд давлат медицина институти, Ўзбекистон Республикаси, Самарқанд

INFLUENCE OF CELLULAR PREPARATIONS OF CORD BLOOD ON MORPHOLOGY OF SKIN

OF RATS

SH.O. KORZHAVOV, E.U. KHUSANOV, M.M. YUSUPOV, N.A. MUKHAMMADOV,

O.T. SHODMONOV

Samarkand State Medical Institute, Republic of Uzbekistan, Samarkand

Бизнинг илмий ишимизда ҳар хил босқичларда in vitro шароитида тери морфологиясига киндик

қони таркибидаги эмбрионал ҳужайраларнинг таъсир характери ҳамда ушбу қон таркибидаги устунли

ҳужайраларнинг in vivo шароитидаги экспериентал гипотиреоздаги терининг морфофункционал

ҳолатига таъсири ҳам ўрганилган. Киндик қони таркибидаги устун ҳужайраларининг терига, дермага

терапевтик мақсадларда қўлланилиши бу ҳозирги кунда – ижобий натижа берувчи усул сифатида

тушунтирилади.

Калит сўзлар:

киндик қони, тери, каламуш, эпидермис.

In work studied character of the influence of the cryopreserved nucleated cells of cord blood on the skin

morphology was investigated on the different stages of skin cultivation in vitro and character of the influence

stem cells of cord blood on morphofunctinal condition of a derma in conditions of an experimental hypothy-

roidism in vivo. The application of cord blood stem cells is perspectives as therapeutic treatment of derma.

Key words:

cord blood, skin, rats, epidermis.

Актуальность.

Кожа, как самый крупный

орган в организме человека и животных, являет-

ся не только «ареной борьбы» с различными мик-

роорганизмами и вредными воздействиями, но и

зеркалом, отражающим общее состояние здоровья

организма. Эндокринная система играет веду-

щую роль в регуляции функционирования кожи,

обеспечивая обмен веществ в этом органе, его

репарацию и восстановление утрачиваемых эле-

ментов, функционирование желез и рост волос.

Наиболее важным влиянием на функционирова-

ние кожи обладают гормоны щитовидной железы

[2, 3].

Тиреоидные гормоны играют главную роль

в обеспечении метаболизма и необходимы для

нормального роста и развития кожи. Основным

механизмом действия тиреоидных гормонов яв-

ляется стимуляция синтеза белков в цитоплазме

клеток и повышение уровня потребления тканями

кислорода. Развивающиеся при хроническом ги-

потиреозе нарушения структуры дермы проявля-

ются изменениями волосяного покрова, функцио-

нальными изменениями потовых и сальных же-

лез, сухостью кожи, повышенным слущиванием

эпидермиса, нарушениями основных способно-

стей кожных покровов в осуществлении физиоло-

гических, иммунных и биохимических функций

[3, 5].

Известно, что для стимуляции процессов

репарации, поврежденной или регенерации ста-

реющей, утратившей тургор и эластичность ко-

жи в последнее время все чаще используют био-

логически активные препараты – плаценту, ее

экстракты, клеточные суспензии [7,10]. Однако

механизм действия этих препаратов изучен недо-

статочно. Клетки пуповинной крови (КК) изна-

чально использовали для лечения заболеваний

системы крови, однако в последнее время в связи

с открытием в пуповинной крови плюрипотент-

ных стволовых клеток (СК) и стволовых мезен-

химальных клеток, кордовая кровь рассматрива-

ется как потенциальный источник для клеточной

терапии при широком спектре заболеваний [9]. В

этой связи возникают теоретические предпосылки

для использования препаратов КК в процессах

регенерации кожи крыс как в системе in vitro, так

и при дерматопатологии, вызванной эксперимен-

тальным гипотиреозом (ЭГт).

Целью

работы было изучение влияния

криоконсервированных ядерных клеток пуповин-

ной крови человека на морфологию кожи крыс in

vitro и in vivo.

Материал и методы исследования.

Объ-

ектом исследования в экспериментах in vitro яв-

лялись образцы кожи крыс. Фрагменты кожи раз-

мером 0,3 х 0,3 см помещали на твердый агар,

Ш.О. Коржавов, Э.У. Хусанов, М.М. Юсупов, Н.А. Мухаммадов, О.Т. Шодмонов

Биология ва тиббиёт муаммолари 2017, №4 (97) 149

затем покрывали стандартной культуральной ро-

стовой средой в объеме 0,5 мл. При постановке

эксперимента материал распределяли на следую-

щие группы: 1- я группа – интактная кожа; 2-я –

(контрольная) – образцы кожи, помещенные на

поверхность агара с культуральной средой; 3-я –

(опыт) – образцы кожи, помещенные на поверх-

ность агара с культуральной средой, в которую

добавляли 10% препарата пуповинной крови.

Препарат пуповинной крови «Стемкорд» пред-

ставлял собой криоконсервированную взвесь

стволовых клеток (СК) в концентрации (1-3)10

5

в

1 мл плазмы КК, богатой биологически активны-

ми веществами, факторами роста, гормонами, ци-

токинами, микроэлементами [1]. Исследования

ядросодержащих клеток (СD45+) пуповинной

крови, в том числе и гемопоэтических (СD34+),

проведены до и после криоконсервирования ме-

тодом проточной цитометрии по международному

ISHAGE протоколу [1]. Культивирование кожи

выполняли in vitro в условиях термостата при

температуре 37 С и pH среды 7,2. Фрагменты

кожи исследовали на 5, 15 и 25 сутки культи-

вирования. Материалом исследования в экспери-

ментах in vivo служили самки беспородных белых

крыс 4-месячного возраста массой тела 110-120 г.

Работа с животными осуществлялась с соблюде-

нием положения Европейской конвенции по

охране позвоночных животных и национального

законодательства по гуманному обращению с

животными. Субтотальную тиреоидэктомию

(100%-ное удаление щитовидной железы) вы-

полняли по методу Легач [5]. В эксперименте

были задействованы животные, подвергшиеся

тиреоидэктомии и последующему введению пре-

парата КК в хвостовую вену [8]. Все эксперимен-

ты проводились в течении первых 40 дней с мо-

мента тиреоидэктомии, учитывая динамику вос-

становления тиреоидных гормонов в крови под-

опытных животных [3,8].

Животные составили следующие экспери-

ментальные группы:

группа 1-ЭГт – тиреоидэктомированные

животные;

группа 2-ЭГт - тиреоидэктомированные жи-

вотные, которым вводили препарат КК.

Каждая группа состояла из 10 животных.

Контролем служили интактные животные. Для

изготовления гистологических препаратов иссе-

ченные на всю толщину участки кожи из области

спины и культивируемые фрагменты кожи фик-

сировали в 10%- ном формалине, промывали

проточной водой, подвергали обезвоживанию в

спиртах возрастающей концентрации, просветля-

ли в ксилоле и заливали в парафин-целлоидин.

Полученные из парафин-целлоидиновых блоков

микротомные срезы толщиной 5-7 микрон окра-

шивали гематоксилином и эозином для получения

обзорных гистологических препаратов, а также -

пикрофуксином по методу Ван Гизон для изуче-

ния соединительной ткани [6]. Дифференцировку

препаратов проводили под световым микроско-

пом «Биолам» при увеличении ×400. Статистиче-

скую обработку полученных данных проводили

по методу Стьюдента-Фишера [4].

Результаты исследования и их обсужде-

ние.

В первой серии экспериментов в культуре in

vitro на гистологических препаратах структура

интактной кожи соответствовала норме и была

представлена хорошо дифференцируемыми слоя-

ми – эпидермисом и дермой. После 5 суток куль-

тивирования фрагментов кожи контрольной

группы на агаризованной ростовой среде наблю-

далось уменьшение толщины эпидермиса за счет

снижения количества клеток в его слоях (керати-

низация и миграция клеток). Отмечалась сгла-

женность дермоэпидермальной границы, расши-

рялись эпидермальные выросты. В сосочковом

слое дермы наблюдалась пролиферация фиб-

робластов, их количество увеличивалось по срав-

нению с интактной кожей. В сетчатом слое дер-

мы появлялись молодые коллагеновые волокна,

которые интенсивно окрашивались, увеличива-

лось количество клеток в волосяных фолликулах

и железистых структурах (рис. 1, а).

Во фрагментах кожи, выращенных на ага-

ризованной питательной среде, в которую был

добавлен препарат «Стемкорд» (группа 3), на 5-е

сутки культивирования структура эпидермиса

была сравнима с интактной. Базальный слой со-

держал один ряд клеток. Дермоэпидермальная

граница в основном контурировалась хорошо,

однако местами наблюдалось отслоение эпидер-

миса от дермы в области базальной мембраны.

Коллагеновые волокна образовывали плотную

сеть, количество фибробластов увеличивалось по

сравнению с группами 1 и 2 (рис. 1, б).

На 15-е сутки культивирования фрагментов

кожи без препарата уменьшалась толщина эпи-

дермиса по сравнению с интактной кожей. Дермо-

эпидермальная граница контурировалась нечетко.

Структура соединительнотканных волокон дермы

соответствовала интактной коже. Количество

фибробластов увеличивалось.

В волосяных фолликулах и сальных желе-

зах наблюдалась пролиферация эпителиальных

клеток, размеры которых были увеличены (рис. 2,

а). В присутствии препарата «Стемкорд» на 15-е

сутки культивирования кожи толщина эпидерми-

са по сравнению с группой 2 увеличивалась, од-

нако дифференциация его клеточных слоев была

затруднена, в базальном слое обнаруживались

клетки в состоянии митоза.

Влияние клеточных препаратов пуповинной крови на морфологию кожи крыс

150 2017, №4 (97) Проблемы биологии и медицины

а.

б.

Рис. 1.

Кожа в культуре in vitro на 5 сутки. а - на агаризованной питательной среде; б - на агаризован-

ной питательной среде с добавлением препарата «Стемкорд». Окраска г.-э. Ув. ×400

а.

б.

Рис. 2.

Кожа в культуре in vitro на 15 сутки. а - на агаризованной питательной среде; б - на агари-

зованной питательной среде с добавлением препарата «Стемкорд» Окраска г.-э. Ув. ×400

Клетки базального слоя эпидермиса имели

выраженную базофилию (ядра гиперхромные,

занимающие почти всю клетку, цитоплазма –

ацидофильная). Дермоэпидермальная граница

контурировалась. В дерме, непосредственно в со-

сочковом слое, увеличивалось количество фиб-

робластов по сравнению с их содержанием в коже

групп 1 и 2. Соединительная ткань была пред-

ставлена плотно упакованными пучками коллаге-

новых волокон, фибробласты гиперхромные (рис.

2, б).

а.

б.

Рис. 3.

Кожа в культуре in vitro на 25 сутки. а - на агаризованной питательной среде; б - на агари-

зованной питательной среде с добавлением препарата «Стемкорд» Окраска г.-э. Ув.

×400

Ш.О. Коржавов, Э.У. Хусанов, М.М. Юсупов, Н.А. Мухаммадов, О.Т. Шодмонов

Биология ва тиббиёт муаммолари 2017, №4 (97) 151

а.

б.

в.

Рис. 4.

Кожа крыс экспериментальных групп: а – интактные животные; б – животные с моделирован-

ным гипотиреозом через 1 мес; в - тиреоидэктомированные животные, которым вводили препарат КК.

Окраска г.-э. Ув. ×400

На 25-е сутки культивирования на агаризован-

ной среде без препарата в коже появлялись очаги

микронекроза. В эпидермисе увеличивались меж-

клеточные пространства, плохо дифференцировались

слои клеток. Ядра эпителиальных клеток были пик-

нотичны, цитоплазма – вакуолизирована. Отмечалась

стертость границы между эпидермисом и дермой,

наблюдались очаги клеточного детрита. В дерме

происходила дезорганизация соединительной ткани в

виде гомогенизации и глыбчатого распада коллаге-

новых и эластиновых волокон. Количество фиб-

робластов уменьшалось. Наблюдались отечность и

деструкция железистых структур и волосяных фол-

ликулов (рис. 3, а). При культивировании фрагмен-

тов кожи в среде с добавлением препарата «Стем-

корд» на 25-е сутки некротические процессы как

в эпидермисе, так и в дерме не отмечались. Тол-

щина эпидермиса сохранялась на уровне 15-х су-

ток, причем базальный слой оставался активным,

отмечалось увеличение количества сливающихся

роговых чешуек.

Граница между эпидермисом и дермой бы-

ла четко выражена. В дерме сохранялась высокая

клеточность, хотя количество фибробластов

уменьшалось по сравнению с 15 сутками культи-

вирования. В сетчатом слое четко контурирова-

лись коллагеновые и эластиновые волокна, кото-

рые формируют сетчатую структуру соедини-

тельной ткани, однако их плотность уменьшалась

по сравнению с 15 сутками культивирования, а в

некоторых участках кожных фрагментов сохраня-

лась плотная структура соединительной ткани.

Дериваты кожи – волосяные фолликулы и

сальные железы – сохраняли свою структуру,

хорошо контурировались. В отдельных участках

кожных фрагментов отмечались отслоение эпи-

дермиса и микроочаги клеточного детрита (рис. 3,

б). Полученные результаты свидетельствуют о

том, что препарат КК «Стемкорд» стимулирует

пролиферативную активность клеток дермы и

эпидермиса in vitro.

В экспериментах in vivo при гистологиче-

ском исследовании кожи тиреоидэктомированных

животных (группа 1-ЭГт) через 1 месяц после мо-

делирования гипотиреоза обнаруживалось, что

эпидермис очень истончен, уплощен, отсутствует

его нормальная складчатость. Слои эпидермиса

не дифференцируются, некоторые клетки имеют

пикнотичные ядра. В собственно дерме сосочко-

вый и сетчатый слои также не дифференцируют-

ся. Соединительнотканная часть дермы представ-

ляет собой разрыхленные, фрагментированные и

контурно измененные пучки коллагеновых и эла-

стических волокон, среди которых находится

уменьшенное, по сравнению с нормой, количе-

ство фибробластических клеток с плотными яд-

рами. Дериваты кожи – сальные железы и воло-

сяные фолликулы – встречаются редко, они

уменьшены в размерах, ядра их клеток пикнотич-

ны (рис. 4б).

Кожа тиреоидэктомированных животных,

которым через 1 месяц после операции вводили

препарат КК (группа 2-ЭГт), иссекалась у жи-

вотных под эфирным наркозом спустя 7 суток.

При гистологическом исследовании обнаружи-

вался новообразованный эпидермис, который был

утолщен по сравнению с нормой. В нем обнару-

живалась складчатость и дифференцировка кле-

ток с формированием характерных слоев. Клетки

фибробластического ряда, количество которых

было увеличено по сравнению с нормой, в боль-

шинстве случаев располагались параллельно но-

вообразованным пучкам коллагеновых волокон,

формирующих дерму, трещин и щелей между ни-

ми не обнаружено (рис. 4в). В собственно дерме,

особенно в глубоких ее отделах, обнаруживались

растущие волосяные фолликулы. На границе дер-

мы и подкожной ткани наблюдалось разрастание

мелких кровеносных сосудов и капилляров, а

также – фибробластических клеточных элемен-

тов, вероятно произошедших из перицитов (пе-

риваскулярных клеток мезенхимального проис-

Влияние клеточных препаратов пуповинной крови на морфологию кожи крыс

152 2017, №4 (97) Проблемы биологии и медицины

хождения, служащих главными предшественни-

ками фибробластов).

Результаты гистологического исследования

в эксперименте in vivo показывают, что характер

восстановительных процессов в коже животных с

экспериментальным гипотиреозом при введении

препарата КК имеет выраженную тенденцию к

полной регенерации утраченных морфофункцио-

нальных свойств кожи. По нашему мнению, ос-

новным механизмом, обеспечивающим восстано-

вительные процессы в коже как in vitro, так и in

vivo, является введение биогенных стимуляторов,

присутствующих в плазме КК, которые участву-

ют в нормализации метаболизма в организме, и

определенного количества стволовых, в том числе

и мезенхимальных, клеток, стимулирующих рост

капилляров и фибробластов.

Заключение.

Препарат КК «Стемкорд»,

добавленный в агаризованную питательную среду

культивирования, стимулирует пролиферативную

активность клеток дермы и эпидермиса in vitro. В

эксперименте in vivo характер восстановительных

процессов в коже животных с эксперименталь-

ным гипотиреозом при введении препарата КК

«Стемкорд» имеет выраженную тенденцию к

полной регенерации утраченных кожей морфо-

функциональных свойств. Применение препара-

тов пуповинной крови как при культивировании

фрагментов кожи in vitro, так и в условиях экспе-

риментального гипотиреоза можно рассматривать

как перспективный фактор воздействия на тече-

ние и последствия эндокринных нарушений всего

организма и кожи, в частности.

Литература:

1.

Бабийчук Л. А. Новые перспективы в крио-

консервировании ядросодержащих клеток пупо-

винной крови / Л. А. Бабийчук, О. В. Кудокоцева,

В. В. Рязанцев // Гематологія і переливання крові.

– 2008. № 34. – С. 17-21.

2.

Калюжная Л., Дзюбак В. Старение кожи: па-

тогенетические и лечебные аспекты / Л. Калюж-

ная, В. Дзюбак // Укр. мед. часопис. – 2010. – № 2

(28). – С. 68-72.

3.

Кандрор В. Физиологические эффекты ти-

реоидных гормонов и механизм их действия //

Руководство по клинической эндокринологии:

статья / В. Кандрор. - Питер, 2011. - С. 120-124.

4.

Лакин Г. Ф. Биометрия / Лакин Г. Ф.– М.:

Высш. школа, 2010. – 352 с.

5.

Легач Е. И. Ретроградный способ тиреоидэк-

томии крыс как адекватная модель гипотиреоза /

Е. И. Легач // Трансплантологія. - 2011. – Т. 8, №

2. - С. 92-94.

6.

Меркулов Г. А. Курс патологогистологической

техники / Меркулов Г. А. - Ленинград, 2008. – 340 с.

7.

Озерская О. Экспериментальные подходы к

обоснованию применения клеточных композиций

на основе фибробластов в дерматокосметологии/

О. Озерская, В. Щеголев // Клеточная трансплан-

тология и тканевая инженерия. – 2008. - Т. 3, № 2.

- С. 66-67.

8.

Применение препаратов пуповинной крови и

общей экстремальной аэрокриотерапии для вос-

становления нарушений дермы, вызванных хро-

ническим гипотиреозом / В. Ю. Пурышева, И. И.

Ломакин, О. В. Кудокоцева [и др.] // Трансплан-

тологія. - 2008. - Т. 10, № 1. - С. 100-103.

9.

Стволовые клетки. Биология и потенциальное

клиническое использование / Н. Я. Спивак, Г. Т.

Сухих, В. В. Малайцев и др. // Трансплантологія.

– 2009. – Т.8, №3. – С. 6-14.

10.

Scott D. W. Miller and Kirk ‘s small animal

dermatology / Scott D. W., Miller W. H., Griffin C.
E. - 5th ed. - Philadelphia etc.: W/B/Saunders Com-

pany, 2010. - 1213 p.

ВЛИЯНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ПРЕПАРАТОВ

ПУПОВИННОЙ КРОВИ НА МОРФОЛОГИЮ

КОЖИ КРЫС

Ш.О. КОРЖАВОВ, Э.У. ХУСАНОВ,

М.М. ЮСУПОВ, Н.А. МУХАММАДОВ,

О.Т. ШОДМОНОВ

Самаркандский государственный медицинский

институт, Республика Узбекистан, г. Самарканд

В работе изучен характер влияния криокон-

сервированных зародышевых клеток пуповинной

крови на морфологию кожи на разных этапах

культивирования кожи in vitro и характера влия-

ния стволовых клеток пуповинной крови на мор-

фофункциональное состояние дермы в условиях

экспериментального гипотиреоза in vivo. Приме-

нение стволовых клеток пуповинной крови - это

перспективы в качестве терапевтического лечения

дермы.

Ключевые слова:

пуповинная кровь, кожа, кры-

са, эпидермис.