Биология ва тиббиёт муаммолари, 2017, №1 (93) 161
УДК: 612.398
КОНЪЮГИРЛАНГАН ОҚСИЛЛАРНИ ОЛИШ УСЛУБЛАРИ
Г.А. ДУШАНОВА, У.Р. НИЁЗОВ
Самарқанд Давлат Университети, Ўзбекистон Республикаси, Самарқанд
МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГИРОВАННЫХ БЕЛКОВ
Г.А. ДУШАНОВА, У.Р. НИЁЗОВ
Самаркандский Государственный Университет, Республика Узбекистан, г. Самарканд
METHODS OF PRODUCING CONJUGATED PROTEINS
G.A. DUSHANOVA, U.R. NIYOZOV
Samarkand State University,
Republic of Uzbekistan, Samarkand
Ҳозирги кунда турли хил инфекцион касалликлар ташҳисида тест-тизимлардан фойдаланилади.
Тест-тизимлар биологик табиатга эга бўлиб, уларни яратишда биотехнологик услублар қўлланилади.
Охирги йилларда инфекцион касалликларни аниқлашда ТОРЧ- инфекциялар тизимида гепатит В,С,
замбуруғли касалликларни ташхиси учун турли хил тест-тизимлар яратилган бўлиб, иммунофермент
таҳлили кенг тарқалгандир.
Калит сўзлар:
конюгирлаш, оқсил, пероксидаза, тест- системалар.
Today, in the diagnosis of infectious diseases are various test systems based on conjugated protein which
is one of conjugating horseradish peroxidase and immunoglobulin G. This research provides cleaning methods,
isolation and conjugating enzyme and immunoglobulin G. The conjugation using glutaraldehyde is an effective
method used in the practice of creating test systems
Key words:
conjugated, proteins, peroxidase, test systems.
Иммунофермент таҳлили биринчи марта
1971 йилда аниқланган ва унинг муаллифлари
Энгвал ва Перлман бўлиб Нобель мукофотига
сазовор бўлган [3,4]. Реакция асосида антиген-
антитана бирикмаси ҳосил бўлади ва уни иммун
реакцияси коньюгат-фермент билан нишонланган
оқсил реакцияси ёрдамида кучайтирилади.
Радиоиммун услубларга нисбатан таъсирчанлиги
юқори бўлиб, хусусийлиги билан ажралиб туради,
яъни
аниқлик
даражаси
юқоридир.
Иммунофермент таҳлилнинг икки хил тури
мавжуддир. Гомоген ва гетероген- ёки қаттиқ
фазали турлари бўлиб, гомоген тури ишлатиш
услубига қараб оддий ва тез амалга оширилади,
яъни вақт тежаш хусусиятига эга. Бу услуб
ёрдамида
гормонлар,
оқсиллар,
доривор
воситалар ва наркотик моддалар, яъни
пастмолекулярли моддаларни аниқлаш қулайдир
[5].
Қаттиқ
фазали
ёки
гетероген
иммунофермент
таҳлили
реакция
компонентларни ажратиш, қаттиқ фазали
планшеталарда иммобилизирланган антиген ёки
антитанани ишлатишга асосланган. Оддий ювиш
услубини қўллаш натижасида балласт ёки иммун
реакцияларга
киришмаган
бирикмаларни
йўқотиш мумкин. Шунинг учун қаттиқ фаза
ўрнида сорбцион хусусиятга эга бўлган полимер
материалдан
тайёрланган
планшеталар
қўлланилади. Шундай қилиб, қаттиқ фазали
иммунофермент таҳлили қаттиқ фазада кетма-кет
ўтадиган хусусий иммунокимёвий реакциялар
натижасида кўп қаватли комплекс ҳосил
бўлишини назарда тутади ва ҳар бир босқичда
реакцияга киришмаган компонентлар ювилиб
борилади [7]. Гетероген иммунофермент таҳлили
тўғри ва тўғри бўлмаган турларига ажратилади.
Тўғри вариантида асосан инфекцион касалликлар
қўзғатувчисига
нисбатан
фермент
билан
нишонланган антитана ишлатилади. Реакция бир
босқичда
ўтказилади,
лекин
реакция
натижаларини стандартлаш қийинлик билан
амалга оширилади. Иммунофермент услубининг
асосийси бу тўғри бўлмаган тури бўлиб, унинг
натижасида тиббиёт амалиётида тест- тизимлар
ишлаб чиқилган бўлиб, инфекцион касалликлар
ташҳғисида кенг қўлланилади. Тест тизимлар
таркибида:
1.
Иммобилизирланган
антиген+антитанали планшеталар.
2.
Эритма 1 (IgG, IgM ли зардоб).
3.
Конъюгат
(фермент
билан
нишонланган оқсил).
4.
Ювиш эритмасини тайёрлаш учун
тайёр реактивлар.
5.
Стоп-реагент.
Иммунофермент
таҳлили
учун
ишлатиладиган конъюгат асосан конъюгирланган,
яъни фермент билан нишонланган антитана
бўлиб, таҳлил учун кўпинча хрен ўсимлигининг
пероксидазаси
билан
нишонланган
иммуноглобулин ишлатилади. Ушбу оқсил
конъюгатларини олиш технологиясини ишлаб
чиқиш тест-тизимларни маҳаллий шароитда
Конъюгирланган оқсилларни олиш услублари
162
Проблемы биологии и медицины,
2017
, №
1 (93)
ишлаб чиқиш имконини беради ва шу жиҳатдан
долзарб ҳисобланади.
Материал ва услубий қисм.
Хрен
ўсимлигидан пероксидаза ферментини ажратиб
олишда HU, патент №172872 дан фойдаланилди.
Ушбу услубга асосан пероксидаза ферментини
ажратиб олиш, ўсимлик илдизини гомогенизация
қилиш, ферментни сув билан экстракция қилиш,
ҳосил бўлган экстрактнинг аммоний сульфат
билан
фракцияларга
ажратиш
ва
уни
гельфильтрация қилиш ёрдамида ажратиб
олинади. Ушбу услубнинг камчиликларига тоза
ҳолдаги ферментнинг кам маҳсулот ҳосил
қилинишидир
[6].
1.
Ўсимлик
туқимасининг
гомогенизацияси.
2.
Ўсимлик туқимаси сифатида хрен
ўсимлигининг илдизи ва шунингдек, озиқ
-
овқат
маҳсулотларини тайёрлашда ўсимлик илдиз
чиқиндиларидан фойдаланиш.
3.
Фермент экстракцияси.
4.
Гель
-
фильтрация ёрдамида тозалаш.
5.
Фермент лиофилизацияси.
Бунинг учун 3 кг хрен ўсимлигининг
илдизларини гомогенизаторда майдаланади.
Ўсимлик экстракцияси бир соат давомида
ўтказилади. Экстракт ажратиб олингандан сўнг,
бир кун давомида 4 градус ҳароратда ушланади ва
фильтр қоғоздан ўтказилади. Ҳосил бўлган
эритма ҳажми 0,5л ни ташкил қилади.
Кейинчалик фермент эритмасига 200 гр аммоний
сульфатнинг 35% тўйинган эритмаси қўшилади. 3
соат давомида 4 С ҳароратга қолдирилади. Ҳосил
бўлган чўкма центрифугада 9000 айланиш
тезлигида
ўтказилади,
ҳосил бўлган супернатант
ажратиб олинади. Фракциялар 2л 5мМ буфер
эритмада диализ қилинади, диализ охиригача
буфер эритма 4 марта алмаштирилади ва лиофил
қуритилади. Ҳосил бўлган пероксидаза аморф
масса ва
тўқ
рангга эга бўлади ва буферли сувли
эритмаларда яхши эрийди. Ҳосил бўлган фермент
500 мг ни ташкил қилади.
Фермент тозалик
даражаси СФ да текширилади (403 ва 278 нм
тўлқин узунлигида) кўрсаткич 2,7 тенг бўлиши
керак. Фермент фаоллиги 1 мг миқдорда 1000
бирлик ҳисобига тенглаштирилади.
1-
расм.
Оқсилнинг фермент билан нишонланиш даражаси
2-
расм.
Иммуноглобулин G нинг фазовий
тузилиши
3-
расм.
Иммуноглобулин G нинг структур тузилиши
4-
расм.
Иммунометрик тест
Г.А. Душанова, У.Р. Ниёзов
Биология ва тиббиёт муаммолари, 2017, №1 (93) 163
IgG ни ажратиб олиш услуби.
Бошқа
иммуноглобулинлар синфига нисбатан IgGни тоза
ҳолда ажратиб олиш осондир. IgGни аммоний
сульфат
эритмаси
билан
чўктириб,
анионалмашинувчи хроматография қилинади,
масалан
ДЭАЭ-целлюлоза
ёки
ДЭАЭ-
сефадексларда. Ажратиб олинувчи материал
сифатида қон зардоби ишлатилади. IgG
иммуноглобулинлар
гетероген
эритмасидан
иборат бўлиб, таснифлари жиҳатидан ҳам бир-
бирига ўхшаш бўлади. Бу иммуноглобулинларни
анионалмашинувчиларда
ажратиш
мумкин
бўлади, элюент ион кучини ўзгартириш ёрдамида.
Юқори миқдордаги IgG ни олиш услуби.
Аммоний сульфат ёрдамида чўктириш.
100 мл қон зардобига 50 мл туйинган аммоний
сульфат эритмаси солинади. Чўкма центрифуга
қилиш ёрдамида олиб ташланади. 50 мл
дистилланган сув қушилиб яна чўкма ҳосил
қилинади 25 мл аммоний сульфат ёрдамида.
Чўктириш худди шундай 4-5 маротаба
қайтарилади. Кейинчалик олинган эритма диализ
қилинади. Бир хил ҳолларда диализ 40% тузни
ишлатган ҳолда қўлланилади, чунки эритма
чиқиши тезлашади, лекин воситанинг тозалик
даражасига таъсир қилади.
Пероксидаза ферменти билан IgG ни
нишонлаш услуби.
10 мг пероксидаза рН 6,8 ли
0,2 М га эга бўлган фосфатли буферда эритилади.
Буфер таркибида 12,5 г.л глутар альдегиди
бўлиши керак. 18 соат хона ҳароратида инкубация
ўтказилгандан сўнг, хроматография ўтказилади.
СФ да 403 нм тўлқин узунлигида пероксидаза
фаоллиги текшириб кўрилади. Агарда фаоллик
паст бўлса, пероксидаза яна қушилиши зарур
бўлади. Бу эритмага сўнгра, 5 мг иммуноглобулин
антитаналар қушилади. Антитаналар олдиндан 1
мл 0,15М ва 0,1 мл 0,1М карбонат-бикарбонат
буферида эритилиши зарур бўлади. 24 соат 4 С
ҳароратда инкубация қилингандан сўнг 0,1 мл 0,2
М лизин эритмаси қўшилади. Ҳосил қилинган
эритма 2 соат фосфат-тузли буферда диализ
қилинади ва фермент билан нишонланган
антитаналар аммоний сульфат тузлари билан
чўкмага туширилади.
Тадқиқот натижалари.
Фермент билан
нишонланган IgG оқсиллари СФ –Миндрай да 403
нм ва 630 нм тўлқин узунлигида текшириб
кўрилди. Назорат варианти сифатида тоза
иммуноглобулин эритмаси ва пероксидаза
ферменти
тадқиқот
қилинган.
Тадқиқот
натижалари 1-расмда келтирилган. Олинган
натижаларга кўра, энг юқори кўрсаткич
пероксидаза билан нишонланган иммуноглобулин
G да 630 нм оптик зичликдаги тўлқин узунлигида
кузатилган (2,7 ммоль/л) 403 нм оптик зичликдаги
тўлқин узунлигида кўрсаткич 2,1ммоль/л га тенг
бўлган. 1-расмда келтирилган маълумотларга
кўра,
конъюгирланиш
даражаси
глутар
альдегидини қўллаган шароитда оптимал ўтган ва
клиник амалиётда қўллаш мумкинлигини
билдиради. Иммуноглобулин G нинг структур ва
фазовий тузилишига кўра (1, 2 расм),
нишонланиш
асосан
антигенбоғланувчи
қисмидаги вариабелли қисмидаги –NH2 ва
пероксидаза ферментининг -СООН гуруҳлари
ўртасидаги боғланиш туфайли юз беради (4-
расм).
Адабиётлар:
1.
Bromuro C., Romano M.,Chiani P., Berti F.,
Tontini M., Proietti D., Mori E., Torosantucci A.,
Constantino P., Rappuoli R., Cassone A. Beta- glucan
–CRM197 conjugates as candidates antifungal
vaccines. Vaccine, 2010, vol.28, no. 14, pp.2615-
2623.
2.
Bryant K.A., Block S.L., Baker S.A., Gruber
W.C., Scott D.A., PCV13 Infant Study Group. Safety
and immunogenicity of a 13- valent pneumococcal
conjugate vaccine. Pediatrics, 2010, vol. 125, no. 5,
pp. 866- 875.
3.
Dagan R., Poolman J., Siegrist C.A.
Glycoconjugate vaccines and immune interference: a
review. Vaccine, 2010,vol. 28, no. 34,pp. 5513-5523.
4.
Hwang K.W. Haemophilus influenza type b (Hib)
vaccine and its carrier proteins. Arch. Pharm. Res.,
2010, vol. 33, no. 6, pp. 793-795.
5.
Kuo Y.C., Chung C.Y., Transcytosis of CRM197-
grafted polybutylcyanoaacrylate nanoparticles far
delivering zidovudine across human brain-
microvascular endothelial cells. Colloids Surf.
B:Biointerfaces, 2012, vol. 91, pp.242-249.
6.
Leka O., Vallese F., Pirazzini M., Berto P.,
Montecucco C., Zanotti G. Diphteria toxin
conformational switching at acidic pH. FEBS J.,2014,
vol. 281, no.9, pp. 2115-2122.
7.
Park K. Targeted delivery to monocytes.J.
Control. Release, 2012, vol. 158, no. l.p.l.
МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ
КОНЪЮГИРОВАННЫХ БЕЛКОВ
Г.А. ДУШАНОВА, У.Р. НИЁЗОВ
На сегодняшний день при диагностике
инфекционных
заболеваний
применяются
различные
тест-системы
на
основе
конъюгированных белков, одним из которых
является конъюгирование пероксидазы хрена и
IgG. В данной исследовательской работе
приводится методы очистки, выделения и
конъюгирования
фермента
и
IgG.
Конъюгирование с использованием глутарового
альдегида является эффективным методом
применяемым в практике создания тест-систем.
Ключевые
слова:
конъюгирование,
протеин, пероксидаза, тест-системы.
