128
Проблемы биологии и медицины, 2014, №4.1 (81)
УДК: 615.5.615.324.615.26:615.276
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ СВОЙСТВ
СУБСТРАТА КРИОКОНСЕРВИРОВАННОЙ КОЖИ СВИНЬИ
Ю.С. ПЯТНИЦКИЙ
Национальный медицинский университет имени А. Богомольца, Украина, Киев
Резюме.
Целью исследования стало изучение иммунотропных свойств субстрата
криоконсервированной кожи свиньи (СККС) на мышах с нормальным иммунным статусом и в
условиях экспериментальной патологии – контактного дерматита у морских свинок. Установлено,
что профилактическое введение СККС животным с нормальным иммунным статусом стимулирует
фагоцитарную функцию лимфоцитов, не влияет на антителогенез. В условиях аллергического
дерматита СККС снижает выраженность воспаления и нормализует уровень иммуноглобулинов.
Полученные результаты свидетельствуют об иммуномодулирующих свойствах СККС и
обосновывают целесообразность дальнейшего изучения препарата с целью создания
высокоэффективного
противоаллергического
средства
для
патогенетической
терапии
аллергодерматитов.
Ключевые слова:
пероральная иммунологическая толерантность, субстрат криоконсервированной
кожи свиньи, противовоспалительные, иммуномоделирующие свойства.
EXPERIMENTAL RESEACH OF THE IMMUNOMODULATORY PROPERTIES OF THE
CRYOPRESERVED PIG SKIN SUBSTRATE
Y.S. PYATNITSKY
National Medical University named after A.A. Bogomolеts, Ukraine, Kiev
Resume.
The objective of this reseach has been the study of immunotropic properties of the
cryopreserved pig substrate (CPSS) in guinea pig in the experimental pathology, such as a contact
dermatitis guinea pigs. The guinea pigs had a normal immune status. It has been defined, that prophylactic
administration of CPSS to animals stimulates the phagocytic function of lymphocytes, has no effect on
antidiv response. In terms of allergic dermatitis CPSS decreases the severity of inflammation and
normalizes the level of immunoglobulins.
These results indicate immunomodulatory properties of CPSS and make it appropriate for further
study to create antiallergic agent for highly pathogenic therapy of allergic dermatitis
.
Key words:
oral immune tolerance, cryopreserved pig skin substrate, antiinflammatory, immunomodulatory
properties.
Введение
. Неуклонный рост больных
аллергией за последние десятилетия позволяет
говорить о пандемии этого заболевания.
Несмотря на достаточно широкий арсенал
противоаллергических
фармакологических
средств проблема разработки рациональных и
безопасных мер для терапии аллергических
заболеваний остается нерешенной. В настоящее
время, наиболее патогенетическим лечебным
мероприятием
аллергических
состояний
является
аллерген-специфическая
иммунотерапия (АСИТ) и ее разновидностью
является пероральная иммунотерапия (ПИТ) [1],
суть которой состоит в том, что при контакте
определенного или гомологичного по структуре
АГ с иммунной системой, ассоциированной с
желудком и кишечником (GALT) развивается
совместная
супрессия
клеточного
и
гуморального иммунитета. С позиций ПИТ
перспективным
направлением
является
использование
препаратов
на
основе
структурных белков животного происхождения.
Одним из таких препаратов является субстрат
криоконсервированной кожи свиньи (СККС).
Теоретически, пероральное поступление СККС
как источника антигенов (клеточных элементов
кожи свиньи (эластиновых, ретикулярных,
коллагеновых волокон соединительной ткани
дермы), будет способствовать формированию у
больных аллергодерматитом состояния активной
иммунологической ареактивности к антигенам
кожи [2].
Целью
данной работы стало изучение
иммунотропных свойств СКШС на мышах с
нормальным иммунным статусом и в условиях
экспериментальной патологии – контактного
дерматита у морских свинок.
Материалы и методы.
Исследования
проведены с соблюдением правил "Европейской
конвенции по защите позвоночных животных,
которых используют для экспериментальных и
научных
целей"
(Страсбург,
1986)
[3].
Ю.С. Пятницкий
Биология ва тиббиёт муаммолари, 2014, №4.1 (81)
129
Содержание животных во время проведения
эксперимента соответствовало действующим
нормам.
Влияние
СКШС
на
состояние
неспецифического иммунитета оценивали по
динамике процесса фагоцитоза нейтрофилами
частиц латекса после их совместной инкубации в
течение 5, 30 и 60 мин при t 37
0
. Определяли
показатели: фагоцитарный индекс (FI) – на 100
клеток подсчитывали процент фагоцитирующих
клеток; фагоцитарное число (FU) – среднее
количество частиц латекса, поглощенного одним
нейтрофилом [4].
Для изучения влияния СККС на
гуморальный иммунитет мышам предварительно
в течение 2-х недель и весь период иммунизации
вводили внутрижелудочно препарата в дозе 200
мг/кг. Животным контрольной группы вводили
воду. Мышей иммунизировали однократным
внутрибрюшинным введением 3% суспензии
эритроцитов барана (ЭБ) в дозе 0,2 мл/20 г
массы тела животного. Определение количества
антителообразующих клеток (АОК) в селезенке
методом локального гемолиза в геле [5], и
титров гемагглютининов (ГА) и гемолизинов
(ГЛ) в сыворотке крови мышей, по реакции
агглютинации [6], проводили на 5-е сутки после
иммунизации ЭБ.
Состояние клеточного иммунитета на
фоне применения препарата определяли в тесте
гиперчувствительности замедленного типа, по
методу K.P. Kitamura [7]. Исследуемое вещество
животным вводили по схеме, приведенной
выше. Мышей иммунизировали однократным
внутрибрюшинно введением суспензии ЭБ в
дозе 2
10
5
клеток/мл в объеме 0,5 мл раствора
Хэнкса на 20 г массы тела. Разрешающую дозу
ЭБ вводили под апоневротическую пластинку
одной из задних конечностей мышей на 5-е
сутки (опыт). В контралатеральную лапу
вводили физиологический раствор в том же
объеме (контроль). Оценку местной реакции
проводили через 24 часа, рассчитывая индекс
реакции (ИР) по формуле:
ИР = ( М
опыт
– М
контроль
) / М
контроль
× 100 %.
где М
опыт
– масса опытной лапы; М
контроль
– масса
контрольной лапы.
Влияние
СККС
на
образование
иммуноглобулинов
изучали
на
модели
аллергического контактного дерматита (АКД) у
морских свинок, вызванного 5% раствором 2,4-
динитрохлорбензолом (ДНХБ) по методике
Залкан П.М. и Ивлевой Е.А. [8]. Разрешающую
дозу вводили на 21-й день. На 22-е и 26-е сутки
от начала опыта у животных внутрисердечно
собирали кровь для определения уровня
иммуноглобулинов А, M, G и содержания
циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК)
[9].
Полученные экспериментальные данные
обрабатывали
параметрическими
(критерий
Ньюмана-Кейлса)
и
непараметрическими
(критерий Вилкоксона Манна-Уитни) методами
вариационной
статистики
с
помощью
стандартного пакета статистических программ
«Statistica,
v.6,0».
Различия
между
контрольными и опытными группами считали
статистически значимыми при р<0,05.
Результаты и обсуждение.
На первом
этапе изучали влияние СККС на фагоцитарную
функцию нейтрофилов (ФАН), поскольку в
формировании ПИТ значительную роль играют
фагоциты, осуществляя презентацию антигена
иммунокомпетентным клеткам и элиминацию
антигенных
фрагментов
из
организма.
Установлено, что введение СККС в дозе 200
мг/кг в течение двух недель существенно
повышало
фагоцитарную
функцию
нейтрофилов. Под влиянием СККС достоверно
повышались фагоцитарный индекс (FI) и
фагоцитарное число (FU), т.е. увеличивалось как
количество фагоцитирующих клеток, так и
количество поглощенных ими частиц латекса
(табл. 1). Причем, если в группе животных
интактного контроля максимальная активность
наблюдалась на 60-ю минуту инкубации, СККС
стимулировал фагоцитоз уже на пятой минуте
инкубации: FI был выше чем в группе
интактного контроля в 2,6 раза (табл. 1).
Таким
образом,
введение
СКШС
способствовало
повышению
скорости
фагоцитоза. Профилактическое введение СКШС
мышам в дозе 200 мг/кг не вызывало активации
или
угнетения
антителогенеза,
поскольку
количество АОК в селезенке и титры ГА и ГЛ в
сыворотке
крови
предварительно
иммунизированных мышей не менялись (табл.
2).
При
оценке
функциональности
клеточного
иммунитета
установлено,
что
двухнедельное введение СКШС мышам в дозе
200 мг/кг приводило к угнетению иммунной
реакции,
индуцированной
введением
тимусзависимым антигеном ЭБ: индекс реакции
в этой группе был достоверно ниже значений
иммунизированного контроля и не отличался от
ИР, зафиксированного в группе интактных
животных (табл. 3).
Экспериментальное изучение иммуномодулирующих свойств субстрата криоконсервированной…
130
Проблемы биологии и медицины, 2014, №4.1 (81)
Таблица 1.
Изучение биологической активности СККС в тесте фагоцитарной активности нейтрофилов
Группы
животных
5 мин. инкубации
30 мин. инкубации
60 мин. инкубации
FI
FU
IFI
FI
FU
IFI
FI
FU
IFI
Интактный
контроль
6 (5; 7)
3,5
(3,2; 4,1)
0,16
(0,14; 0,29)
30,0
(28,0; 35,0)
4,5
(4,3; 4,9)
1,33
(1,3; 1,5)
46,0
(38,0; 51,0)
6,04
(5,2; 6,6)
2,78
(2,57; 3,22)
СККС,
200 мг/кг
15,5 *
(9; 19)
3,8
(3,3; 4,1)
0,62 *
(0,33; 0,73)
42,0 *
(38,5; 47,5)
5,8 *
(4,7; 6,5)
2,5 *
(2,1; 2,9)
59,0
(44,0; 66,5)
6,8
(5,5; 7,6)
4,51
(2,43; 5,12)
Тималин, 3,6
мг/кг
6
(5; 12)
3,3
(2,8; 4,8)
0,29
(0,14; 0,40)
38,0 *
(31,0; 45,0)
5,7 *
(5,6; 6,7)
2,5 *
(1,8; 2,5)
52,5
(45,0; 61,0)
5,6 *
(4,4; 6,4)
3,05*
(2,4; 3,8)
Примечания: * – отличия достоверны по отношению к интактному контролю, р
0,05;
n=6-10 – количество животных в группах.
Таблица 2.
Влияние СККС на гуморальный иммунитет мышей (Ме (Q25; Q75)
Группы животных
n
Количество АОК
(на селезенку)
Титры ГА,
Log
2
Титры ГЛ,
Log
2
Иммунизированный контроль (ЕБ)
8
8340 (6480; 11360)
7 (6; 8,5)
11 (10; 11)
СККС, 200 мг/кг
8
6760 (3960; 8560)
9,5 (8; 10)
9 (8,5; 11)
Примечание. * − отличия достоверны по отношению к иммунизированному контролю, р<0,05.
Таблица 3.
Влияние СККС на клеточный иммунитет мышей (n=10)
Группы животных
n
Дозы, мг/кг
Индекс реакции
(Ме (Q25; Q75)
Интактный контроль
10
−
5,5 (4,5; 5,6)
Иммунизированный контроль (ЕБ)
10
−
11,7 (9,4; 12,3)*
СККС
10
200
6,5 (3,6; 8,5)**
Примечания. * − отличия достоверны по отношению к интактному контролю, р<0,05; **– отличия
достоверны по отношению к иммунизированному контролю, р<0,05.
Таблица 4.
Влияние СККС на уровень иммуноглобулинов в крови морских свинок с аллергическим контактным
дерматитом, вызванным ДНХБ (Mean
St.err.)
Группы животных
n
Срок
наблюдения,
дни
Уровень иммуноглобулинов, г/л
Ig A
Ig М
Ig G
ЦИК, ум. од.
Интактный контроль 10
22
0,13
0,04
0,80
0,10
1,24
0,03
9,83
1,97
26
Позитивный
контроль
8
22
0,61
0,07*
1,14
0,15
2,31
0,16
24,14
2,95
26
0,77
0,12*
0,79
0,19
2,22
0,16
32,01
3,15
СККС,
200 мг/кг
12
22
0,18
0,02#
0,42
0,06
1,46
0,03
11,20
0,70
26
0,213
0,02#
0,58
0,11
1,70
0,10
10,60
0,8
Примечания. * − отличия достоверны по отношению к интактному контролю, р<0,05; # − отличия
достоверны по отношению к позитивному контролю (ДНХБ), р<0,05.
Целью следующего фрагмента работы
стало изучение иммунотропных свойств СКШС
в
условиях
аллергического
контактного
дерматита
(АКД)
у
морских
свинок,
индуцированного
ДНХБ,
который
при
нанесении на кожу провоцирует развитие
аллергической реакции, адекватной основным
клиническим проявлениям аллергодерматита у
человека [8 ].
Установлено,
что
нанесение
завершающей аппликации ДНХБ на интактный
участок кожи животных вызвало развитие
аллергического воспаления. В месте нанесения
аллергена наблюдали отек тканей, гиперемию с
явлениями
геморрагий
и
выраженной
инфильтрацией,
у
некоторых
животных
образовывались
геморрагические
язвы
с
корками. В крови достоверно повышались
уровни иммуноглобулинов А, M, G и
циркулирующих
иммунных
комплексов
соответственно в 4,7; 1,4; 1,9 раза на 22-е сутки
наблюдения, которые продолжали расти (табл.
Ю.С. Пятницкий
Биология ва тиббиёт муаммолари, 2014, №4.1 (81)
131
4). Уровень Ig М на 26 сутки возвращался к
исходному уровню интактных животных (табл.
4).
Повышенное содержание ЦИК в группе
животных с аллергодерматозом на 26-е сутки
наблюдения
подтверждает
развитие
иммунопатологических реакций как следствие
сенсибилизации
ДНХБ.
Образовавшиеся
комплексы
антиген-антитело
активируют
комплемент,
усиливают
хемотаксис
нейтрофилов,
высвобождают
кинины,
простагландины и другие медиаторы, которые
индуцируют воспалительную реакцию [10]. По
данным литературы признаком нарушения
функциональной активности иммунной системы
в условиях АКД, вызванного ДНХБ, является
снижение
уровня
Ig
A,
основного
иммуноглобулина, связывающего антигены,
попадающие через кожные покровы [10]. В
нашем опыте уровень Ig A и G, наоборот,
повышается, что свидетельствует об усилении
антителообразования с целью инактивации
антигена и ускорения его элиминации. Таким
образом, полученные данные свидетельствуют о
существенном
нарушении
иммунитета
животных с аллергодерматитом.
Введение СКШС на протяжении всего
срока сенсибилизации и после разрешающей
аппликации
аллергена
способствовало
снижению как выраженности АКД (существенно
снижалась гиперемия и отечность тканей) так и
нормализации уровня сывороточных Ig A, M, G
и ЦИК.
Известно, что развитие АКД протекает
по механизму реакции ГЗТ, в основе которой
лежит сенсибилизация Т-лимфоцитов хелперов
первого типа (Th1) антигеном. После первого
контакта с антигеном увеличивается количество
сенсибилизированных
CD4
+
Т-лимфоцитов,
часть из которых является Т-лимфоцитами
памяти. Повторное попадание антигена в
организм происходит активация Тh1, которые
выделяют цитокины клеточного иммунитета –
INF-γ, IL-2, IL-12 [11].
На основании полученных данных
можно предположить, что пероральное введение
СККС животным в дозе 200 мг/кг как мышам с
нормальным иммунным статусом так и морским
свинкам с аллергодерматозом стимулирует
образование специфических, по отношению к
антигенным детерминантам, Т-клеток памяти, а
также зрелых эффекторных Th1 и Th2
лимфоцитов [11]. После повторного контакта
организма с антигеном зрелые Th1 (лимфоциты
воспаления),
активируют
макрофаги
к
внутриклеточному перевариванию, и образуют
хемоаттрактанты, стимулирующие попадание
макрофагов, нейтрофилов и других клеток
воспаления из кровотока в очаг воспаления,
которые, в свою очередь, высвобождают
неспецифические медиаторы воспаления. В
результате указанных процессов происходит
снижение выраженности воспаления в месте
повторного введения антигена и обеспечивается
эффективная
защита
от
антигенного
воздействия. В пользу этого предположения
также
свидетельствуют
данные
о
стимулирующем
влиянии
СККС
на
фагоцитарную
функцию
нейтрофилов
и
угнетающем влиянии на развитие реакции ГЗТ у
нормальных животных.
Таким
образом,
в
результате
проведенных исследований установлено, что
профилактическое введение СККС животным с
нормальным иммунным статусом стимулирует
фагоцитарную функцию лимфоцитов, не влияет
на антителогенез и угнетает развитие реакции
ГЗТ. В условиях аллергического дерматита
СККС снижает выраженность воспаления и
нормализует
уровень
иммуноглобулинов.
Полученные результаты свидетельствуют об
иммуномодулирующих свойствах СККС и
обосновывают целесообразность дальнейшего
изучения
препарата
с
целью
создания
высокоэффективного
противоаллергического
средства
для
патогенетической
терапии
аллергодерматитов.
Литература:
1.
І.В. Корицька Алергія та алерген-специфічна
імунотерапія. Клінічна імунологія. Алергологія.
Інфектологія. № 4 (63) 2013 . – С 73-74.
2.
Leonard SA, Martos G, Wang W, Nowak-
Węgrzyn A, Berin MC. Oral immunotherapy
induces local protective mechanisms in the
gastrointestinal mucosa. // J Allergy Clin Immunol.
– 2012. – V. 129, № 6. – Р. 1579-1587.
3.
Надлежащая
производственная
практика
лекарственных средств // Под.ред. Н.А.
Ляпунова, В.А. Загория, В.П. Георгиевского,
Е.П. Безуглой.− К.:МОРИОН, 1999.− С.508-545.
4.
Гордиенко Г.И., Бородина Т.М., Дудина Т.А.,
Самсыгина
Г.А.
Способ
исследования
поглотительной и метаболической активности
нейтрофилов периферической крови методами
фагоцитоза и НСТ-теста // Педиатрия . – 2003. –
№ . 5. – С 1-3.
5.
Ierne K.N., Nordin A.A. Plaque formation by
single antidiv – producing cells // Science.–
1963.– V. 140.– P. 405-406.
6.
Иммунологические методы /Под ред.
Х.Фримеля.- М.: Медицина, 1987.– 472 с.
Экспериментальное изучение иммуномодулирующих свойств субстрата криоконсервированной…
132
Проблемы биологии и медицины, 2014, №4.1 (81)
7.
Kitamura K. A Foodpad weigh assay method to
evaluate delayed-type hypersensivity in the mouse //
J. Immunol. Methods.– 1980.– V. 39.– P. 277-283.
8.
Залкан
П.М.,
Иевлева
Е.А.
Экспериментальная
модель
аллергического
дерматита.
В
кн.
Актуальные
вопросы
профессиональной дерматологии. – М., – 1965. –
106 с.
9.
Меньшиков В.В. Лабораторные методы
исследования в клинике: Справочник / Под. ред.
Меньшикова В.В. .– Медицина, 1987.– 368 с.
10.
Кожа (строение, функция, общая патология
и терапия) / Под ред. А.М. Чернуха Е.П.,
Фролова М.: Медицина, 1982. -335 с.
11.
А. Ройт. Основы иммунологии. Пер. с англ..
– М: Мир. 1991. – С. 236-238.
ТАЖРИБАДА ИММУНОМОДУЛЯР
ХУСУСИЯТНИ ЧУЧҚА ТЕРИСИНИНГ
МУЗЛАТИБ КОНСЕРВЛАНГАН
СУБСТРАТИДА ЎРГАНИШ
Ю.С. ПЯТНИЦКИЙ
А. Богомольц номидаги Миллий медицина
университети, Украина, Киев
Резюме.
Текшириш мақсади: Чучқа
терисининг
музлатиб
консервланган
субстратининг
(ЧТМКС)
иммунотроп
хусусиятинини
нормал
иммун статусдаги
сичқонларда
ва
экспериментал
патология
шароитида контакт дерматити бўлган денгиз
чучқаларида ўрганиш. Текшириш натижасида
нормал
иммун
статусдаги
хайвонларга
профилактик равишда ЧТМКС юборилганда
лимфоцитлар
фагоцитар
функцияси
стимулланади, антителогенезга таъсир этмайди.
Аллергик
дерматит
шароитида
ЧТМКС
яллиғланиш
жараёнини
пасайтириб
иммуноглобулинлар
миқдорини
меъёрлаштиради.
Олинган
натижалар
ЧТМКС
иммуномодуляр хусусиятга эга эканлигини ва
аллергодерматитнинг
патогенетик
давосида
юқори афзалликдаги аллергияга қарши дори
сифатида ушбу воситани янада ўрганиш
мақсадга мувофиқлигини асослайди.
Калит сўзлар:
перорал иммунологик
толерантлик,
чучқа
терисининг
музлатиб
консервланган субстрати, яллиғланишга қарши,
иммуномодуляр хусусият.
