(Вестнирврача Самарканд
2013, № 3
(Doctor axborotnomasi, Samarqand
94
Колодницкая Г.Б.,
ПРИМЕНЕНИЕ МОДУЛЯТОРОВ СИСТЕМЫ ОКСИДА АЗОТА ПРИ
Корда М.М.
Л ИПОПОЛ ИСАХАРИДН ОМ ПАРОДОНТИТЕ НА ФОНЕ САХАРНОГО
ДИАБЕТА
Тернопольский государственный медицинский университет
им. И.Я. Горбачевского, Тернополь, Украина
РЕЗЮМЕ.
Одной из важнейших проблем современной стоматологии являются воспалительные заболевания тканей
пародонта. Доказана тесная взаимосвязь между пародонтитом и сахарным диабетом. Целью настоящей работы было
исследование влияния на течение пародонтита на фоне диабета модуляторов N0 синтазы - неселективного ингибитора NOS N-
нитро-Е-аргинина и селективного ингибитора iNOS аминогуанидина. Показано, что коррекция пародонтита на фоне диабета
обеими модуляторами приводит к резкому угнетению синтеза оксида азота, причем в случае применения Х-нитро-Ь-аргинина
функциональная активность общей N0 синтазы и содержание NO
X
в сыворотке уменьшаются даже ниже контрольных значений.
Применение при изучаемой сочетанной патологии аминогуанидина эффективно предупреждает деструкцию соединительной
ткани (подавляет шгтенсивность колагенолиза, скорость распада протеогликанов и гликопротеинов, снижает уровень С-
реакгивного белка в сыворотке крови), а Х-нитро-Ь-аргинин существенно не влияет на ее состояние. N-нитро-Ь-аргинин и
аминогуанидин достоверно снижают продукцию провоспалительных цитокинов (ФНО-а и ИЛ-1 р) при липополисахаридном
пародонт ите на фоне сахарного диабета, а также вызывают тенденцию к снижению уровня ангиво- спалитсльных интерлейкинов
(ИЛ-4 и ИЛ-10). Сделан вывод, что селективное ингибирование индуцибельной формы N0 синтазы при пародонтите,
развивающимся на фоне сахарного диабета, может быть перспективным методом лечения больных с такой сочетанной
патологией.
APPLICATION OF NITRIC OXIDE SYSTEM MODULATORS IN THE LIPOPOLYSACCHARIDE PERIODONTITIS ON
DIABETES MELLITUS BACKGROUND.
SUMMARY.
One of the major problems of modem dentistry is the inflammation of the
periodontal tissues. The close relationship between periodontal diseases and diabetes meliitus has been proved. The purpose of the present
work was to study the effect of NO synthase modulators (non-selective NOS inhibitor N-nitro-L-arginine and selective iNOS inhibitor
aminoguanidine) on die course of periodontitis on diabetes background. It has been shown that the correction of periodontitis on diabetes
background by both modulators results in the drastic inhibition of nitric oxide synthesis, and in the case of N-nitro-L-arginine application
the total serum NO synthase functional activity and NO
X
content was decreased below the control values. Aminoguanidine application in
the studied combined pathology' effectively prevented the degradation of connective tissue (suppressed the coilagenolysis intensity, the
rate of proteoglycans and glycoproteins breakdown, and decreased the serum level of C-reactive protein), and N-nitro-L-arginine did not
significantly affect its state. N-nitro-L-arginine and aminoguanidine significantly reduced the production of proinflammatory cytokines
(TNF-a and IL-10) in lipopoly saccharide periodontitis on diabetes background, and also caused a tendency to reduce the level of anti-
inflammatory interleukins (IL-4 and IL-10). It has been concluded that the selective inhibition of tire inducible form of NO synthase in
periodontitis, which is developed on the diabetes meliitus background, may be a promising treatment for patients with this combined
pathology.
Введение. Одной из важнейших проблем современ-
ной стоматологии являются воспалительные заболевания
тканей пародонта. В разных странах мира от 50 до 90 %
населения страдает от пародонтита разной степени
тяжести [1]. Основным этиологическим фактором вос-
палительных процессов в пародонге являются грамот-
рицательные анаэробные микроорганизмы, мембраны
которых содержат липополисахарид, имеющий мощный
провоспалительных эффект.
Доказаны взаимосвязи между заболеваниями паро-
донта и соматической патологией, в частности, с болез-
нями желудочно-кишечного тракта, легких, печени, а
также диабетом [2, 3, 4]. Сахарный диабет по своему
социальному и медицинскому значению занимает одно
из ведущих мест в общей структуре заболеваемости и
характеризуется тяжестью лечения и серьезным прогно-
зом. Ряд литературных данных показывают, что сахар-
ный диабет является весомым фактором риска воспали-
тельных заболеваний ротовой полости [5, 6, 7]. Однако,
особенности патогенеза пародонтита, возникающего на
фоне сопутствующего диабета, механизмы, лежащие в
основе воздействия диабета на патогенез пародонтита,
возможности лечения такой сочетанной патолоии на
сегодня все еще требуют детального изучения.
В работе [8] нами было показано, что в патогенезе
пародонтита, вызванного липополисахаридом, важную
роль играет оксидативный стресс и гиперпродукция
оксида азота. Особенно патогенетическая роль нигроок-
сидативного стресса проявляется у крыс, у которых па-
родонтит развивался на фоне сахарного диабета. Очеви-
дно, что сам липополисахарид и медиаторы воспаления,
образующиеся в тканях пародонта, активируют индуци-
бельпую форму N0 синтазы, в результате чего образуется
избыточное количество оксида азота, который, будучи
свободным радикалом, может иметь повреждающий
эффект на клетки.
Целью настоящей работы было исследование влия-
ния на развитие пародонтита на фоне диабета модулято-
ров N0 синтазы, в частности, неселекгивного ингибитора
данного фермента М-нитро-Ь-аргинина и селективного
ингибитора iNOS аминогуанидина.
Методы исследования. В эксперименте использовано
40 беспородных крыс-самцов массой 160-180 г. Всех
животных разделили на 4 группы: 1-я - конфоль
(интактные крысы); 2-я - крысы с пародонтитом на фоне
сахарного диабета. У животных этой группы вызывали
сахарный диабет путем однократного внутрибрюшного
введения стрептозотоцина в дозе 45 мг/кг. Начиная с 30-
х суток после инъекции стрептозотоцина животным в
течении 2-х недель через день вводили в ткани десен по
40 микролигров (1 мг/мл) липополисахарида Е. Coll
(ЛПС). Развитие диабега контролировали по содержа
'Вестни^врача, Самарканд
2013, № 3
DoHjor axfiorotnomasi, Samarqand
95
нию глюкозы. В эксперименте использовали животных с
уровнем глюкозы 12-18 ммоль/л; 3-я - крысы с паро-
донтитом на фоне диабета, которым, начиная с ЗО-х су-
ток эксперимента, параллельно с ЛПС ежедневно в те-
чение 14-и суток вводили внутрибрюшинно неселектив-
ный ингибитор NO-сиятазы М-нитро-Ь-аргинин («Sigma-
Aldrich», США) в дозе 50 mg/kg; 4-я - крысы с
пародонтитом на фоне диабета, которым, начиная с 30-х
суток эксперимента, параллельно с ЛПС ежедневно в
течение 14-и суток вводили внутрибрюшинно селектив-
ный ингибитор индуцибельной NO синтазы аминогуа-
нидин («Sigma-Aldrich», США) в дозе 20 мг/кг. Живот-
ных выводили из эксперимента пугем декапитации под
эфирным наркозом на 15 сугки от начала введения ЛПС.
Для исследований использовали гомогенат тканей паро-
донта и сыворотку крови. Суммарную активность NO
синтазы в ткани пародонта определяли по методу [9],
общее содержание ншратов и нитритов в сыворотке
крови и пародонте - по методу [10]. Определение содер-
жания гликозаминогликанов в сыворотке крови прово-
дили по методу [11], содержания свободного оксипро-
лина - по методу [12], содержания сиаловых кислот -
методом Гесса [13]. Для определения содержания С-
реактивного белка в сыворотке крови использовали ме-
тод латексагглютинации «СРБ-лагекс-тест» с помощью
диагностических наборов «Соппау» (Польша). Для
определения уровня цитокинов (TNF-a, IL-ip, IL-4, IL- 10)
в сыворотке использовали иммуноферментный анализ
(набор реактивов фирмы Vector Best, Новосибирск,
Россия). Абсорбцию проб измеряли на аппарате "Stat Fax
Plus" согласно протоколу производителя.
Результаты и обсуждение. Поскольку N-Hwrpo-L-
аргинин и аминогуанидин являются ингибиторами син-
тазы оксида азота, а функционирование как эндотелиа-
льной, так и, особенно, индуцибельной форм NO синтазы
непосредственно определяет течение воспалительных
реакций, было важно изучить как данные препараты
влияют на состояние системы оксида азота при паро-
донтите на фоне диабета. Из диаграмм, приведенных на
рисунке 1, видно, что общая активность NO синтазы
резко (в 6,3 раза) снижалась по сравнению с некорриги-
рованными животными при введении N-wnpo-L-
аргинина, достигая уровня 0,15+0,01 нмоль/мг бел-
ка*мин. В этом случае активность фермента была пони-
женной достоверно (в 1,8 раза) даже по сравнению с
контролем. При применении амияогуанидина активность
NO синтазы составляла 0,34+0,02 нмоль/мг бел- ка*мин,
т.е. снижалась хотя и не так выражено, как в предыдущем
случае (в 2,8 раза), однако достоверно по сравнению с
нелеченными животными. Стоит отметить, что при
использовании аминогуанидина активность NO синтазы
в сыворотке крови пораженных животных практически
не отличалась от таковой в контроле.
Подобно изменениям активности NO синтазы
менялось содержание нитратов и нитритов в сыворотке и
пародонте пораженных крыс, которым проводили
коррекцию. При применении N-HHTpo-L-аргинина
содержание NO
X
в сыворотке составило 1,60+0,14
ммоль/л, что было существенно ниже (в 2,7 раза) по
сравнению с некорригированными животными. При
введении крысам специфического ингибитора NO
синтазы уровень NO
X
снизился до 3,10+0,26 ммоль/л, что
было достоверно ниже, чем у животных, которым
препарат не вводили, и уже достоверно не отличалось от
нормы.
В тканях пародонта животных, которым вводили N-
нитро-1.-аргинин, как и в сыворотке, содержание NO
X
также существенно (в 2,3 раза) снижалось и составило
0,75+0,06 ммолы'кг. Под влиянием аминогуанидина
данный показатель в пародонте составил 1,04+0,15
ммоль/кг, что также было достоверно (в 1,7 раза) ниже,
чем у крыс без лечения (рис. 1). В обоих случаях содер-
жание NO
X
в пародонте достоверно не отличалось от
контрольного уровня.
Рис. 1. Общая активность NO синтазы в тканях пародонта (нмоль/мг белка*мин) и содержание нитратов и
нитритов в сыворотке крови (ммоль/л) и тканях пародонта (ммоль/кг) крыс с липополисахаридным пародо-
нтитом на фоне сахарного диабета при применении N-Hjrrpo-L-аргинииа и аминогуанидина.
Здесь и в следующих рисунках: * - изменения достоверны по сравнению с показателями интактных животных; # - изменения
достоверны по сравнению с показателями животных с пародонтитом на фоне сахарного диабета. 1 - контрольные крысы, 2 -
животные с пародонтитом на фоне сахарного диабета, 3 - животные с пародонтитом на фоне сахарного диабета при
применении М-нитро-Г-аргинина, 4 - животные с пародонтитом на фоне сахарного диабета при применении аминогуанидина.
'Вестник^ерача, Самарканд
2013, № 3
<Dofaor a\6orotnmnasi, Samarqand
96
Таким образом, коррекция пародонтита на фоне ди-
абета неспецифическим ингибитором NO синтазы N-
нитро-Ь-аргинином и специфическим ингибитором iNOS
аминогуанидином приводит к резкому угнетению
синтеза оксида азота, причем в случае применения N-
нитро-Ь-аргинина функциональная активность общей
NO синтазы и содержание NO
X
в сыворотке уменьшают-
ся даже ниже контрольных значений.
Результаты влияния №нитро-Ь-аргинина и амино-
гуанидина на основные показатели, характеризующие
состояние соединительной ткани у крыс с пародонтитом
на фоне сахарного диабета, показано на рисунке 2. Как
можно увидеть, неспецифический ингибитор NO синтазы
существенно не влиял на активность коллагенолиза (у
крыс, которым вводили этот препарат, уровень свобо-
дного оксипролина в сыворотке крови составил
24,80+2,05 мкмоль/л). В то же время специфический
ингибитор индуцибельной NO синтазы вызывал досто-
верное (по сравнению с нелеченными крысами) сниже-
Как и в случае с коллагенолизом, N-нитро-Е- аргинин
не влиял существенно на скорость распада про-
теогликанов у крыс с пародонтитом и диабетом (содер-
жание гликозаминогликанов в сыворотке составило
90,80+7,04 мкмоль/л). Под влиянием аминогуанидина
уровень гликозаминогликанов в сыворотке животных с
сочетанной патологией составил 70,42+4,82 мкмоль/л,
что было достоверно меньше, чем в некорригированных
животных.
Содержание сиаловых кислот, свидетельствующее
об интенсивности распада гликопротеинов, у крыс с
пародонтитом и диабетом достоверно изменялось также
только под влиянием специфического ингибитора iNOS.
В этом случае их уровень в сыворотке составлял
6,20+0,44 ммоль/л, что было на 35 % меньше (Р 0,05),
При исследовании содержания в сыворотке крыс с
пародонтитом на фоне диабета С-реактивного белка было
обнаружено, что N-нитро-Е-аргинин не только не снижал
уровень данного индикатора повреждения тканей, а и,
наоборот, несколько повышал (до 12,60+0,95 мг/л). В то же
время
при
использовании
с
целью
коррекции
аминогуанидина наблюдалось достоверное (по сравнению с
некорригированными
животными)
уменьшение
содержания сывороточного С-реактивного белка (8,10+0,50
мг/л).
Известно, что на активность индуцибельной формы NO
синтазы в тканях мощно влияют цитокины, продуцируемые
при воспалении. Гиперпродукция NO приводит к
ншрооксвдативному стрессу и, как следствие, к деструкции
биомакромолекул и клеточных мембран, что еще в большей
степени стимулирует воспалите.гьные реакции. С другой
стороны, развитие воспаления детерминируется генерацией
оксида азота, синтезируемого с участием iNOS, поскольку
последняя
способна
контролировать
биосинтез
интерлейкинов,
относящихся
к
ингибиторам
воспалительной реакции (например, ИЛ-4). Поэтому
целесообразно было исследовать как ингибиторы синтазы
оксида
азота
влияют
на
продукцию
про-
и
антивоспалительных цитокинов при пародонтите на фоне
диабета.
Как видно из рисунка 3, при применении N-нитро- L-
аргинина концентрация провоспалительного ФНО-а
существенно (в 1,8 раза, Р <0,05) уменьшалась по срав-
нению с некорригированной животными, достигая уровня
158,2+20,04 пг/мл. Введение аминогуанидина в течении 14-
и суток привело к еще большему (в 2,3 раза, Р <0,05)
снижению уровня ФНО-а в сыворотке крови крыс с
сочетанной патологией. Этот показатель у данной группы
животных составлял 125,5+8,4 пг/мл.
Уровень провоспалительного ИЛ-10, который резко
возрастал у крыс с пародонтитом и диабетом, также
снижался достоверно как под влиянием неспецифического,
так и специфического ингибитора NO синтазы.
чем у животных, которым препарат не вводили. При
использовании с целью коррекции N-нитро-Е-аргинина
уровень сиаловых кислот в сыворотке крыс с пародон-
титом на фоне диабета составлял 8,54+0,62 ммоль/л
Рис. 2. Содержание свободного оксипролина (мкмоль/л), гликозаминогликанов (х!0 мкмоль/л), сиаловых
кислот (ммоль/л) и С-реактивного белка (мг/л) в сыворотке крови крыс с липополисахаридным пародонтитом
на фоне сахарного диабета при применении N-нитро-L-аргинина и аминогуанидина
<Оестниқврача, Самарканд
2013, № 3
97
Так, у животных, которым вводили М-нигро-Ь-аргинин
содержание ИЛ-10 составило 55,6±8,50 пг/мл, а у живо-
тных, которым вводили аминогуанидин - 42,4+8,20 пг/мл,
что было соответственно ниже соответствующих
показателей у нелеченных крыс в 1,9 и 2,4 раза (Р <0,05 в
обоих случаях). Парадоксально, но при применении
ингибиторов NO синтазы было зарегистрировано также
снижение уровня антивоспалигельных цитокинов в сы-
воротке крыс с сочетанной патологией. В частности,
содержание ИЛ-4 при проведении коррекции N-нитро- L-
аргинином составило 4,50+1,52 пг/мл, а аминогуани-
дином - 4,02+1,46 пг/мл, то есть было меньше, чем в
некорригированных животных, в 1,4 и 1,6 раза.
Концентрация ИЛ-10 в сыворотке крыс с па-
родонтитом и диабетом, которым вводили N- нитро-Ь-
аргинин, составляла 3,20+0,80 пг/мл, а у животных,
которым вводили аминогуанидин - 2,50+0,74 пг/мл, то
есть, как и в случае с ИЛ-4, также снижалась по
сравнению с животными, которым препараты не вводили
(в 1,4 и 1,8 раза соответственно). Однако, несмотря на
такое значительное уменьшение содержания антивоспа-
лительных цитокинов под влиянием исследуемых
препаратов, при статистических расчетах
Таким образом, М-нитро-Ь-аргинин и амино-
гуанидин достоверно снижают продукцию про-
воспалительных цитокинов при липополисахаридном
пародонтите на фоне сахарного диабета, а также
вызывают
тенденцию
к
снижению
уровня
антивоспалительных интерлейкинов.
Заключение.
Селективное
ингибирование
индуцибельной формы NO синтазы при пародонтите,
развивающимся на фоне сахарного диабета, может быть
перспективным методом лечения больных с такой
сочетанной патологией.
изменения оказались недостоверными.
Литература
1.
Noack В., Fischer S. Metabolic diseases and periodontitis // Dtsch. Med. Wochenschr. - 2012. - 137, N 22. -P. 1155-1157.
2.
Amano A., InabaH. Cardiovascular diseases and periodontal diseases // Clin. Calcium. - 2012. -22, № 1. - P. 43-48.
3.
Herring M.E., Shah S.K. Periodontal disease and control of diabetes mellitus // J. Am. Osteopath. Assoc. - 2006. - 106, N 7. - P. 416-
421.
4.
Nagata T. Relationhip between diabetes and periodontal disease // Clin. Calcium. — 2009. - 19, N 9. - P. 1291-1298.
5.
Alves C., Andion J., BrandSo M., Menezes R. Pathogenic aspects of the periodontal disease associated to diabetes mellitus /7 Arq.
Bras. Endocrinol. Metabol. -2007. - 51(7).-P. 1050-7.
6.
Chdvarry N.G., Vettore M.V., Sansone C„ Sheiham A. The relationship between diabetes mellitus and destructive periodontal disease:
a meta-analysis // Oral. Health. Prev. Dent. - 2009. - 7(2). - P. 107-27.
7.
7. Foia L., Toma V., Ungureanu D., Aanei C., Costuleanu M. Relationship diabetes mellitus-periodontal disease: etiology and risk
factors // Rev. Med. Chin Soc. Med. Nat. Iasi. - 2007. - 111(3). - P. 748-53.
8.
Колодницька Г.Б., Корда M.M. Перебш лшополгсахаридиого запалення ясен при шсулшозалежному цукровому шабет! //
Медичнах1\пя.-2011. -13, № 3. - С. 91-91.
9.
Stuehr D, Kwon NS, Nathan C, Griffiths О. N-Hydroxy-L-arginine is an intermediate in the biosynthesis of nitric oxide from L-
arginine//J. Biol. Chem. - 1991.-266. - P. 6259-6263.
10.
Ridnour L., Sim J.E., Hayward M., Wink D., Martin S. A spectrophotometric method for the direct detection and quantitation of nitric
oxide, nitrite, and nitrate in cell culture media // Anal. Biochem. - 2000. - 281. - P. 223-229.
11.
Шараев П.Н., Пишков B.H., Соловьева Н.И., Широкова Т.Ю., Соловьева Т.В., Зворыгина Н.Г., Соловьев А.А., Алексеева
Н.К. Метод определения гликозаминогликанов в биологических жидкостях // Лаб. дело. — 1987. - № 5. - С. 330-332.
12.
Тетянец С.С. Метод определения свободного оксипролина в сыворотке крови
И
Лаб. дело. - 1985. - № 1. - С. 61-62.
13.
Колб В. Г. Клиническая Биохимия / Колб В. Г., Камышников В. С. - Минск : Ураджай, 1976. - 145 с.
Рис. 3. Содержание цитокинов (ФНО-а и ИЛ-10: х10 пг/мл; ИЛ-4 и ИЛ-10: пг/мл) в сыворотке крови крыс с
ЛПС-пародонтитом на фоне сахарного диабета при применении 1Ч-нитро-Ь-аргинина и аминогуанидина
