66
инфекций человека» НИИ ЭМИЗ МЗ РУз.
Бактериальные взвеси в концентрации 10
9
микробных тел/мл, инактивировали прогревани-
ем при +80
0
С в течение 30 минут. Этот режим
температуры позволяет сохранить структуру бел-
ков, обеззаразить использованную нами бактери-
альную взвесь.
Антигены получали по Буавену - комплекс-
ный микробный антиген (Boivin A., Mesroblanu
I., 1935), путем экстракции гретой суточной
культуры микроорганизмов трихлоруксусной
кислотой. Данный подход относится к группе
химических методов экстракции антигена.
Результаты учитывали спектрофотометриче-
ски при длине волны 492 нм на иммунофермент-
ном планшетном анализаторе «Stat Fax-
300» (США).
Результаты и обсуждение.
Полученные ра-
нее авторами [3] результаты показывают, что для
нагружения антигенов применяют забуференный
физиологический раствор (рН 7,2-7,5), натрий-
карбонатный (0,05 моль/л, рН 9,0), боратный
(0,05 мль/л, рН 8,0) и трис-HCl (0,05 моль/л, рН
8,0) буферные растворы. Значения рН и ионная
сила этих буферных растворов могут варьиро-
вать. Продолжительность и условия проведения
инкубации адсорбированного иммунного реаген-
та с тестируемыми субстратами и с реагентами
на разных этапах проведения ИФА подбирали
экспериментально.
В эксперименте применяли буферные среды с
различным значением pH (от 5,0 до 10,0). Усло-
вия сорбции при +4
0
С и +37
0
С. Концентрация
антигена от 0,5 до 20 мкг. По окончании фикса-
ции микробного антигена буфер удаляли путем
промывки 0,01М Na-фосфатным буфером с pH
7,3±0,1 с 0,15М NaCl и 0,1% Твин-20.
В последующем полученные белковые анти-
гены адсорбировались на выбранном нами твер-
дофазном носителе интенсивнее при высоких
значениях активной реакции (рН), когда их заряд
отрицателен и максимален по величине. В то же
время взаимодействия иммунных реагентов на
следующих этапах постановки ИФА оптимальны
при физиологических значениях рН. В ходе экс-
периментальных исследований нами установле-
Современное состояние клинической иммуно-
логии позволяет определить иммунные механиз-
мы формирования и развития многих патологи-
ческих состояний. В этом большая заслуга имму-
нологических лабораторных методов исследова-
ния, среди которых особое место отводится им-
муноферментному анализу (ИФА).
ИФА это метод качественного определения, а
также количественного измерения антигенов в
сыворотке крови [1]. Этот иммунологический
метод был предложен в начале 70-х годов ХХ
века Engvall и Perlmann в Швеции, van Weemen и
Schuur в Нидерландах, Rubenstein с соавторами в
США [2].
Сущность ИФА заключается в специфиче-
ском взаимодействии антитела и антигена с по-
следующим присоединением к полученному
комплексу коньюгата (энзиммеченых антивидо-
вых иммуноглобулинов). Фермент вызывает раз-
ложение хромогенного субстрата с образованием
окрашенного продукта, который выявляется ви-
зуально или фотометрически. Результат выража-
ют в единицах оптической плотности [3].
Существует множество вариантов ИФА, из
которых наибольшее практическое значение по-
лучил гетерогенный твердофазный ИФА (indirect
ELISA). В настоящее время в качестве твердой
фазы часто используют полистироловые 96 лу-
ночные планшеты [4, 5].
Фиксация антигена микроорганизма на лунки
полистироловых планшетов зависит от многих
факторов, в том числе от активной реакции (рН)
буферной среды и свойств сорбционной поверх-
ности носителя.
Целью
настоящего исследования было оцен-
ка влияния физико-химических параметров бу-
ферной среды и твердофазного носителя на сте-
пень фиксации антигена к твердой фазе в экспе-
рименте.
Материалы и методы.
В ходе эксперимента
нами были использованы бактериальные антиге-
ны, полученные из грамположительных кокков,
грамотрицательных бактерий и дрожжеподобных
грибов рода Кандида (таблица). Инактивирован-
ные культуры микроорганизмов получены из
«Национальной коллекции микроорганизмов
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
УДК: 612.128.017.1-078.33
Нуралиев Н.А., ²Рахманова С.С., ³Бектимиров А.М-Т.
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ БУФЕРНОЙ СРЕДЫ И ТВЕРДОФАЗНОГО
НОСИТЕЛЯ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ СОРБЦИЮ АНТИГЕНА В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ
АНАЛИЗЕ
НИИ санитарии, гигиены и профзаболеваний МЗ РУз, ²Ургенчский филиал ТМА, ³НИИ ЭМИЗ МЗ
РУз
67
но, что существенное снижение рН использован-
ной буферной среды во время инкубации нагру-
женных антигеном тест-планшет с иммунными
реагентами привело к его десорбции.
Известно [4], что используемый для создания
тест-системы твердофазный носитель должен:
обладать высокой связывающей способностью
по отношению к иммобилизуемому реагенту;
незначительно десорбировать реагент; иметь
низкий уровень неспецифического связывания и
обладать воспроизводимыми свойствами. Мы
при проведении наших исследований для выбора
твердофазного носителя для создания экспери-
ментальной тест-системы также руководствова-
лись этими критериями.
В зависимости от способа обработки поверх-
ности, применяемые в настоя-
щее время для пассивной ад-
сорбции полистирольные носи-
тели подразделяются на 3 типа:
тип X - зарядовый индекс 1, ха-
рактеристика поверхности непо-
лярная гидрофобная, связыва-
ние IgG среднее; тип Y - зарядо-
вый индекс 12, характеристика
поверхности полярная гидро-
фобная, связывание IgG эффек-
тивное; тип Z, зарядовый индекс
200, характеристика поверхно-
сти полярная гидрофильная,
связывание IgG не эффективное.
В эксперименте проверены
все три типа носителей. Из-за
идентичных показателей типов
X и Y, мы приводим данные носителей только X
и Z. Влияние рН среды на связывание антигенов
с полистиролами X показаны на рисунке 1.
Как видно из рисунка 1 сорбирующая способ-
ность полистирола X, имеющего гидрофобную
поверхность, зависит от рН (оптимальный рН 7,0
-
8,2) и ионной силы раствора.
Для твердого носителя типа Z оптимальные
результаты в эксперименте были получены при
использовании буферного раствора с низкой рН -
5,0 (рисунок 2).
Белковые бактериальные антигены адсорби-
ровали при +4
0
С в течение 14 часов. После свя-
зывания иммунных комплексов на тест-планшете
для предотвращения неспецифического связыва-
ния с фиксированным антигеном других иммун-
Таблица. Культуры микроорганизмов, из которых получали комплексный микробный антиген в экс-
перименте
Штаммы
Морфология
Регистрационный
номер
Источник выделения
Грамположительные кокки
Staphylococcus aureus
Гр «+» кокки
003994/Wood-46
Гемокультура
Staphylococcus aureus
Гр «+» кокки
003702 /14-B
Биликультура
Staphylococcus epidermidis
Гр «+» кокки
003063 \306
Гной
Staphylococcus epidermidis
Гр «+» кокки
004145 /МЗ-87
Слизистая носа
Enterococcus faecalis
Гр «+» кокки
003460/«СВ»
Уринокультура
Грамотрицательные бактерии
Klebsiella pneumoniae
Гр «-» палочки
000691/691
Копрокультура
Pseudomonas aeruginosa
Гр «-» палочки
003778/155
Копрокультура
Escherichia coli
Гр «-» палочки
002673/477
Копрокультура
Дрожжеподобные грибы рода Кандида
Candida albicans
Друза
/7
Слизистая зева
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
17
34
67
134
268
536
1073
2145
4290
pH 5,0
рН 6.0
рН 7.0
рН 8.2
Рисунок 1. Влияние рН на связывание антител
с полистиролом типа X
68
ных реагентов на следующих этапах анализа про-
водили блокировку свободных мест на твердо-
фазном носителе. Применяли различные белки и
не ионные детергенты (1% раствор бычьего сы-
вороточного альбумина, 0,5% раствора желатина,
5% раствор нормальной сыворотки, 0,05-0,5%
растворы тритон Х-100 и Твин-20).
Использованные блокирующие вещества и
иммунные реагенты растворяли в том же буфер-
ном растворе, что и адсорбированный антиген.
Полученные иммунные адсорбенты хранили про-
должительное время (в течение 8 месяцев) при
+4
0
С (в холодильнике) без поте-
ри специфической активности
иммунных реагентов. Их де-
сорбцию предотвращали, внося
блокирующий раствор, который
содержит 0,02% азида натрия.
Поскольку азид натрия является
ингибитором пероксидазы хре-
на, использующиеся в тест-
системах экспериментальные
тест-планшеты перед инкубаци-
ей с иммунным реагентом,
конъюгированным этим фер-
ментом, отмывали буферным
раствором для прекращения
действия азида натрия.
Выводы.
1. Установлено, что
при выборе твердофазного но-
сителя и фиксации на нем анти-
гена нужно учитывать рН бу-
ферных сред и свойства твердофазного носителя,
которые непосредственно влияют на степень ад-
сорбции нагружаемого антигена.
2. Оптимальные результаты по фиксации мик-
робных антигенов в проведенном эксперименте
были получены при использовании отрицательно
заряженного полярного гидрофильного полисти-
рола типа Z, при применении буферного раство-
ра с низкой рН.
3. При использовании неполярного гидрофоб-
ного полистирола оптимальная рН установлена
нами в пределах 7,0-8,2.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
17
34
67
134
268
536
1073
2145
4290
pH 5.0
pH 6.0
pH 7.0
pH 8.2
Рисунок 2. Влияние рН на связывание антител
с полистиролом типа Z
Использованная литература:
1. Егоров А.М., Осипов А.П. Теория и практика иммуноферментного анализа. - Москва, «Высшая школа», 1991.
-
186 с.
2. Колосова А.Ю., Блинцов А.Н., Самсонова Ж.В., Егоров А.М. Разработка твердофазного иммуноферментного
анализа гентамицина в сыворотке крови человека //Антибиотики и химиотерапия. - Москва, 1998. - №2. - С.9-13.
3. Павлов С.Б. Иммуноферментный анализ. Интерпретация результатов //Клиническая антибиотикотерапия. -
Москва, 2000. - №1. - С.16-18.
4. Таранов А.Г. Диагностические тест-системы: радиоиммунный и иммуноферментный методы диагностики. -
Новосибирск: Издательство НГУ, 2000. - 260 с.
5. Флуер Ф.С., Прохоров В.Я., Веснина А.Ф., Акатов А.К. Иммуноферментная тест-система для определения
стафилококкового энтеротоксина типа С //Журнал микробиологии. - Москва, 2002. - №6. - С.65-68.
