Доктор ахборотномаси № 4—2018
71
УДК 618.11-008.64-092
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ В ПРОГНОЗИРОВАНИИ ПРЕЖДЕВРЕМЕННОЙ
НЕДОСТАТОЧНОСТИ ЯИЧНИКОВ
Ф.А. Хайдарова, С.С. Фахрутдинова
Республиканский специализированный научно-практический медицинский центр эндокри-
нологии, Ташкент, Узбекистан
Ключевые слова
: преждевременная недостаточность яичников, генетические исследования
Калит сузлар
: тухумдонлар муддатдан аввалги етишмовчилиги, генетик тадкикот
Key words
: premature ovarian failure, genetic research
Установлены достоверные различия по частоте встречаемости гена FSHR rs6166 при преждевременной
недостаточности яичников с генотипом GG versus GA+AA, в сравнении с группой контроля. Наиболее благо-
приятным/проекторным генотипом по FSHR G>A rs6166 является генотип GG, в то время как генотип АА яв-
ляется рисковым. При преждевременной недостаточности яичников ген FSHR rs6165 не имеет достоверных
отличий при сравнении группы пациенток с контролем.
ТУХУМДОНЛАР МУДДАТДАН АВВАЛГИ ЕТИШМОЧИЛИГИНИ ЭРТА БАШОРАТЛАШДА
ГЕНЕТИК БЕЛГИЛАРИ
Ф.А. Хайдарова, С.С. Фахрутдинова
Республика ихтисослаштирилган эндокринология илмий-амалий тиббиѐт маркази, Тошкент, Ўзбекистон
Тухумдонлар муддатдан аввалги етишмовчилигида FSHR rs166 генининг GG ва GA+AA генотипи учра-
ши назорат гуруҳига нисбатан сезиларли фарқлар аниқланди. FSHR G>A rs6166 энг яхши проектор генотип
GG генотипи бўлиб, АА генотипи хавфли ҳисобланади. Тухумдонлар муддатдан аввалги етишмовчилигида
FSHR rd6165 гени назорат гуруҳидаги беморлар билан солиштирганда сезиларли фарелар йўқлиги аниқланди.
GENETIC MARKERS FOR PREDICTION OF PREMATURE
INSUFFICIENCY OF OVARY
F.А. Khaidarova, S.S. Fakhrutdinova
Republican Specialized Scientific and Practical Medical Center of Endocrinology, Tashkent, Uzbekistan
Significant differences were found in the frequency of occurrence of the FSHR rs6166 gene in patients with
premature ovarian failure with the GG versus GA + AA genotype, in comparison with the control group. The most
favorable / projecting genotype for FSHR G> A rs6166 is the GG genotype, while the AA genotype is risky. In case of
premature ovarian failure, the FSHR rs6165 gene does not have significant differences when comparing the group of
patients with the control.
Несмотря на существенный прорыв в сфере изучения процессов старения яичников
остается ряд клинических и теоретических пробелов в фундаментальных знаниях по данно-
му вопросу [2,5]. В 2011 г рабочая группа экспертов из 5 ведущих стран мира (STRAW),
изучающая этапы старения репродуктивной системы, показала необходимость проведения
дополнительных исследований и разработки современных биомаркеров, отражающих ста-
дийность формирования преждевременной недостаточности яичников [11].
В процессе фолликулогенеза большинство фолликулов находится на пути к дегенера-
ции и апоптозу. Только не рекрутированные к данному моменту примордиальные фоллику-
лы составляют истинный тотальный овариальный резерв [1,6] Однако клинико-
лабораторные тесты для его оценки пока не разработаны. Функциональный овариальный
резерв представляет собой пул растущих фолликулов, достигших определенной степени
зрелости [7]. Маркерами его оценки являются возраст женщины, регулярность ритма мен-
струаций, уровни ФСГ, AMT, объем яичников и число в них антральных фолликулов [9]. В
основе патогенеза преждевременной недостаточности яичников (ПНЯ) лежит врожденное
или приобретенное снижение тотального овариального резерва, которое манифестирует в
возрасте до 40 лет. Патогенетической основой ПНЯ является либо генетически детермини-
рованное нарушение процесса фолликулогенеза, либо гибель фолликулов за счет активации
процесса их апоптоза [3,8].
Фолликулогенез рассматривается как постоянный процесс иерархии фолликулов, при
Оригинальная статья
Доктор ахборотномаси № 4—2018
72
Ф.А. Хайдарова, С.С. Фахрутдинова
котором одновременно происходит рост и созревание одних фолликулов и атрезия других.
Отбор фолликулов осуществляется во время ранней фолликулярной фазы на основе диффе-
ренциальной чувствительности фолликулов к гонадотропным гормонам, в первую очередь -
к ФСГ. Это зависит, в частности, от числа рецепторов гонадотропных гормонов на оболоч-
ках фолликулов. Предполагается, что наличие полиморфного варианта гена рецептора фол-
ликулостимулирующего гормона FSHR rs6165 и rs6166 может привести к уменьшению чис-
ла созревающих фолликулов и нарушению оогенеза [4,10].
В ряде работ показано, что с увеличением числа созревших фолликулов при гормо-
нальной стимуляции суперовуляции происходит снижение способности ооцитов к оплодо-
творению [1, 12]. Помимо этого полиморфизм гена rs6165 ген FSHR (THR307ALA) и rs6166
ген FSHR (ASN680SER) ассоциирован с уровнем гонадотроных гормонов [7,9], а также с
овариальным ответом и исследуется с целью оценки реакции рецепторов на стимуляцию
препаратами ФСГ [1,10,12].
Целью исследования
было изучение вклада полиморфизма генов рецепторов фолли-
кулостимулирующего гормона FSHR в процесс развития преждевременной недостаточно-
сти яичников.
Материалы и методы исследования
: согласно поставленным задачам в рамках пи-
лотных исследований РСНПМЦ Эндокринологии МЗ РУз, были проведены биотехнологи-
ческие, биоинформационные работы по разработке ПЦР-набора и последующее генотипи-
рование 83 лиц для изучения генотипического профиля - ген FSHR (rs6165 и rs6166).
Основную группу составили 55 пациенток с ПНЯ (средний возраст 30,1±5,6 года,
средняя продолжительность заболевания 4,9±0,2 года, возраст дебюта заболевания -
29,2±1,1 года. Группу сравнения составили 28 практически здоровых женщин аналогичного
возраста.
Материалом для ДНК служила венозная кровь из локтевой вены, объемом 3-5 мл, для
забора крови использовались вакьютайнеры с антикоагулянтом/консервантом – 15% трика-
лиевым EDTA (Ethylenediamin- tetraacetik Acid).
Было проанализировано, в базе OMIM (omim.org) по фенотипам ―Premature ovarian
failure (POF)” и ―Ovarian dysgenesis (ODG)” 18 генов (FSHR, MCM9, SOHLH1, PSMC3IP,
BMP15, HFM1, FIGLA, FOXL2, MSH5, STAG3, NOBOX, NR5A1, ERCC6, SYCE1, MCM8,
FLJ22792, DIAPH2, FMR1) и 109 аллельных вариантов этих генов.
На этом этапе были выбраны и синтезированы следующие последовательности прай-
меров (табл. 1):
name
test
allele
3'
Seq 5'-3'
lengt
h
melt T
(IDT)
amp
RS6165_F_A
SNP
mut
GCAAGAAGTTGATTATATGACTCAGA
26
61,4
237
RS6165_F_G
SNP
wild
GCAAGAAGTTGATTATATGACTCAGG
26
61,8
RS6165_R
SNP
no
ATGGCCAGGATGCTGATAAAA
21
62,3
RS6166_R
SNP
no
TCAGCTTCCTAATGTATCACATGG
24
62,4
244
RS6166_F_G
SNP
wild
AGCTCCCAGAGTCACCAG
18
62,6
RS6166_F_A
SNP
mut
AGCTCCCAGAGTCACCAA
18
62,4
Таблица 1.
Результаты выбора последовательности праймеров.
Праймеры для проведения ПЦР были синтезированы на синтезаторе ASM-800
“Biosset” стандартным методом в режиме DMT-ON (без снятия последней тритильной за-
щиты) и очищены на RP-картриджах ―Chemgenes”.
Генотипические исследования
:
для типирования полиморфных вариантов изучаемых
генов-кандидатов были использованы методы HRM-qPCR (Stratagene M*3005P, Agilent
Доктор ахборотномаси № 4—2018
73
Technologies, Германия; DT-Prime, Россия) и метод микрочиповой PCR-детекции (MCE 202
MultiNA, Zhimadzu, Япония).
Результаты исследований
:
Нами установлены по гену FSHR rs6166 достоверные раз-
личия по частоте встречаемости в группах пациенток (55 чел.) с недостаточностью яични-
ков с генотипом GG versus GA+AA, в сравнении с группой контроля (28 чел.). Кроме того,
коэффициент OR для генотипов GA+AA составил 11.74, при p<0,01 (табл. 2).
Таблица 3.
Доминантная модель наследования FSHR G>A rs6166.
Таблица 2.
Сравнительный анализ частоты встречаемости FSHR G>A rs6166.
Генотипы
Случаи
Контроли
χ
2
p
OR
n = 55
n = 28
знач.
95% CI
Генотип
G/G
0,018
0,179
7,52 0,02
0,09
0,01 – 0,77
Генотип
G/A
0,964
0,821
5,76
1,04 – 31,89
Генотип
A/A
0,018
0,000
1,57
0,06 – 39,76
Наиболее значимым установлен генотип G/A, OR=5.76 (p<0.02).
Согласно сравнительному анализу можно предполагать, что наиболее благоприятным/
проекторным генотипом по FSHR G>A rs6166 является генотип GG, в то время как генотип
АА является рисковым (табл. 3).
Генотипы
Случаи
Контроли
χ
2
p
OR
n = 55
n = 28
знач.
95% CI
Генотип
G/G
0.018
0.179
7.12 0.008
0.09
0.01 – 0.77
Генотип
G/A+A/A
0.982
0.821
11.74
1.30 – 106.14
По гену FSHR rs6165 достоверных отличий при сравнении группы пациенток с кон-
тролем, выявлено не было, p>0.4.
В целом, для подтверждения генетической ассоциации изученных SNP гена FSHR с
развитием дисфункции
яичников среди лиц узбекской популяции необходимо продолжить
исследования с учетом увеличения общего числа выборки и клинических форма патологи-
ческого состояния.
Выводы
:
Установлены достоверные различия по частоте встречаемости гена FSHR rs6166 при
преждевременной недостаточности яичников с генотипом GG versus GA+AA, в сравнении с
группой контроля. Наиболее благоприятным/проекторным генотипом по FSHR G>A rs6166
является генотип GG, в то время как генотип АА является рисковым
При преждевременной недостаточности яичников ген FSHR rs6165 не имеет достовер-
ных отличий при сравнении группы пациенток с контролем.
Использованная литература:
1. Владимирова И.В. Прогнозирование овариального ответа в программах вспомогательных репродуктив-
ных технологий с использованием молекулярно-генетических маркеров: автореф. дис.... канд. мед.
наук: 14.01.01 - акушерство и гинекология. 2015.
2. Allegra A. The earners of the A/GG/G allelic combination of the c. 2039 A> G and c.-29 G> A FSH receptor
polymorphisms retrieve the highest number of oocytes in IVF/ICSI cycles / Allegra A., Marino A., Raimondo
Оригинальная статья
Доктор ахборотномаси № 4—2018
74
S. [et al.] // Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 2016. C. 1-11.
3. Daelemans, C., Smits, G., De Maertelaer, V., Costagliola, S., Englert, Y., Vassart, G., Delabaere, A. Prediction
of severity of symptoms in iatrogenic ovarian hyperstimulation syndrome by follicle-stimulating hormone re-
ceptor ser(680)asn polymorphism. J. Clin. Endocr. Metab. 89: 6310-6315, 2004.
4. De Leener, A., Caltabiano, G., Erkan, S., Idil, M., Vassart, G., Pardo, L., Costagliola, S.Identification of the
first germline mutation in the extracellular domain of the follitropin receptor responsible for spontaneous ovari-
an hyperstimulation syndrome. Hum. Mutat. 29: 91-98, 2008.
5. De Leener, A., Montanelli, L., Van Durme, J., Chae, H., Smits, G., Vassart, G., Costagliola, S.Presence and
absence of follicle-stimulating hormone receptor mutations provide some insights into spontaneous ovarian
hyperstimulation syndrome physiopathology. J. Clin. Endocr. Metab. 91: 555-562, 2006.
6. Doherty, E., Pakarinen, P., Tiitinen, A., Kiilavuori, A., Huhtaniemi, I., Forrest, S., Aittomaki, K.A novel muta-
tion in the FSH receptor inhibiting signal transduction and causing primary ovarian failure. J. Clin. Endocr.
Metab. 87: 1151-1155, 2002.
7. Fan Q.R., Hendrickson W.A. Structure of human follicle-stimulating hormone in complex with its receptor.
Nature 433: 269-277, 2005.
8. Greb R.R., Grieshaber K., Gromoll J., Sonntag B., Nieschlag, E., Kiesel, L., Simoni, M. A common single nu-
cleotide polymorphism in exon 10 of the human follicle stimulating hormone receptor is a major determinant of
length and hormonal dynamics of the menstrual cycle. J. Clin. Endocr. Metab. 90: 4866-4872, 2005.
9. Kuechler, A., Hauffa, B. P., Koninger, A., Kleinau, G., Albrecht, B., Horsthemke, B., Gromoll, J.An unbal-
anced translocation unmasks a recessive mutation in the follicle-stimulating hormone receptor (FSHR) gene
and causes FSH resistance. Europ. J. Hum. Genet. 18: 656-661, 2010.
10. Radu, A., Pichon, C., Camparo, P., Antoine, M., Allory, Y., Couvelard, A., Fromont, G., Hai, M. T. V.,
Ghinea, N. Expression of follicle-stimulating hormone receptor in tumor blood vessels. New Eng. J. Med. 363:
1621-1630, 2010.
11. Siobán D. Harlow, Pangaja Paramsothy. Menstruation and the Menopausal Transition.// Obstetrics and Gyne-
cology Clinics of North America. 2011. Vol. 38, № 3. PP. 595 – 607.
12. Sun, L., Peng, Y., Sharrow, A. C., Iqbal, J., Zhang, Z., Papachristou, D. J., Zaidi, S., Zhu, L.-L., Yaroslavskiy,
B. B., Zhou, H., Zallone, A., Sairam, M. R., Kumar, T. R., Bo, W., Braun, J., Cardoso-Landa, L., Schaffler, M.
B., Moonga, B. S., Blair, H. C., Zaidi, M. FSH directly regulates bone mass. Cell 125: 247-260, 2006.
Ф.А. Хайдарова, С.С. Фахрутдинова
