Лабораторная диагностика заболеваний пневмококковой этиологии

Биология ва тиббиёт муаммолари, 2016, №4 (91) 169

УДК: 616-022.1-0.33

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ЗАБОЛЕВАНИЙ ПНЕВМОКОККОВОЙ ЭТИОЛОГИИ

Г.Т. МАХКАМОВА, Э.А. ШАМАНСУРОВА

Ташкентский педиатрический медицинский институт, Республика Узбекистан, г. Ташкент

ПНЕВМОКОКК ЭТИОЛОГИЯЛИ КАСАЛЛИКЛАРНИ ЛАБОРАТОР ДИАГНОСТИКАСИ

Г.Т. МАХКАМОВА, Э.А. ШАМАНСУРОВА

Тошкент педиатрия медицина институти, Ўзбекистон Республикаси, Тошкент

LABORATORY DIAGNOSIS OF PNEUMOCOCCAL DISEASES

G.T. MAHKAMOVA, E.A. SHAMANSUROVA

Tashkent Pediatric Medical Institute, Republic of Uzbekistan, Tashkent

По данным ВОЗ пневмококковая инфекция

– самая частая из бактериальных инфекций у че-

ловека – ежегодно приводит к смерти 1,6 миллио-

на человек, в том числе от 0,7 до 1 млн. детей, что

составляет 40% смертности детей первых 5 лет

жизни [1,2,9,11,12,14].

Пневмококки – наиболее частые возбудите-

ли целого ряда болезней органов дыхания: пнев-

монии, бронхита, трахеита, обострений хрониче-

ских обструктивных заболеваний легких (ХОЗЛ),

ЛОР-органов (синусита, острого среднего отита),

а также некоторых опасных инфекций (менинги-

та, перитонита, сепсиса). Большинство этих забо-

леваний требуют госпитализации ввиду их тяже-

лого течения и риска летального исхода [5,6,15].

Streptococcus pneumoniae или пневмококк,

который (согласно «Определителю бактерий Бер-

джи») входит в состав рода Streptococcus (группа

стрептококков ротовой полости), включенного в

17-ю группу «Грамположительные кокки».

На плотных питательных средах растут в

виде мелких, прозрачных, не склонных к слиянию

колоний. На средах с кровью колонии пневмокок-

ков окружены зоной альфа-гемолиза (по класси-

фикации Браун) серовато-зеленого цвета, вслед-

ствие разрушения эритроцитов и превращения

гемоглобина в метгемоглобин. Колонии склонны

к аутолизу, что связано с активностью внутрикле-

точных ферментов.

Капсулы пневмококков являются основным

фактором вирулентности, защищающим микроб

от опсонизации и последующего фагоцитоза. Не-

капсулированные штаммы авирулентны. Среди

других факторов патогенности наибольшее зна-

чение имеет уровень активности гиалуронидазы,

пневмолизина, гемолизина и др.

На выявлении специфического набухания

капсулы

возбудителя

основана

экспресс-

диагностика пневмококков в патологическом ма-

териале с использованием поливалентной иммун-

ной сыворотки (реакция Нейфельда). После нане-

сения поливалентной сыворотки на исследуемый

материал при микроскопии отмечают значитель-

ное увеличение капсулы пневмококков по срав-

нению с контролем.

По капсульному антигену также проводят

типоспецифическую дифференцировку пневмо-

кокков, которых насчитывают не менее 90 серо-

типов. Серотиповой пейзаж возбудителя зависит

от географической области, климатических усло-

вий, возраста больных, вида патологии и со вре-

менем может меняться. Выявление особенностей

циркуляции пневмококков позволяет значительно

снизить заболеваемость пневмококковой инфек-

цией за счет вакцинопрофилактики групп риска

[9,10].

Диагностику пневмококковых менингитов

проводят согласно общей схеме исследования ма-

териала. Идентификацию пневмококков выпол-

няют по следующим тестам:



обнаружение в нативном материале (ди-

плококков, окруженных капсулой;



рост на средах, содержащих кровь с обра-

зованием альфа-гемолиза;



характерная морфология культурального

мазка по Граму;



положительная проба с оптохином;



чувствительность к желчным кислотам;



выявление специфического антигена в ре-

акции латекс-агглютинации (экспресс-метод) [4].

Золотым стандартом микробиологической

диагностики пневмококковой инфекции является

выделение пневмококка из стерильных жидкостей

организма (спинно-мозговая жидкость, кровь) -

при диагностике инвазивных пневмококковых

инфекций и других сред (мокрота, жидкость из

полости среднего уха, задняя стенка носоглотки и

др.) - при неинвазивных заболеваниях.

Для выделения культуры Str. pneumoniae

требуются специальные питательные среды с вы-

соким содержанием аминного азота и нативного

белка животного происхождения (дефибриниро-

ванная кровь, сыворотка животных), pH среды 7,0

– 7,8 и инкубация в атмосфере с повышенным со-

держанием диоксида углерода при температуре

35- 37°С. Идентификация возбудителя проводится

по характерному росту на средах с кровью (нали-

чие a-гемолиза вокруг колоний), положительных

тестов с оптохином и желчными кислотами [4,13].

Скорость получения результатов и чувстви-

тельность бактериологического метода являются

сравнительно невысокими, в связи с чем разраба-

тываются и применяются новые диагностические

Лабораторная диагностика заболеваний пневмококковой этиологии

170 Проблемы биологии и медицины, 2016, №4 (91)

подходы, включая полимеразную цепную реак-

цию (ПЦР) и различные серологические тесты.

Серологическим методом идентификации

пневмококков является реакция набухания капсу-

лы при взаимодействии капсулы микробной клет-

ки со специфической сывороткой, содержащей

поликлональные антикапсулярные антитела (тест

Нейльфида).

Для определения пневмококковых антиге-

нов в крови и ликворе применяется метод латекс

агглютинации, который обладает высокой чув-

ствительностью и специфичностью.

Разработаны методики определения пнев-

мококка в клиническом материале с помощью

ПЦР, основанные на выявлении фрагментов спе-

цифических генов кодирующих ферменты ауто-

лизин (lytA), пневмолизин (ply), поверхностные

белки клеточной стенки (PspA, PsaA) и др.

Высокой чувствительностью и специфично-

стью обладает иммунохромотографический тест

для выявления антигена пневмококка в спинно-

мозговой жидкости и моче[14].

Сравнительная характеристика методов

лабораторной диагностики и особенности ин-

терпретации их результатов.

Микроскопические

исследования используют для выявления пневмо-

кокков в разных видах биологического материала:

мокроте, плевральной жидкости, отделяемом из

уха, придаточных пазух, СМЖ, крови. Диагно-

стическая ценность обнаружения в мазке мокроты

диплококков «сходных с пневмококками» до сих

пор остается дискуссионной.

При наличии роста на чашках проводится

обязательная количественная оценка бактериаль-

ного роста и выделение чистой культуры предпо-

лагаемого возбудителя для дальнейшей иденти-

фикации.

Для определения чувствительности к анти-

биотикам используются несколько методов [7,

15].

Метод серийных разведений в бульоне или

агаре. Принцип метода основан на оценке чув-

ствительности возбудителя к серии последова-

тельных разведений тестируемого антибиотика.

При этом определяется точное значение мини-

мальной подавляющей концентрации (МПК) пре-

парата для микроорганизма. Однако из-за значи-

тельной трудоемкости, метод используется пре-

имущественно в научных лабораториях. Более

широкое применение получил модифицирован-

ный метод серийных разведений, основанный на

использовании пограничных концентраций анти-

биотика, который не дает точного определения

МПК препарата для возбудителя, но позволяет

оценить его принадлежность к чувствительным

(S), промежуточно устойчивым (I) или резистент-

ным (R) штаммам. Большинство готовых наборов

реагентов используют именно этот принцип.

Диско-диффузионный метод – основан на

оценке диаметра зоны подавления роста вокруг

бумажного диска с антибиотиком, наложенного

на растущую на плотной питательной среде куль-

туру исследуемого микроорганизма. Образование

зоны ингибирования роста происходит за счет

диффузии антибактериального препарата из носи-

теля (диска) в питательную среду, при которой

величина диаметра ингибирования роста жестко

связана с величиной МПК. Метод не определяет

точное значение минимальной подавляющей кон-

центрации антибиотика для микроорганизма, а

только позволяет отнести его к одной из катего-

рий чувствительности (S, I, R).

Метод эпсилометрии (Е-тест) – в качестве

носителя используется полоска полимера, пропи-

танная различными концентрациями антибиотика,

с нанесенными на нее значениями таких концен-

траций. Интерпретации результатов выполняют в

соответствии с инструкцией к набору реагентов.

Для обнаружение АГ пневмококка в пробах

биологических жидкостей пациента применяют

методы латекс-агглютинации и ИХА. Чувстви-

тельность и специфичность наборов разных про-

изводителей составляет 94–100% и 85–98%, соот-

ветственно. Для обнаружения специфических ге-

нетических фрагментов пневмококка применяют

ПЦР, в качестве мишеней используют специфи-

ческие фрагменты генов, кодирующих факторы

патогенности: пневмолизин (Ply), аутолизин

(LytA), пневмококковый поверхностный АГ

(PsaA), пневмококковый поверхностный протеин

А (PspA), марганец-зависимая супероксид-

дисмутаза (sodA), поверхностный пенициллин-

связывающий белок 2b (Pbp2b), Spn9802,

Spn9828. Для повышения специфичности иссле-

дования применяется мультиплексная ПЦР, при

которой проводится одновременная индикация

нескольких генов патогена с сохранением высо-

кой чувствительности реакции.

Остается проблемой установление диагно-

стически значимых количественных показателей,

позволяющих дифференцировать заболевание от

носительства при исследовании материала из не-

стерильных локусов.

Метод исследования продуктов АНК при

мультилокусном

секвенировании-типировании

для генетического типирования пневмококков

основан на секвенировании внутренних фрагмен-

тов семи генов «домашнего хозяйства»

(housekeeping genes), специфичных для возбуди-

теля. Метод чаще используется для генетического

типирования пневмококка, чем для идентифика-

ции.

Обнаружение АТ редко используются при

проведении лабораторной диагностики пневмо-

кокковой инфекции. Это связано с отсутствием

надежных доступных методик, имеющих доста-

Г.Т. Махкамова, Э.А. Шамансурова

Биология ва тиббиёт муаммолари, 2016, №4 (91) 171

точную чувствительность и специфичность и ро-

лью временного фактора, поскольку для выявле-

ния роста титров АТ необходимо значительное

время от начала заболевания. В настоящий мо-

мент используются определения АТ против четы-

рех АГ пневмококка (С-антигена, капсульных по-

лисахаридов, фосфорилхолина и пневмолизина).

Чувствительность метода для С-антигена и кап-

сульных полисахаридов составляет 89% и 97%

соответственно. Наиболее распространенные ме-

тоды определения – ИФА и РИФ (МФА). При

применении МФА в качестве АГ рекомендуется

использовать аутоштамм пневмококка, выделен-

ный от данного больного. В случае отсутствия

аутоштамма применяют смесь штаммов из наибо-

лее часто встречающихся на данной территории

серотипов.

Таким образом, диагностика пневмококко-

вой инфекции является трудоёмкой задачей. Вы-

деление, и особенно, идентификация этого мик-

роорганизма сопряжены со значительными труд-

ностями, связанными с отсутствием тест систем и

препаратов для идентификации и дифференци-

альной диагностики, циркуляцией штаммов, не-

чувствительных к стандартным тестам идентифи-

кации близкородственных видов. Разработка экс-

пресс методов диагностики является насущной

проблемой как микробиологии, так и медицины в

целом.

Литература:

1.

Белошицкий Г. В., Королева И. С., Кошкина

Н. И. Пневмококковые менингиты в Российской

Федерации // Эпидемиология и вакцинопрофи-

лактика. – 2009 - №21. – С. 6-10.

2.

Козлов Р. С. Пневмококки: прошлое, настоя-

щее и будущее. – Смоленск: Смоленская государ-

ственная медицинская академия, 2005. – 128 с.

3.

Козлов Р. С. с соавт. Антибиотикорезистент-

ность

Streptococcus

pneumoniae

в России : резуль-

таты многоцентровых проспективных исследова-

ний ПеГАС-I и ПеГАС-II. // КМАХ. – 2006. – Т.8,

№1. – С. 26-31.

4.

Лабораторная диагностика менингококковой

инфекции и гнойных бактериальных менингитов:

Методические указания.—М.: Федеральный

центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзо-

ра, 2005.—48 с.

5.

Маянский Н. А., Алябьева Н. М., Катосова Л.

К., Гречуха Т. А., Пинелис В. Г., Намазова-

Баранова Л. С. //Вопросы диагностики в педиат-

рии. – 2010. - №6, - С..6-10

6.

Мельникова А. А., Королева И. С., Белошиц-

кий Г. В. Актуальные проблемы пневмококковой

инфекции. // Ремедиум. - 2009. – С.15-19.

7.

Практические рекомендации «Выделение,

идентификация и определение чувствительности

к антибиотикам Streptococcus pneumoniae» под

редакцией Л. С. Страчунского // Клиническая

микробиология и антимикробная химиотерапия –

2000 – том 2 - №1 – С. 88 – 98

8.

Рекомендации расширенного заседания Сове-

та экспертов на тему «Бремя пневмококковых за-

болеваний в России». - ВСП, 2009. - Т.8. - №2. –

С. 23

9.

Сидоренко С. В., Лобзин Ю. В., Харит С. М.,

Королева И. С., Таточенко В. К. Пневмококковая

инфекция и современные возможности ее профи-

лактики – эпидемиологический обзор ситуации в

мире и в России.// Вопросы современной терапии.

– 2010. - Т.9 - №1 – С. 54 – 61

10.

Учайкин В. Ф., Шамшева О. В., Пневмокок-

ковая инфекция. Руководство по клинической

вакцинологии. - Москва, 2006

11.

Black R. E., Cousens S, Johnson HL et al. Glob-

al, regional and national causes of child mortality in

2008: a systematic analysis. // Lancet 2010. – V.375.

– P. 26-31

12.

Ishiwada N, Kurosaki T, Terashima I, Kohno Y.

The incidence of pediatric invasive pneumococcal

disease in Chiba prefecture, Japan (2003 – 2005) //

Journal of Infection 2008. – V. 359. – P. 254-258

13.

Kaijalanen T, Kharit S. M., Kvetnaya A. S. et al.

Invasive infectious diseases caused by

Neisseria men-

ingitides, Hemophilus influenzae and Streptococcus

pneumoniae

among children in St Petersburg. // Clin

Microbilo Infect 2008. – V. 14. – P. 507-510

14.

Klugman KP, Madhi SA, Albrich WC. Novel

approaches to the identification of

Streptococcus

pneumoniae

as the cause of community-acquired

pneumonia. // Clin Infect Dis. – 2008. – V.47(Suppl

3). – S.202–206.

15.

Reinert RR. The antimicrobial resistance profile of

Streptococcus pneumoniae // Clinical Microbiology

and Infection. – 2009. - V.15(s3). – Р.7-11.